专利名称：血管形成因子及其在治疗心血管疾病中的用途的制作方法
背景技术：
本发明涉及一种通过作用于骨骼、导管机能和渗透性治疗心血管系统及其疾病的方法。更具体地说涉及一种利用生长因子刺激血管细胞增殖，进而刺激内皮细胞生长和血管渗透性来治疗心血管疾病的方法。
心血管疾病一般表现为血液到心脏或其它目标器官的供应受阻。心肌梗塞(MI)，通常称作心脏病突发，是导致死亡的首要因素，因为在心脏病突发后的第一种月内其30％都是致命的。心脏病突发是由于心脏中变窄或堵塞的冠状动脉使心脏得不到所需的营养和氧气所致的。当到心脏的血液供应受到损害时，细胞通过产生诱导新的血管形成的化合物作出反应，从而增加对心脏的血液供应。这些新的血管称作附属血管。诱导新的血管从原有的血管长出的过程称作血管形成，细胞所产生的、诱导血管形成的物质是血管形成因子。
遗憾的是，体内自然的血管形成反应是有限的，且经常是不足的。出于这个原因，血管形成生长因子的发现产生了另一种治疗策略，它通过提供外源的血管形成物质，试图补充自然的血管形成反应。
通过施用各种生长因子刺激血管形成已付出了努力。Cid等的美国专利5,318,957公开了一种通过施用触珠蛋白(具有两个通过二硫键相连的多肽链的糖-蛋白)刺激血管形成的方法。冠状内注射表达人成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)的重组载体(即体内基因转移)于一种动物模式中，导致了心肌血液流动和功能的异常状态的成功改善(Giordano,F.J.等，自然医学2,534-539,1996)。重组腺病毒也已经用于体内表达血管形成生长因子。这些包括酸性成纤维细胞生长因子(Muhlhauser,J.，等，人类基因理论6,1457-1465,1995)，和VEGF形式的一种，VEGF165(Muhlhauser,J.等，循环研究77,1077-1086,1995)。
心肌细胞对受阻的血液供应的反应之一涉及编码血管内皮生长因子(″VEGF″)的基因的活化作用(Banal,S.等，心血管研究28:1176-1179,1994)。VEGF是一个诱导新的附属血管形成的血管形成因子家族。生长因子的GEGF家族是几乎排它性地定向作用于内皮(血管系)细胞的特异性血管形成生长因子(综述见Ferrara等，Endocr.Rev.13:18-32(1992)；Dvorak等，美国病理学杂志146:1029-39(1995)；Thomas，生物化学杂志，271:603-06(1996))。VEGF基因的表达在空间和时间上和生理性的血管形成事件相联系，通过定向基因破坏的方法去除小鼠中的VEGF基因使之因不能形成血管而胚胎性死亡。因此仅有的、已知的血管形成性生长因子似乎作为血管形成的特异性生理调节因子起作用。
在体内，VEGF诱导血管形成(Leung等，科学246:1306-09,1989)，增加血管渗透(Senger等，科学219:983-85,1983)。现在认为VEGF是毛细血管形成的重要生理调节因子。在器官生长，包括胎儿生长中它们参与新的毛细血管的正常形成(Peters等，美国科学院院报90:8915-19,1993)，，组织修复(Brown等，实验医学杂志176:1375-79,1992)，月经周期和怀孕(Jackson等，胎盘15:341-53,1994；Cullinan＆Koos，内分泌学133:829-37,1993；Kamat等，美国病理学杂志146:157-65,1995).在胎儿发育过程中，VEGF好象对血管从血岛的从头合成很关键(Risau＆Flamme，细胞与发育生物学年评11:73-92,1995)，缺少单一VEGF等位基因的胚胎中异常血管的形成和致死性都已证明了这一点(Carmeliet等，自然380:435-38,1996)。再者，VEGF还牵涉到许多疾病中病理性血管的生长特性，包括实性瘤(Potgens等，侯普-塞勒氏生物化学376:57-70,1995)，视网膜病(Miller等，美国病理学杂志145:574-84,1994；Aiello等，N.英国医学杂志331:1480-87,1994；Adamis等，美国眼科杂志118:445-50,1994)，牛皮癣(Detmar等，实验医学杂志180:1141-46,1994)和风湿性关节炎(Fava等，实验医学杂志180:341-46,1994)。
利用兔慢性肢体缺血模型，通过检测缺血后肢的血流已表明VEGF的重复肌内注射或单一的动脉内大丸药能加强附属血管的形成(Pu等，循环88:208-15,1993；Bauters等，美国生理学杂志267:H1263-71,1994；Takeshita等，循环90[第二部分]，Ⅱ-228-34,1994；Bauters等，血管外科杂志21:314-25,1995；Bauters等，循环91:2802-09,1995；Takeshita等，临床研究杂志93:662-70,1994)。在这个模型中，还证明了VEGF和基础性FGF一起协同作用于改良的缺血症(Asahara等，循环92[增刊2],Ⅱ-365-71,1995)。还报道有VEGF可加速患高空症的鼠颈动脉内皮的修复，然而同时抑制皮下光滑肌肉层的病理性增厚维持腔直径和血流量(Asahara等，循环91:2793-2801,1995)。VEGF还可诱导犬冠状动脉EDRF(内皮来源的释放因子(含氮氧化物))-依赖性地舒张，通过和血管形成无关的次级机制，潜在性地使缺血部位的血流量增加(Ku等，美国生理学杂志265:H586-H592,1993)。
编码VEGF的基因的活化导致几种不同的VEGF变体的产生，它们由不同的剪切形式产生，其中同一种染色体DNA产生包含不同外显子的不同mRNA转录物，从而产生不同的蛋白质。这些变体已被公开，如Tischer等的美国专利5,194,596鉴定了多肽序列长度为121和165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子(即VEGF121和VEGF165)。而且，也已经鉴定和报道了VEGF189和VEGF206(Neufeld,G.等，癌症转移评论15:153-158,1996)。
如
图1所示，外显子1-5编码的结构域含有识别已知VEGF受体KDR/flk-1和flt-1所需的信息(Keyt,B.A.等，生物化学杂志271:5638-5646,1996)，存在于所有已知的变体中。外显子8所编码的氨基酸也存在于所有已知的变体中。可通过存在或缺失VEGF基因中外显子6和7所编码的肽区分变体，这些外显子所编码的肽的存在或缺失导致结构差异，它们被翻译成VEGF形式之间的功能差异(综述见Neufeld,G.等，癌症转移评论15,153-158,1996)。
外显子6在供体剪切位点的72bp后能终止，其中它为含有该外显子的VEGF形式，如VEGF189之类的提供24个氨基酸。这种外显子6形式称作外显子6a。然而，VEGFRNA可利用位于第一碱基下游第51bp处的另一剪切位点，在外显子6的3’末端进行剪切，产生一种较大的含有41个氨基酸的外显子6产物。该外显子6产物由于不同的剪切而多出的17氨基酸此处称作外显子6b。VEGF206含有加长的、包括6a和6b的外显子6，但该VEGF形式比VEGF189更为少见。(Tischer,E.等，生物化学杂志266,11947-11954；Houck,K.A.等，分子内分泌学12,1806-1814,1991)。
已经利用PCR发现了人内皮中的可推断的VEGF第五种形式，作者声称VEGF146剪切变体的cDNA序列表明它含有外显子1-5,6和8。然而，还不确定作者是否发现该剪切变体含有如VEGF206中的外显子6a和6b,VEGF189中的外显子6a，还是外显子6b。作者声称既然该剪切变体保留有外显子6，象其它含有该外显子的家族成员一样，在细胞中有所保留是可能的(Charnock-Jones等，生殖生物学48,1120-1128,1993)。还参见Bacic M等，生长因子12,11-15,1995)。该形式的生物活性还没有得到确定(Cheung,C,Y.等，美国妇产科杂志，173,753-759,1995；Anthony,F.W.等，胎盘15,557-561,1994)。不同的变体及编码这些变体的外显子，在图1中有所描述。
由VEGF基因八个外显子的不同剪切产生的四种已知VEGF形式(VEGF121，外显子1-5,8；VEGF165，外显子1-5,7,8；VEGF189，外显子1-5,6a,7,8；VEGF206，外显子1-5,6a,6b,7,8(外显子6a和6b指同一种外显子的两种不同剪切形式))(Houck等，分子与内分泌学，5:1806-14(1991))。所有VEGF基因都编码指示蛋白质进入分泌途径的信号肽。例如，VEGF165 cDNA编码一种191-残基氨基酸序列，它包含有一种随着蛋白质从细胞的分泌而被切除的26-残基分泌信号肽序列，和165-残基成熟蛋白质亚基。然而，研究发现培养的细胞仅分泌VEGF121和VEGF165，而VEGF189和VEGF206仍和产生细胞相联系。这些VEGF形式有一种额外的、由外显子6编码的高度碱性序列，对应于VEGF189的残基115-139和VEGF206的残基115-156。这些额外序列赋予了它对肝素的高亲和力及与细胞外基质相结合的能力(基质-靶序列)(Houck,K.A.等，生物化学杂志267:26031-37(1992)和Thomas，生物化学杂志271:603-06(1996))。根据几个研究组的结果，VEGF121和VEGF165的致有丝分裂活性是相似的(Neufeld,G.等，癌症转移评论15:153-158(1996))，虽然有一种研究组提供的证据表明VEGF121明显活性较低(Keyt,B.A.等，生物化学杂志271:7788-7795(1996))。由于不可能得到它们的纯化形式用于定量检测，尚不清楚两个较长的VEGF形式，VEGF189和VEGF206，是与两个较短的形式活性相同，还是活性较低。这种失败部分地由于受来源于外显子-6的序列和来源于外显子-7的序列组的协同作用的存在影响它们和产生细胞及细胞外基质的密切联系(Neufeld,G.等，癌症转移评论15:153-158(1996))。
如此处更详细的描述，已经得以鉴定的每种VEGF剪切变体，从心血管疾病的治疗中其刺激内皮细胞的血管形成方面说都有以下一种或多个不利因素(ⅰ)不能和细胞外基质(ECM)结合，引起其更快地清除和更短的活性期，(ⅱ)不能分泌到介质中(即仍和细胞相结合)，因此不能到达和作用于内皮细胞，及(ⅲ)对氧化损伤敏感，导致更短的半寿期。
相应的，需要一种新形式的能避免上述不利因素的VEGF，能有用地应用于刺激心血管疾病患者血管形成的新形式的VEGF最为迫切。发明概要本发明涉及一种新的VEGF蛋白质产物，和编码该新蛋白质产物的核酸(其包含VEGF基因的外显子1-6和8)，及其在通过作用于骨骼、导管机能和渗透性治疗心血管系统及其疾病中的用途。已经发现VEGF145是血管内皮细胞的活性促分裂原，在体内作为血管形成因子起作用。就细胞分布、对氧化损伤的敏感性及细胞外基质(ECM)结合活性而言，VEGF145和以前鉴定过的VEGF物种相比更为可取。以前有关不同VEGF变体的结合亲和力的研究发现缺少外显子6的VEGF165和肝素的结合相对较弱，并且和细胞外基质发生非常微弱的结合(Park,J.E.等，分子与细胞生物学4:1317-1326(1993)。和VEGF165一样与肝素微弱结合的VEGF145，能比VEGF165更好地和细胞外基质结合。然而，与VEGF189不同，VEGF145由产生细胞分泌，有效地和ECM结合。这些特性的组合致使VEGF145成为仅有的已知能从产生细胞分泌且同时保留有细胞外基质结合特性的VEGF变体。因此，它很可能扩散到靶血管，而一些产生的VEGF145在扩散途径中就会为细胞外基质成分所保留。这一ECM结合库将缓慢地释放，使其保持长期的活性。而且，VEGF145不象VEGF121之类的VEGF形式，它的生物活性可免受氧化损伤，因而它有更长的半寿期。
总之，VEGF145明显具有一组独特的使它和其它VEGF形式相区别的生物特性。VEGF145这组独特的特性使它成为治疗心血管系统及其疾病，以及以导管细胞增殖为特征的其它疾病的更首选的治疗药剂。特别是，其cDNA可用于治疗心血管系统及其疾病的基因治疗。
内皮细胞的增殖，诸如发生在血管形成中的，对于预防囊状血管成形术后的再狭窄也是有用的。囊状血管成形术过程经常损伤排列在血管内壁的内皮细胞。光滑肌细胞经常渗入开放的血管，导致所谓的再狭窄过程中的次级阻塞。位于囊-诱导的损伤区周围的内皮细胞增殖以用单层内皮细胞覆盖血管的腔表面，潜在地修复血管的原始结构。
因此，本发明提供了一种治疗哺乳动物心血管疾病的方法，该方法包括用编码VEGF145的多核苷酸转染上述哺乳动物的细胞。在一个优选的方面，将多核苷酸克隆到一种载体上。在进一步优选的方面，该载体是腺病毒载体。腺病毒载体可通过注射运送到哺乳动物，优选的是，注射中运送约1010到约1013个腺病毒载体微粒。更好的是，注射中运送约1012个腺病毒载体微粒。
在进一步优选的方面，将编码VEGF145的多核苷酸运送到哺乳动物的心脏。优选的是根据PCT/US96/02631中阐述的方法，多核苷酸通过冠状注射运送到一个或两个动脉中。该方法于1996年9月6日以WO96/26742发表，本文一并参考。优选的是，冠内注射采用扎入左、右冠状动脉腔约1cm进行的。
在本发明的其它的优选方面，哺乳动物的细胞在体内被转染。其它的优选方面是，被转染的细胞来自体内。
在本发明的其它的优选方面，多核苷酸可通过导管引入哺乳动物。
本发明的一个实施方案中，编码VEGF145的多核苷酸含有如序列表中SEQ ID No.1所限定的碱基序列。在优选的实施方案中，编码VEGF146的多核苷酸存在于一种表达载体中。因而，在本发明的一个优选方面中，本发明提供了一种含有编码VEGF145物种的多核苷酸的表达载体，该物种选自包含下述物种的组(a)VEGF145(b)VEGF145的生物活性片段；和
(c)VEGF145的生物活性衍化物或其片段，其中在VEGF145的氨基酸序列中或从该序列有一个或多个氨基酸残基被插入、取代或缺失。在优选的方面，所说的多核苷酸编码VEGF145。在更优选的方面，所说的多核苷酸包含如序列表中SEQ ID No.1所限定的碱基序列。
本发明的一个实施方案中，编码VEGF145的多核苷酸存在于腺病毒表达载体中，因此，在优选的方面，多核苷酸侧翼有腺病毒序列。在其它优选的方面，多核苷酸序列在其5’末端可操作地连接到在血管内皮细胞中有活性的启动子序列上。在优选的表达载体中，表达载体还含有一种缺失了EIA/EIB基因的部分腺病毒序列。
在本发明中提供的还有用于冠内注射表达VEGF145的重组载体的试剂盒，该试剂盒包含-克隆进适合体内表达它的载体上的编码VEGF145的多核苷酸，-所说载体的合适容器，和-将所说的载体注射进患者的说明书。在更为优选的方面，所说的多核苷酸被克隆进腺病毒表达载体。
在本发明的其它优选的实施方案中，本发明的方法、组合物和载体可用于治疗哺乳动物心血管疾病，包括对哺乳动物施用治疗有效量的上述VEGF145以刺激血管形成的步骤。其它的优选实施方案中，本发明的方法、组合物和载体可用于治疗哺乳动物的血管疾病，包括对哺乳动物施用治疗有效量的上述VEGF145以刺激血管细胞增殖的步骤。本发明还有的其它优选实施方案中，本发明的方法、组合物和载体可用于增加患病血管的内皮化，包括对哺乳动物施用治疗有效量的上述VEGF145的步骤。优选的是，内皮化包括血管成形术后的再内皮化，以减弱或预防再狭窄。本领域技术人员会意识到根据本发明的方法，受治疗的患者可以是用或没有用移植片固定膜治疗的。
在本发明的其它优选实施方案中，本发明的方法、组合物和载体可用于增强肿瘤对药物的渗透，包括对患者施用编码VEGF145的核酸分子。VEGF145可直接运送到肿瘤细胞，或者运送到血管系统，优选的是在靠近肿瘤部位的地方。因此，和消除或减小肿瘤大小的化疗相联系的VEGF145的运送，通过增强肿瘤对药物的渗透有助于加强化疗的效果。可通过直接运送多核苷酸或蛋白质运送该方法中的VEGF145，也可通过基因治疗。
本发明另一个实施方案提供了一种治疗组合物，该组合物包含药学上可接受的载体和刺激血管细胞增殖有效量的VEGF145。
在本发明的其它优选实施方案中，本发明提供了一种过滤了的可注射的腺病毒载体制剂，该制剂包含重组腺病毒载体，该载体不包含野生型病毒，而包含-一种已缺失E1A/E1B基因的部分腺病毒序列，和-一种由侧翼有部分腺病毒序列的启动子驱动的、编码VEGF145的转基因，和-一种药物学上可接受的载体。
在其它优选的方面，本发明提供了一种包含编码VEGF145的多核苷酸的重组质粒。在其它优选的方面，本发明提供了一种用所说的重组质粒转化的微生物。
参照本发明以下的详细描述、附图和所附的权利要求，对本发明的以上和其它目的、优点和特征此后会更清楚，也会对本发明的性质有更清楚的理解。附图简要描述图1是编码不同VEGF异型的外显子的图解。
图2是VEGF145cDNA蛋白编码区的核苷酸序列[SEQ ID No1]。划线部分是编码从成熟蛋白质中切除的分泌信号序列的序列。
图3是成熟VEGF145单体的氨基酸蛋白质序列[SEQ ID No.2]。
图4是说明还原的或非还原的重组VEGF145的表达及与VEGF165比较的照片。VEGF145和VEGF165在受编码VEGF145和VEGF165的重组棒状病毒感染的Sf9昆虫细胞中产生。收集含有重组VEGF的条件培养物，10μl等分试样用0.1M二硫苏糖醇还原(组A)或不还原(组B)。蛋白质由SDS-PAGE(12％凝胶)分离，并且由电印迹转移至硝酸纤维素膜。滤膜在室温下用包含10mM tris/HCl(pH7),0.15M NaCl,0.1％Tween20(TBST)且补充有10％低脂牛奶的缓冲液封闭1小时。滤膜在室温下TBST(23)中用兔抗VEGF多克隆抗体温育2小时，用TBST洗3次，再在室温下用抗兔IgG过氧化物酶联抗体温育1小时。利用电化发光检测系统观察结合的抗体。
图5是显示VEGF145mRNA结合的照片，如在分析从来自于雌性生殖系统(HeLa和A431细胞)的双-癌细胞系中提取的mRNA的反向PCR典型实验中所见。HeLa和A431细胞的总RNA被翻译成为eDNA，并且按照材料和方法中的描述，利用同位素活性标记的核苷酸通过PCR扩增。包含VEGF121cDNA,VEGF165cDNA和VEGF145重组cDNA的质粒在利用材料和方法中所述的引物进行的单独PCR反应中包括。所示的是凝胶的放射自显影图。
图6是描述显示重组体VEGF145对脉管内皮细胞促有丝分裂的实验的图表。VEGF145刺激内皮细胞的增殖HUVEC细胞植于24孔板(20,000个细胞/孔)中，VEGF121(◇)、VEGF145(■)和VEGF165()的增加的浓度按照材料和方法中的描述每隔一天增加一次。4天之后在Coulter计数器中计算细胞个数。
图7是显示VEGF145和在脉管内皮细胞上发现的KDR/flk-1VEGF受体结合，而不和两个VEGF165特异性VEGF受体结合的实验照片。VEGF145对125I-VEGF165和内皮细胞结合的影响。125I-VEGF165(10毫微克/ml)和汇合的HUVEC细胞结合，所说的HUVEC细胞于4℃，在5cm盘中在1μg/ml肝素和以下浓度的VEGF145(μg/ml)存在的条件下生长2小时泳道1,0；泳道2,0.05；泳道3,0.1；泳道4,0.25；泳道5,0.5；泳道6,1；泳道7,2；泳道8,3。泳道9接受2mg/ml的VEGF121。其后利用DSS将结合态的125I-VEGF165与细胞交联，并且通过放射自显影观察交联复合物。
图8描述了两个显示VEGF145与牛角膜内皮细胞产生的ECM相结合，但VEGF165不结合的实验。
a．增加VEGF145(■)或VEGF165()的浓度，将ECM-涂布的96孔盘温育。利用材料和方法中所述的M-35抗-VEGF单克隆抗体对ECM-结合态VEGF进行定量。
b．125I-VEGF145(泳道1和2,30毫微克/ml)或者125I-VEGF165(泳道3,50毫微克/ml)和涂布ECM的孔结合。在泳道2上肝素(10μg/ml)和VEGF一起加入。结合和尔后结合态生长因子的抽提如材料和方法中所述。提取出来的生长因子进行SDS-PAGE(12％凝胶)电泳，其后放射自显影。
c．用于组B中所示实验的125I-VEGF145在12％SDS-PAGE凝胶上于还原条件下层析，其后放射自显影。
图9是描述显示肝素酶消化由牛角膜皮细胞产生的ECM对VEGF145和bFGF与ECM结合影响的实验。
a．肝素和肝素酶对生长因子结合的影响涂布有ECM的孔在含有或不含有0.1U/ml肝素酶-Ⅱ的结合缓冲液中于37℃下温育2小时。其后，于含或不含10μg/ml肝素的孔中加入125I-VEGF145(40毫微克/ml)或125I-bFGF(114毫微克/ml)。25℃温育3小时后，洗涤孔，通过于37℃消化肝素15分钟后分离ECM-结合的碘化生长因子。通过γ-计数器确定结合态生长因子的量(对于125I-VEGF145和125I-bFGF的100％结合分别为15,000CPM/孔和25,000CPM/孔)。
b．肝素和肝素酶-Ⅱ对结合态生长因子从ECM上释放的影响。如上所述，125I-VEGF145或125I-bFGF和涂有ECM的孔结合。洗涤孔，在只含有10μg/ml肝素或0.1U/ml肝素酶的终体积为50μL的结合缓冲液中再一次温育。25℃下温育12小时后，通过显微镜验证ECM的完整性，取45μL等分试样在γ-计数器中计数。然后往孔中加入NaOH，确定结合态生长因子的量。作和上面组A中所述实验相平行的实验。作组A和B实验的重复实验，差异不超过10％。显示的是平均值。实验重复4次，结果类似。
图10是显示和ECM结合的VEGF145有生物活性的图表。24孔盘的孔涂布有由BCE细胞培养产生的ECM，该细胞在30mM氯酸盐存在的条件下培养。按照说明增加VEGF145(■)或VEGF165的浓度将涂布有ECM的孔温育，如所述的那样充分洗涤。将HUVEC细胞(15,000个细胞/孔)植于涂布有ECM的孔中(在缺乏生长因子的生长培养基中)。细胞经胰蛋白酶处理，并且在三天之后计数。数目表示相同的孔中细胞数目的平均数。
图11是显示包含表达或者不表达VEGF145的细胞的藻酸盐小珠簇的照片。包含VEGF145表达细胞的簇喂以血液。VEGF145在体内刺激血管形成VEGF145血管形成活性可通过藻酸盐分析确定。由MIRB表达载体(MIRB)或者VEGF145表达载体MIRB/VEGF转染的BHK-21细胞的稳定克隆，经胰蛋白酶处理，悬浮于DMEM中至浓度为2.7×107细胞/ml。褐藻酸钠(1.2％,0.66ml)与1.33密耳的细胞悬液混合。通过和80mMCaCl2结合形成1μl直径的小珠。小珠用盐洗3次。为4只小鼠一组中的每只Balb/C小鼠皮下注射400μL包含一种给定细胞类型的包装的小珠。小珠簇在4天后被去除，并照相。在照片中出现血液-富含的区域显示为黑暗区域。发明详述本文使用下列缩写。
BCE 牛角膜内皮细胞bFGF成纤维细胞生长因子
ECM 胞外基质HUVEC 人脐静脉来源的内皮细胞VEGF血管内皮生长因子VEGFxxx含有特定氨基酸数目(xxx)的血管内皮生长因子本发明涉及一种新的VEGF蛋白质产物，和编码该新蛋白质产物的核酸(其包含VEGF145基因的外显子1-6和8(图2))，及其在治疗心血管疾病中的用途。这里所用的“心血管疾病”指由心血管机能不全引起的疾病，包括，但不限于冠状动脉疾病、充血性心力衰竭及外周血管疾病。本发明的方法涉及对哺乳动物患者(优选的是人)的治疗。
VEGF145蛋白形式活性亚基通过二硫桥相连(图3)。VEGF145是血管内皮细胞的活性促分裂原，在体内作为血管形成因子起作用。从细胞分布、对氧化损伤的敏感性及细胞外基质(ECM)结合活性来说，VEGF145和以前鉴定过的VEGF物种相比更为可取。VEGF145由分泌细胞分泌，可以和ECM有效地结合，使得它是唯一的已知具有这两种属性的VEGF变体。
这里所说的“血管内皮细胞生长因子”或“VEGF”指由人VEGF基因编码的血管形成生长因子家族。
“VEGF145”指由VEGF mRNA的不同剪切产生的、含有约145个氨基酸的一种VEGF形式，它含有由VEGF基因的外显子1-5,6a和8编码的肽。术语“VEGF145”还指天然VEGF145核酸或氨基酸序列的衍生物和功能等价物。成熟的VEGF145单体包括图3中所示的氨基酸序列。然而，本文所用的术语VEGF145指成熟形式和包含信号序列的VEGF145的原形式两种，或其衍生物，或功能等价物。VEGF145在几种细胞系(图4)里有表达，通过测定从OC238制备的包含VEGF cDNA外显子5-8的区的序列发现它在OC238卵巢癌细胞中表达。
VEGF145多聚肽或亚基的“衍生物”是具有相似氨基酸序列和某种程度上保留有VEGF145活性的功能等价物。所谓“功能等价物”指衍生物具有能够代替VEGF145活性的活性。当采用本领域技术人员所知的分析方法和/或本文所描述的分析方法测定时，优选的功能等价物保留有VEGF145活性的全水平。优选的功能等价物具有VEGF145活性的1％到10000％的活性，更好的在10％和1000％之间，再好一些的在50％到200％之内。衍生物具有和VEGF145至少50％的序列相似形，优选的70％，更好的90％，再好一些的95％的序列相似形。“序列相似形”指两种不同多肽的氨基酸序列之间观察到的“同源性”，和多肽来源无关。
衍生物保留有某些活性的能力可利用本文所述的和/或利用本领域技术人员所知的用于测定其它变体活性的技术测定。衍生物包括发生在翻译中或翻译后的修饰，例如磷酸化，糖基化，交联，己酰化，蛋白水解，和抗体分子、膜分子或其它配基结合(参见Ferguson等，1988，生物化学年评57:285-320)。
特定类型的衍生物还包括氨基酸的改变，如缺失、取代、添加和氨基酸修饰。“缺失”指相关多肽中一个或多个氨基酸残基的缺失。“添加”指相关多肽中一个或多个氨基酸残基的出现。一种多肽的增加和缺失可以在氨基端，羧基端，和/或中间。氨基酸“修饰”指一种天然发生的氨基酸的改变，以产生一种非天然存在的氨基酸。“取代”指多肽中一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基所取代。衍生物可包含变化的不同组合，该变化包括不止一种变化和多种类型的变化。
虽然一种氨基酸的不同变化依赖于磷酸化，糖基化，内-链连接，四级结构和氨基酸在活性位点或可能变构位点中的作用等因素，通常优选的是取代氨基酸来自被取代氨基酸的同一组。某种程度上说，下列组包括可交换的氨基酸碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；极性中性氨基酸丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和稍小程度的甲硫氨酸；非极性脂肪族氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(然而，由于大小的原因，甘氨酸和丙氨酸相关更近，缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸相关更近)；芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。而且，虽然分在不同的类别中，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸某种程度上看来具有互换性，另外半胱氨酸适合这一组，也可把它分到极性中性氨基酸类别中。
虽然脯氨酸是一种非极性中性氨基酸，但它对构象的影响使它的取代显示出困难。因此，用脯氨酸取代或取代脯氨酸都不可取，除非得到相同或相似的构象结果。如果一个或多个脯氨酸残基被羟脯氨酸(Hyp)取代，便可以得到它的构象赋予特性。
被修饰氨基酸的例子包括如下改变了的中性非极性氨基酸，如式H2N(CH2)nCOOH(其中n为2-6)的氨基酸，肌氨酸(Sar),T-丁基丙氨酸(T-BuAla),T-丁基甘氨酸(T-BuGly),N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)，以及正亮氨酸(Nleu)；改变了的中性芳香族氨基酸如丙基甘氨酸；改变了的极性中性氨基酸如瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(MSG)；改变了的中性非极性氨基酸如环己基丙氨酸(Cha)；改变了的酸性氨基酸如磺基丙氨酸(Cya)；和改变了的碱性氨基酸如鸟氨酸(Orn)。
优选的衍生物有不严重影响VEGF145受体-结合活性的一个或多个氨基酸的改变。在对VEGF145活性不必要的VEGF145多肽序列的区域中，氨基酸被缺失、添加或取代影响其活性的风险较小。在对VEGF145活性所需的区域中，氨基酸的改变较不可取，因为影响VEGF145活性的风险较大。这种改变应该是保守性的改变。例如，序列中一个或多个氨基酸残基可以被另一种具有相同极性、作为功能等价物起作用的氨基酸代替。
对于蛋白质活性来说，保守区域比非保守区域更为重要。利用体外诱变技术或缺失分析和按照本发明所述测定受体活性，可以用常规步骤确定对于受体活性重要的保守和非保守区域。
衍生物可利用常规化学技术和重组核苷酸分子技术生产，对一种特定多核苷酸的修饰可以是很精细的，如通过固-相合成中定点诱变和氨基酸取代，或者是随机的，如对产生多肽的宿主的诱变。包括衍生物在内的多肽可利用Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版(1989)中所述的常规技术得到。例如，Sambrook第15章描述了克隆DNA的定点诱变。
从一个方面说，本发明描述了一种核酸分子或编码VEGF145的多核苷酸的特征。某些情况下有必要富集或纯化这种核酸。参考文献中用于核酸分子的“富集”一词指，在目的细胞或溶液中特定的DNA或RNA序列比正常或患病细胞或该序列得以提取的细胞中构成更高组分(2-5倍)的总DNA或RNA。人们可以通过有选择地减少存在的其它DNA或RNA、有选择地增加特异DNA或RNA序列或这两种结合起来获得这种结果。然而，应该注意富集并不意味着没有其它的DNA或RNA序列存在，只是目的序列的相对含量大大增加。本文的术语“大大”用来指增加的水平对于有这种增加的人是有用的，通常指相对于其它核酸增加约至少2倍，更好的至少5-10倍，甚至更多。该术语也不意味着没有其它来源的DNA或RNA。其它来源DNA可能，例如，包括来自酵母或细菌基因组或克隆载体如PUC19的DNA。该术语和天然发生的事件，如病毒感染或肿瘤类型的生长相区别，后两种过程中一种mRNA的水平相对于其它种类mRNA天然增加。也就是说，该术语仅包括一种人干涉提高所需核酸的比例的情况。
核酸分子可对现有的VEGF核苷酸序列利用，例如寡核苷酸定点诱变修饰，或利用限制酶缺失序列，或如本文所述的进行构建。诱变的常规重组技术如体外定点诱变(Hutchinson等，生物化学杂志253:6551,(1978),Sambrook等，第15章，见上)，TAB衔接物(发玛西亚)的运用，和PCR-定向诱变可用于产生这种突变。也可以利用三酯(triester)方法或自动DNA合成仪合成核酸分子。
本发明还描述了在细胞或有机体中优选的重组DNA载体的特征。含有一种细胞中驱动转录的启动子的载体中，重组DNA载体可含有一种编码VEGF145蛋白质的序列或其功能衍生物。重组DNA载体可含有一种在细胞中有功能的转录启动区和一种在细胞中有功能的转录终止区。那里DNA载体有足够的调控序列，如启动和/或终止区，以使插入的核苷酸在宿主细胞中表达，该载体也称为“表达载体”。
本发明还涉及含有上述核酸分子或重组DNA载体，能表达VEGF145肽的细胞或有机体。该肽从改变了的能表达多肽的细胞中得以纯化。当细胞通过基因操作变得能产生一种正常时不产生或正常时低水平产生的蛋白质时，该细胞称为“改变了的能表达所需多肽的细胞”。本领域技术人员能容易地掌握将基因组DNA、cDNA或合成序列导入真核或原核细胞并表达的步骤。
一种核酸分子，如DNA，如果其包含带有转录和翻译调控信息的核苷酸序列，且该序列“可操作地连接”到编码多肽的核苷酸序列上，则称之“能够表达”多肽。为基因表达所必需的调控区的精确性质随有机体的不同而不同，但是应普遍包括一个启动子区域，在原核生物中，它包括启动子(指导RNA转录启动)，还有转录为RNA时作为合成启动信号的DNA序列。这样的区域正常包括参与转录和翻译启动的那些5’-非编码序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列之类的。
例如，VEGF145的整个编码序列可以和下列一个或多个组合成一种合适的表达载体促使这种表达(1)一个外源启动子序列(2)一个核糖体结合位点(3)一个多聚腺苷酸信号(4)一个分泌信号。5’-非翻译和3’-非翻译序列上可加以修饰，以提高在原核或真核细胞中的表达；或者修改密码子，当它们编码一种相同的氨基酸时该密码子成为选择表达系统中的优选密码子。例如，这种优选密码子的应用在本文一并参考的Grantham等，核酸研究，9:43-74(1981)，和Lathe，分子生物学杂志183:1-12(1985)中有所描述。
如果需要的话，基因组VEGF145蛋白序列的3’非编码区可操作地和编码VEGF145的核酸分子连接。该区域可用在重组DNA载体上作为它的转录终止调控序列，如终止和多聚腺苷酸化。因此，通过保留和编码VEGF的核苷酸天然接近的3’区域，可得到转录终止信号。或者也可以用宿主细胞中有功能的3’区域代替。
一个可操作地连接指调控DNA序列和要表达的DNA序列用这样一种方式使基因序列表达的连接。如果两个DNA序列之间的连接性质不(1)导致编码序列的移码突变(2)妨碍启动子区域指导VEGF145蛋白质基因序列转录的能力，或者(3)妨碍VEGF145蛋白质基因序列被启动子区域序列转录的能力，则两个DNA序列(如一个启动子区序列和一个VEGF145蛋白质序列)可称作可操作地连接。因此，如果一种启动子能影响DNA序列的转录，该启动子区域就可操作地连接到DNA序列上。因此，为了表达VEGF145，由适当的宿主识别的转录和翻译信号是必需的。
本领域技术人员会认识到本发明中的VEGF145蛋白质还可在不同的细胞系统表达，包括原核和真核细胞系统，这些全部在本发明的范围之内。
虽然本发明中的VEGF145蛋白质在原核细胞中的表达非常高效，便于融合蛋白的生产，但这种细胞产生的VEGF145蛋白质不糖基化，因此在体内有较短的半寿期。原核生物最常见的代表是大肠杆菌的各种菌株。然而，也可利用其它的微生物菌株，包括其它细菌菌株。公认的原核宿主包括细菌如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单孢菌、沙门氏菌、沙雷氏菌之类的。原核宿主必须和表达质粒中的复制子和调控序列相容。
在原核系统中，来源于和宿主相容种类的、含有复制位点和调控序列的质粒载体才可使用。适当质粒载体的例子包括pBR322、pUC118、pUC119之类的；适当的噬菌体载体包括γgt10、γgt1之类的；适当的病毒载体包括pMAM-neo、pKRC之类的。优选的，本发明的选择载体具有在选择的宿主细胞中复制的能力。
为了在真核细胞中表达VEGF145多肽或亚基(或其功能等价物)，将VEGF145蛋白质序列可操作地连接到有功能的原核启动子上是必要的。这种启动子可以是组成型，也可以，也是更好的是调控型(即可诱导或去抑制)。组成型启动子的例子包括λ噬菌体的int启动子、pBR325上氯霉素已酰转移酶基因序列的CAT启动子之类的。诱导型原核启动子的例子包括λ噬菌体主要的左和右启动子(PL和PR)，大肠杆菌的trp,recA,λacZ,λacI，和gal启动子，α-淀粉酶(Ulmanen等，细菌杂志162:176-182(1985))和枯草芽孢杆菌的ζ-28-特异性启动子(Gilman等，基因序列32:11-20(1984))，芽孢杆菌噬菌体的启动子(Gryczan,In芽孢杆菌分子生物学，学院出版社，Inc.,NY(1982))，和链霉菌启动子(Ward等，基因与分子遗传学203:468-478(1986)).原核启动子由Glick(因迪菌微生物学杂志1:277-282(1987))；Cenatiempo(生物化学68:505-516(1986))；和Gottesman(遗传学年评18:415-442(1984))进行了综述。
在原核细胞中正确的表达还需要基因编码-序列上游核糖体结合位点的存在。这种核糖体结合位点已被报道，例如Gold等(微生物学年评35:365-404(1981))。例如，通过含有这种调控序列的、合成的寡核苷酸的框架内连接，翻译启动所必需的核糖体结合位点和其它序列可可操作地连接到编码VEGF145的核酸分子上。对于原核细胞中的表达不需要信号肽序列。调控序列、表达载体、转化方法等的选择依赖于用于表达基因的宿主细胞类型。
如此处所用的“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，所有这些名称都包括子代。因此，词语“转化子”或“转化细胞”包括原始的对象细胞和源于它的培养物，和转化子的数目无关。在原核细胞中表达的VEGF145经预测包括带有经预测来自于表达载体的N-端序列的正确启动的VEGF145蛋白肽，和带有由于细菌表达过程中启动甲硫氨酸的无效切除而保留有N-端甲硫氨酸的VEGF145蛋白肽的混合物。因为N-端甲硫氨酸的存在经预测并不影响生物活性，我们认为两种类型的VEGF145肽都在本发明的范围之内。由于微妙的或不慎的突变，所有的子代DNA内容并不完全相同也是可以理解的。然而，如所定义的，突变子代和原始的转化细胞有同样的功能。
优选的原核载体包括能在大肠杆菌(如pBR322,ColEl,pSC101,pACYC184,πVX之类的。这些质粒由Sambrook(参见“分子克隆实验指南”，第二版，Sambrook,Fritsch和Maniatis编，冷泉港实验室(1989)报道过)中表达的质粒。芽孢杆菌质粒包括pC194,pC221,pT127之类的。这些质粒由Gryczan(参见芽孢杆菌分子生物学，学院出版社，NY(1982),pp.307-329)报道过。适当的链霉菌质粒包括pLJ101(Kendall等，细菌杂志169:4177-4183(1987))，和链霉菌噬菌体如φC31(Chater等，参考链霉菌分子生物学第六届国际讨论会Akademiai Kaido,Budapest,Hungary(1986),45-54页)。假单孢杆菌质粒由John等(感染病评论8:693-704(1986))，和Izaki(Jpn.细菌杂志33:729-742(1978))作过综述。
用于本发明表达系统的真核宿主细胞并不严格受限，只要它们适合用于VEGF145的表达。优选的真核宿主包括，例如，酵母、真菌、昆虫细胞、体内或组织培养的哺乳动物细胞。利于用作宿主的哺乳动物细胞包括HeLa细胞，源于成纤维细胞的细胞如VERO或CHO-K1，或源于淋巴的细胞及其衍生细胞。
如Oloisson,B.等，美国科学院院报93:2576-2581(1996)中所述的，本发明中的VEGF145蛋白质也可以在表达Epstein-Barr病毒核抗原1的人胚肾293EBNA细胞之类的人细胞中表达。表达载体通过磷酸钙沉淀法转染细胞，该细胞温育至少48小时。然后如例3所述纯化VEGF145肽。
而且植物细胞也可以用作宿主。可以利用和植物细胞相容的调控序列如烟草花叶病毒35S和19S，蓝曙红合成酶启动子和多聚腺苷酸化信号序列。另一个优选的宿主是昆虫细胞，例如果蝇唾腺。利用昆虫细胞作为宿主，可以利用果蝇乙醇脱氢酶启动子。Rubin，科学240:1453-1459(1988)。
可以利用任何系列的酵母基因序列表达系统，包括编码糖酵解酶的活跃表达基因序列的启动子和终止元件，当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时该酶大量产生。已知的糖酵解基因序列也可以提供非常有效的转录调控信号。酵母由于能进行肽的翻译后修饰，具有很大的优势。现有许多利用能用于在酵母中生产目的蛋白的强启动子序列和高拷贝数目质粒的重组DNA策略。酵母识别克隆的哺乳动物基因序列产物上的引导序列，并分泌含引导序列的肽(即前体-肽)。对于一种哺乳动物宿主，有几个可能的载体系统用于VEGF145肽的表达。
根据宿主性质，可以利用多种不同的转录和翻译调控序列。转录和翻译调控型号可以来自于不同的源，如腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒、猿病毒之类的，它们的调控信号和具有高表达水平的特定基因序列相连。或者，利用来自于哺乳动物表达产物的启动子，如肌动蛋白、胶原、肌球蛋白之类的。可以选择促使抑制或激活的转录启动调控信号，以调控基因序列的表达。有趣的是温度-敏感的或受化学(如代谢物)调控的调控信号，前者通过改变温度就可使表达受到抑制或启动。
VEGF145在真核宿主中的表达需要利用真核调控区。这种区域通常包括足以指导RNA合成启动的启动子区。优选的真核启动子包括，如小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer等，分子应用遗传学杂志1:273-288(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，细胞31:355-365(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，天然(伦敦)290:304-310(1981))；酵母gal4基因序列启动子(Johnston等，美国科学院院报79:6971-6975(1982)；Silver等，美国科学院院报81:5951-5955(1984))。
真核mRNA的翻译从密码子开始，这种密码子编码第一种甲硫氨酸。由于这一原因，更好的是保证真核启动子和编码VEGF145(或者其功能衍生物)的DNA序列之间的连接，不含有任何能编码甲硫氨酸的插入密码子(即AUG)。这种密码子的存在或者导致融合蛋白质一种构象的形成(如果AUG密码子在与VEGF145蛋白质编码序列相同的读框中)，或者读框-变换突变(如果AUG密码子不在与VEGF145蛋白质编码序列相同的读框中)。
一种VEGF145核酸分子和一种可操作连接的启动子可将线形分子形式的非复制型DNA(或RNA)分子导入到受体原核或真核细胞，也可导入更优越的闭合共价环状分子。因为这种分子能够自我复制，基因的表达可能通过导入序列的瞬间表达完成。或者，通过将导入DNA序列整合到宿主染色体上实现其永久表达。
可以使用能将所需基因序列整合进宿主细胞染色体上的载体。染色体上整合有导入DNA的细胞可通过导入一个或多个便于含有表达载体的宿主细胞的筛选的标记得以筛选。该标记可为营养缺陷型宿主提供质子转移，杀生物剂抗性，如抗生素或重金属如铜之类的。可筛选的标记基因序列可直接连接到待表达的DNA基因序列上，也可通过共感染导入同一细胞。为了单链结合蛋白的mRNA最佳合成可能还需要额外的元件。这些元件包括剪切信号和转录启动子、增强子和终止信号。包含这些元件的cDNA表达载体包含Okayama，分子与细胞生物学3:280(1983)所描述的那些。
导入的核酸分子可被包含在能在受体细胞中自主复制的质粒或病毒载体中。多种载体中的任何一种都可用于这个目的。筛选特定质粒或病毒载体的关键因素包括含有载体的受体细胞从不含有载体的受体细胞中识别和筛选的容易程度；在特定宿主中所需载体的拷贝数；和是否需要载体在不同种的宿主细胞之间“穿梭”。
优选的真核质粒包括，如BPV、牛痘病毒、SV40、2-微米环之类的，或它们的衍生物。这些质粒在文献中常见(Botstein等，MiamiWntr.Symp.19:265-274(1982)；Broach，参考″酵母分子生物学生命周期和遗传″，冷泉港实验室，冷泉港，NY,445-470页(1981)；Broach，细胞28:203-204(1982)；Bollon等，血液学与肿瘤学杂志10:39-48(1980)；Maniatis，参考细胞生物学综述，3卷，基因序列表达，学院出版社，NY,563-608页(1980)。
一旦制备包含载体或含有构建体的和核酸分子用以表达，就可以通过不同合适方法中的任何一种，如转化、转染、结合、原生质体融合、电穿孔法、微粒枪技术、脂质体转导、磷酸钙沉淀法、直接微注射法、DEAE-葡萄糖转染法之类的将DNA导入合适的宿主细胞。用质粒DNA转染真核细胞系最有效的方法随给定细胞类型的不同而不同。导入载体后，受体细胞在选择质粒-包含细胞生长的选择性培养基上生长。克隆的基因分子的表达导致VEGF145的生成。这可以发生在转化细胞当时，或诱导这些细胞分化后(例如，通过对成神经细胞瘤细胞之类的施用溴脱氧尿嘧啶)。可以利用不同的温育条件形成本发明中的肽。最好的条件是模拟的生理条件。
可用真核表达载体，如pCEP4转染合适的细胞系得到稳定转染子的产物，在该载体中，VEGF145的编码序列已被克隆到了多克隆位点上。这些表达载体包含一个启动子区，如驱动不同哺乳动物细胞中所需DNA分子高水平转录的人巨细胞病毒(CMV)启动子。另外，这些载体包含用来筛选稳定表达目的DNA分子的细胞的基因。PCEP4载体中可筛选标记编码赋予潮霉素抗性的一种酶，潮霉素是加到培养物中杀死非转染细胞的一种代谢抑制剂。
如上所述，稳定包含转染DNA的细胞通过它们对选择培养基的抗性得以鉴定，通过抗性克隆的扩增即可得到纯细胞系。这些细胞系对VEGF145的表达可以被文献中已知的方法如溶液杂交和Northern印迹分析进行估计。治疗组合物和治疗用途本发明的一种目的是提供适合治疗用途的药物组合物中的VEGF145。因此，一个方面，本发明提供了一种通过施用治疗有效量的、包含VEGF145的药物组合物刺激血管内皮细胞增殖的方法。
“治疗有效量”指在患者中产生所需疗效的化合物的量。例如，对于一种疾病或病症，它是减少该疾病或病症的一个或多个症状到某种程度，和疾病或病症相关或有因果关系的生理或生化参数部分或全部恢复正常的量。当用于治疗处理患者时，它的量预计在0.1mg/kg和100mg/kg之间，更好的少于1mg/kg。化合物的用量依赖于和患者相关的年龄、身高和疾病。
对患者施用本申请中化合物的最佳方式和模式依赖于文献中常见的因素，如特定的疾病或病症、所需的效果和患者类型。该化合物典型地用于治疗人患者，也可以用于治疗其它哺乳动物如其它灵长类，猪、牛、家禽之类的农用动物和运动动物及马、狗、猫之类的宠物的相似或相同的疾病。
优选的，治疗有效量以药物组合物的形式提供。药剂或组合物指给多细胞有机体如人施用的合适形式的试剂或组合物。合适形式部分依赖于用途和用药路径，如口服、经眼服用或通过注射。这种形式应使试剂或组合物到达靶细胞，无论靶细胞存在于多细胞宿主中还是培养物中。例如，注射进血流的药剂或组合物应是可溶的。其它因素在文献中常见，包括毒性和阻碍试剂或组合物发挥作用的形式等考虑因素。
所要求的组合物也可形成药学上可接受的盐(如酸加成盐)和/或其复合物。药学上可接受的盐在所施用的浓度下是非毒性的。这种盐的制备通过改变组合物物理-化学特征的同时不妨碍组合物发挥生理作用而促进药学用途。有用的改变物理特性的例子包含降低熔点以促进经粘摸的施用，及增加可溶性以促进高浓度药物的施用。
药学上可接受的盐包括如那些包含硫酸盐、盐酸盐、磷酸、磺酸盐、氨基磺酸盐、硫酸盐、乙酸盐、柠檬酸、乳酸、酒石酸、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、T-酸盐、环己磺酸盐、环己氨基磺酸盐和奎宁酸盐的酸加成盐。药学上可接受的盐可从如盐酸、硫酸、磷酸、磺酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、T-酸、环己磺酸、环己氨基磺酸以及奎宁酸的酸中获得。这样的盐可以这样制备，例如，通过反应产物的游离酸或者碱形式与其中的盐不可溶的溶剂或者介质或如水的溶剂中一个或多个当量的适当的碱或者酸反应，在真空中或者通过冻结-干燥被除去水，或者通过在合适的离子交换树脂上将一现有盐的离子交换为另一种离子。
载体或赋形剂也可用来有促进组合物的施用。载体和赋形剂的例子包括碳酸钙，磷酸钙，各种食糖如乳糖，葡萄糖，或者蔗糖，或者各种类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙烯乙二醇和生理上可兼容的溶剂。组合物或者药物组合物可以通过包含静脉内、腹膜内、皮下、和肌内、口服、局部或经粘摸的不同途径施用。
所需的的等渗性可利用氯化钠或者如葡萄糖，硼酸，钠酒石酸，丙二醇，多元醇(如)甘露糖醇和山梨醇的其它药学上的可接受试剂，或者其它无机或者有机溶质实现。对包含钠离子的缓冲液而言，氯化钠是特别优选的。
本发明的化合物可配制得适于各种施用方法，包括全身和局部或局限的施用。一般地这些技术和制剂可以在Remington的药物科学，第18版本，Mack出版公司，Easton,PA,1990。同时参见Wang,Y.J和Hanson,M.A.“蛋白质和肽的肠胃外表达稳定性和稳定剂”，肠胃外科学和技术杂志，报告号10,Supp.42:2S(1988)中找到。合适的施用方式可以由医生很好地针对每一个患者确定。
对于全身施用，注射是优选的，例如，肌内、静脉内、腹膜内、皮下、鞘内或者大脑室内注射。对于注射，本发明的化合物表现为液态，优选的是如汉克溶液或林格氏溶液的生理上可兼容的缓冲液。或者，本发明的化合物表现为一般如按USP标准所定义的那样安全地被接受的、一种或多种赋形剂(例如多聚丙二醇)。它们可以，例如，悬浮在惰性油中，合适的有如芝麻，花生，橄榄油之类的植物油，或其它可接受的载体。优选地，它们悬浮在一种含水的载体中，例如，在pH值约为5.6到7.4的等渗缓冲液中。这些组合物可用常规灭菌技术，也可以通过过滤灭菌。组合物可以含有药学上可接受的、为接近生理条件所需的辅助物质，如pH值缓冲试剂。有用的缓冲液包括，例如，乙酸钠/乙酸缓冲液。可以利用“贮存”缓释制剂的形式，以使制剂的治疗有效量经眼注射或递送后在多个小时或多天之中传送到血液中。此外，化合物可以表现为固体形式，在使用前既刻再溶解或悬浮。也包括冻干形式。
涂布有VEGF145蛋白质的可膨胀球状囊导管可用于向靶动脉传送物质。
或者，化合物可以口服施用。对于口服，化合物被制成常规的如囊，片剂，以及滋补品剂量形式。
全身施用也可通过经粘膜或者经眼的手段，或者分子可以口服。对于经粘膜或者经眼的施用，制剂中用了对于屏障合适的能够渗透的渗透剂。这种渗透剂一般地为本领域所知，并且包括，例如对于经粘膜施用的胆汁盐和羧链孢酸衍生物。此外，去污剂可以用来促进渗透。经粘膜施用可以，例如，通过鼻喷射或者利用栓剂。对于口服，分子被制成如囊，片剂，以及液态制剂的常规口服药形式。
如一般为本领域中所知的，对于局部施用，本发明的化合物被制成软膏，药膏，凝胶，或者乳油。
如果需要，上述组合物的溶液可以用如甲基纤维素的一种浓缩剂浓缩。它们可以制备成乳化形式，油包水或水包油型。各种药学上可接受的乳化剂的任何一种都可以使用，包括，例如，阿拉伯胶粉，非离子型表面活性剂(如吐温)，或者离子型表面活性剂如碱聚醚醇硫酸盐或者磺酸盐，例如，曲通。
在本发明中有用的组合物通过按照一般地可接受过程混合各成分来制备。例如，所选择的组分在搅切机或者其它常规装置中简单地混合，以便产生浓缩混合物，然后再通过加水或浓缩剂以及可能需要的调PH的缓冲液或调离子浓度的额外溶质调整到终浓度和粘度。
本发明中，所施用的不同化合物的量由常规步骤确定。一般地，治疗有效量有约1nmole到3μmole之间的分子，优选的，有约1nmole到3μmole之间的分子，依患者的年龄和身材、患者的疾病或病症而定。一般地，是在约0.1到50mg/kg之间的量，优选的，是1到20mg/kg受治动物的量。
为便于医生应用，该组合物以包含一定量VEGF145的剂量单位形式提供。基因治疗VEGF145也可用于基因治疗(Miller的综述，天然357:455-460(1992))。Miller指出研究进展对人类基因治疗产生了已经显示积极推动结果的实践性方法的产生。Mulligan，科学260:926-931(1993)中描述了基因治疗的基础科学。实施例Ⅶ中给出了基因治疗的一个例子，它描述了腺病毒-介导的基因治疗的应用。
另一个实施例中，含有编码VEGF145的的一种表达载体可以插入细胞中，细胞在体外生长，大量输入患者中，另一个例子中，包含可选启动子(例如强启动子)的一个DNA片段转化到包含内VEGF145源的细胞中，这样启动子片段增强外源VEGF145的表达(例如启动子片段转化到细胞中并和内源(基因)直接相连)。
基因治疗可涉及包含编码VEGF145的核苷酸序列的腺病毒载体或编码VEGF145的裸核酸分子的应用。或者，可以注射含有编码VEGF145的裸核酸分子的工程菌。实施例Ⅶ阐明了一种利用腺病毒载体进行血管形成治疗的基因治疗方法。
来源于如反转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺-相关病毒、疱疹病毒、几个RNA病毒或者牛乳头瘤病毒等病毒的表达载体可用来将编码VEGF145的核苷酸序列(如cDNA)传送到靶细胞群。
可用本领域技术人员所熟知的方法构建含有编码序列的重组病毒载体。参见，例如，Nabel,E.G.，循环，91,541-548(1995),Maniatis等，分子克隆；实验指南，冷泉港实验室，N.Y.(1989)和Ausubel等，当前分子生物学记录，格林出版社和Wiley科学交流出版社，N.Y.(1989)中描述的技术。或者，编码蛋白质序列的重组核酸分子可用作裸DNA或存在于重新组成的系统中，如用来传送到靶细胞的脂质体或其它脂类系统(参见，如Felgner等，天然337:387-8,1989)。还有用于人类基因治疗的、直接将质粒DNA转化到细胞的其它几种方法，该方法包括通过将质粒DNA和蛋白质相混合，将DNA定位到细胞的受体上。参见，Miller，天然357:455-60,1992。
最简单的形式，可按照微注射程序简单地往细胞核中注射微量的DNA。Capecchi,hl.R.，细胞22:479-88(1980).。一旦重组基因导入到了细胞中，它们可被细胞的正常转录和翻译的机制识别，就会表达基因产物。也已试用了其它方法，以将DNA导入大量细胞。这些方法包括转染，其中DNA和磷酸钙一起沉淀，通过胞饮作用进入细胞。(Chen,C.and Okayama,H.，分子生物学7:2745-52(1987))；电穿孔法，其中细胞暴露在使膜产生孔的高压脉冲中(Chu,G.等，核酸研究15:1311-26(1987))；脂质转染/脂质体融合，其中DNA涂布在和靶细胞融合的脂质小泡中(Felgner,P.L..等，美国科学院院报84:7413-7(1987))；和利用和小弹丸结合的DNA的微粒轰击法(Yang,N.S.等，科学院院报87:9568-72(1990))。另一种将DNA导入细胞的方法是将DNA和经化学修饰的蛋白质偶联。
也已表明腺病毒蛋白质能够使内体不稳定，增加细胞对DNA的吸收。腺病毒和包含DNA化合物的溶液的混合，或DNA利用蛋白交联剂和与腺病毒共价结合的多熔素(polylysine)的结合大大提高了重组基因的吸收和表达。Curiel,D.T.等，动物呼吸细胞生物学与分子生物学杂志，6:247-52(1992)。
可以利用如用于血管成形术中的球状囊导管，其中球状囊如Riessen,R.，人类基因治疗4,749-758(1993)所述涂布有VEGF145DNA或载体，本文一并参考。
本文所用的“基因转移”指将外源核酸分子导入细胞的过程。为了促使编码特定产物的表达，通常进行基因转移。产物可能包括蛋白质、多肽、反-义DNA或RNA及酶活性RNA。基因转移可以在培养细胞中进行，也可直接施用到动物中。一般地，基因转移涉及核酸分子通过非特异的或受体介导的相互作用和靶细胞结合，核酸分子通过膜或内体吸收进入细胞，核酸分子从只膜或内体释放到胞质中的过程。表达可能还需要核酸分子到细胞核的移动及与适当核转录因子的结合。
本文所用的“基因治疗”是一种形式的基因转移，包含在本文基因转移的定义中，特别是指使体内或离体细胞表达治疗产物的基因转移。基因转移可在离体的细胞中进行，该细胞再进一步转入患者。也可以通过将核酸分子或核酸-蛋白质化合物直接施用到患者中来实现。
在另一个优选实施方案中，提供了一种含有编码VEGF145的核酸分子序列的载体，其中的核酸分子序列只在特异组织中表达。得到组织特异性表达基因的方法在国际出版物WO93/09236(1992年11月3日申请，1993年5月13日公开)中有所阐述。
在上面阐述的所有前述载体中，本发明另一种方面是如上面所定义的，载体中包含的核酸序列可包括对部分或全部核酸序列的添加、缺失或修饰。
在另一个优选的实施方案中，提出了一种基因取代的方法。本文所用的“基因取代”指供给一种能在动物体内表达的核酸分子序列，由此提供或提高动物中缺少或有缺陷的内源基因的功能。临床应用用编码VEGF145的多核苷酸转染内皮细胞实现刺激哺乳动物的血管形成，可以例如，按照本文一并参考的Giordano等，“成纤维细胞生长因子-5的冠内基因转移添加了心脏局部缺血区中血液收缩功能”，天然医药，Vol.2 No.5,534-539页，May 1996中所描述的步骤进行。
VEGF145可从受指导心脏细胞中VEGF145表达的腺病毒所感染的细胞中释放。这种可释放性也发现于VEGF121和VEGF165中，但VEGF189和VEGF206中没发现。然而，和VEGF121和VEGF165相比，由于VEGF145向临近血管中的靶内皮细胞扩散，它为ECM分子所部分保留。和VEGF121和VEGF165相比，结合态的VEGF145可在后来被缓慢地释放，延长促血管形成效应。另外，和ECM结合的VEGF145是活性的，在血管成熟的关键期中支援新形成的血管，知道血管的存在不在依赖于血管形成生长因子的存在。因此，VEGF145作为治疗试剂用于诱导附属血管比任何其它VEGF形式都要有效。当以腺病毒为基础的表达载体应用于基因治疗，考虑到血管形成试剂的传送时这些优势更为重要。初次注射后病毒很快丢失，并且伴随着重组蛋白质产物的下降(Kass-Eisler,A.等，美国科学院院报90,11498-11502,1993)。由于和其他分泌型VEGF形式相比，VEGF145的结合特征使它以更慢的速度清除，我们期望VEGF145和其它VEGF形式相比是一种更有效的治疗试剂。
囊状血管形成术是对局部缺血心脏病的主要治疗方法，涉及球状囊在堵塞的血管中膨胀以打开受阻的血管。遗憾的是，这种治疗方法经常导致对线形排列在血管内壁的内皮细胞的损伤。光滑肌细胞经常渗入开放的血管，在一种所谓再狭窄的过程中导致次级堵塞。可以利用VEGF145诱导位于球状囊外周的受诱导损伤区域的内皮细胞的增殖，以用新的单层内皮细胞覆盖血管腔表面，恢复血管的原始结构。在该病例中也可利用腺病毒介导的基因-治疗为方法，将内皮细胞增殖的诱导物传送到由球状囊血管成形术操作所造成的损害区。和ECM的结合能力也为该项应用提供几种优势。
为阻止囊状血管成形术后的再狭窄，有两种方法可以考虑。利用用于打开堵塞血管的球状囊将蛋白质，或者指导这种蛋白质表达的表达载体传送到闭合部位是可能的。这种蛋白质也可抑制侵入重新打开之血管的非内皮细胞的增殖，直到受损内皮细胞单层两侧的内皮细胞有机会再-生长。这可以和加速内皮细胞层再-生长的蛋白质或如重组腺病毒之类的载体的传送相结合。然而，如FGF-5、bFGF或HGF之类的生长因子也促进光滑肌细胞的有丝分裂，包括它们的增殖，这和所需效果相反。另一方面，VEGF对内皮细胞是特异的。由于VEGF145的ECM结合特性，本文中它特别有用。根据应用，例如，通过用编码蛋白质的腺病毒感染临近细胞，用编码蛋白质的质粒DNA直接转染或直接传送蛋白质，VEGF145会结合在经球状囊处理之血管的暴露的胞外基质上，启动特别是在损害部位的内皮细胞的增殖和再-生长。因此，VEGF145会在其活性所需的区域定位和富集，使它在即将用于的再狭窄的治疗中特别具有吸引力。
冠状血管形成经常伴随着血管内移植片固定膜的去聚合作用，有助于维持血管功能和避免再狭窄。移植片固定膜涂布有肝素以阻止血栓形成，直到由移植片固定膜形成的新的通道内皮化。VEGF145可直接应用于移植片固定膜，或者利用本领域技术人员所知的方法将如质粒、cDNA或腺病毒载体之类的核酸应用于移植片固定膜，以感染临近的细胞。局部施用的或通过转染产生的VEGF145会增强内皮化，减轻血栓症和再狭窄。
本发明的生长因子的其它应用也已考虑到。一种例子是用于溃疡治疗。溃疡实际上是位于胃中的伤口。已经表明血管形成生长因子对治疗十二指肠溃疡是有效的，稳定血管形成生长因子可能是一些治疗试剂的作用机理，如Sucralfate产生它们的有益影响一样(Szabo,S.等，胃肠病学106,1106-1111,1994)。既然VEGF是在酸性条件下非常稳定的血管形成生长因子，我们就考虑到了它在治疗胃和十二指肠溃疡上的应用。使VEGF145处于一种活性状态的肝素结合能力和经预测在创伤口部位和暴露的ECM的相结合的能力，表明VEGF145对于治疗胃和十二指溃疡上比其它VEGF形式更稳定。
为了帮助理解本发明，以下给出了描述一系列实验结果的实施例。和本发明相关的实验，当然不构成对本发明的特别限制。本领域技术人员现在所知的或以后发现的本发明的变化应当被认为在本文所描述及其后所要求的范围之内。
实施例ⅠVEGF145的分离和特征OC-238人上皮卵巢癌细胞及HeLa细胞和A431细胞(图5)中mRNA的反向PCR分析检测到一种VEGF mRNA形式，其大小对应于编码一种可推测的145-氨基酸成熟蛋白的VEGF mRNA形式的预测大小。OC-238细胞的反向PCR产物经测序发现含有外显子结构1-5,6a,8，这是编码VEGF145的mRNA的预测结构。测序的cDNA是利用引物GGAGAGATGAGCTTCCTACAG和TCACCGCCTTGGCTTGTCACA得到的。这两个引物对应于编码VEGF氨基酸92-98的序列(所有VEGF形式所共有)和由VEGF基因外显子8编码的VEGF 6个羧基端氨基酸。在所有这些细胞系中，可推断的编码145氨基酸的cDNA看来和VEGF165cDNA的表达水平具有可比性，高于VEGF189cDNA的表达水平。编码VEGF形式的mRNA在如C6神经胶质瘤细胞和U937细胞之类的其它转化细胞系中未被检测到。OC238细胞中可推断的PCR产物的序列分析表明mRNA在序列上含有VEGF基因(VEGF145)的外显子1-5,6和8。
为了产生重组VEGF145，我们通过缺失VEGF189cDNA外显子7编码的寡核苷酸构建了VEGF145cDNA。用于扩增VEGF cDNA外显子的引物是对应puc118序列的外向引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG和对应于外显子6的3’末端的内向引物ACGCTCCAGGACTTATACCGGGA。用于扩增VEGF cDNA的3’末端的引物和puc118序列GGTAACGCCAGGGTITTCCCAGTC和外显子6的3’末端和外显子8的起始序列(CG GTATAAGTCCTGGAGCGT-ATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA)互补。扩增后，沉淀PCR产物，产物仅利用puc118来源的外向引物再一次扩增，经凝胶纯化，亚克隆到PCR-Ⅱ载体上，利用美国生物化学公司(Cleveland，俄亥俄州)的序列-Ⅱ试剂盒测序，该cDNA进一步用于蛋白质表达研究。
该重组VEGF145cDNA用于构建含有VEGF145cDNA的重组杆状病毒。该病毒按照包含在本文的文献Cohen,T.等，生长因子7:131-138,1992中描述的那样感染sf9细胞。被转染的sf9细胞产生的大部分VEGF145产物在条件培养基上发现是41KDa的同聚二聚体，还有少量单体VEGF145(图4)。经二硫苏糖醇还原，VEGF145二聚体分离成单聚体。VEGF145经肝素-葡聚糖部分纯化，用分段盐梯度的方法使蛋白质从柱中洗脱下来。大部分VEGF145在0.6-0.7M NaCl中洗脱出来，表明VEGF145的肝素结合活性和VEGF165的相似。重组VEGF145是有生物活性的，诱导源于人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)的增殖。VEGF145的ED50为30ng/ml，而VEGF165的ED50低6倍(图6)。
实施例Ⅱ内皮细胞的增殖和血管形成为了证实VEGF145能在体内诱导血管形成，利用本文一并参考的Macarthur,C.A.等，细胞生长与分化6,817-825,1995中所描述的技术将VEGF145cDNA亚克隆到了哺乳动物表达载体MIRB的Bam-HI位点，MIRB/VEGF145质粒转染进入BHK-21仓鼠肾来源的细胞，和产生分离的VEGF145的稳定细胞系。由哺乳动物细胞产生的VEGF145是有生物活性的，并分泌到生长介质中。已分离得到了一种每106细胞产生0.1mgVEGF145的稳定克隆。用本文一并参考的Plunkett,M.L.等，实验研究62,510-517,1990中描述的方法将VEGF145表达细胞包埋在藻酸盐小珠中，小珠植于balb/c小鼠的皮下。4天后移出含有受侵染细胞的藻酸盐沉淀，并磷酸化(图11)。含有VEGF145表达细胞的藻酸盐小珠簇为带血液的深红色，而含有只转染上载体的细胞的小珠血液含量远低于它。当在更大放大率下观察时，含有产生VEGF145细胞的沉淀比含有对照细胞的沉淀更可观察到。这些结果与所预料的血管细胞增殖或促血管形成因子的形成一致。
实施例Ⅲ受体结合特征VEGF165和HUVEC细胞上三种VEGF受体结合，而VEGF121只和这些受体中较大的一种结合。VEGF121和VEGF165结合的共有受体是KDR/flk-1VEGF受体(Gitay-Goren,H.等，生物化学杂志271,5519-5523,1996)。为了确定VEGF145的受体结合模式，在1μg/ml肝素存在、添加VEGF145的情况下，使125I-VEGF165(如本文一并参考的GitayGoren,H.等，生物化学杂志271,5519-5523,1996所述的那样产生)和HUVEC细胞结合。结合态的125I-VEGF随后共价结合到VEGF受体上。VEGF145抑制125I-VEGF和HUVEC细胞上KDR/flk-1受体的结合，但不阻止和该细胞上两个较小的VEGF165特异性受体结合(图7)。一种无细胞的结合实验证实了这一结果。该实验中，125I-VEGF145和125I-VEGF165竞争含有flk-1受体细胞外结构域的可溶性融合蛋白。和125I-VEGF165相比较，125I-VEGF145和两种较小的VEGF受体的结合竞争相当无效，表明VEGF145对这两种受体的亲和力远低于VEGF165。也就是说VEGF145的行为和VEGF165的不同。虽然外显子-6赋予VEGF145以肝素结合特性，外显子-6的存在并不足以引起VEGF145和这两种受体的结合。
实施例ⅣECM结合特征VEGF189有效地和CEN4细胞产生的ECM结合，而VEGF165和它非常弱地结合，VEGF121根本不和它结合，VEGF189和肝素高亲和地结合的事实提供一种迹象，即VEGF189和ECM的相互作用由肝素-硫酸盐蛋白聚糖介导(Houck,K.A.等，生物化学杂志267,26031-26037(1992)；Park,J.E.等，细胞与分子生物学4,1317-1326(1993))。VEGF145和VEGF165的肝素结合亲和力相似，远低于VEGF189的肝素结合亲和力，因此VEGF145据估计和ECM的结合微弱。另人惊奇的是，VEGF145和牛角膜内皮细胞产生的ECM结合实验表明VEGF145有效地结合，而VEGF165的结合是个空白。在这些实验中，实验结果如图8所示，可以看出VEGF145有效地和ECM结合，而VEGF165结合如果有的话远不如它有效。125I-VEGF145和ECM的结合是大量的，但并不是完全的，可被10g/ml肝素抑制。这些实验中所用的125I-VEGF145含有一些杂质，但从ECM上去除的的主要碘化蛋白质和125I-VEGF145有很大的相关性(见图8b)。为了确定125I-VEGF145和ECM结合，而不和暴露的能进行新陈代谢的表面相结合，ECM被移出，离心洗涤。对沉淀中被吸收的125I-VEGF145定量。ECM含有70％被吸收的125I-VEGF145。由上所述，我们认为VEGF145中来源于外显子-6的肽的存在导致和ECM的有效结合，而VEGF165中来源于外显子-7的肽的存在不赋予这种特性。因此，在这个方面上VEGF145和VEGF121或VEGF165很不不同。
实施例ⅤECM结合特征上述实验表明VEGF145和ECM结合，而VEGF165和它结合远没有那麽有效。VEGF145和VEGF165以相似的亲和力和肝素结合表明和ECM的结合不为肝素-之类的分子介导。bFGF和ECM的相互作用是由肝素-硫酸盐蛋白聚糖介导的。为了确定VEGF145是否利用bFGF之类的结合机理和ECM相互作用，使125I-VEGF145在有10μg/ml肝素存在时和涂布有ECM的盘相结合。VEGF145的结合被抑制60％，而125I-bFGF和ECM的结合被抑制80％。在0.8M的盐存在时，125I-VEGF145和ECM的结合也被抑制80％，表明该相互作用不是疏水性的。这些结果和预料的通过肝素类分子和ECM相结合的蛋白质的行为是一致的。然而，我们出乎预料地观察到也可以和经肝素酶-Ⅱ消化的ECM有效地结合。相比较，几乎没有125I-bFGF和经肝素酶-Ⅱ处理的ECM的结合(图9a)。该观察表明VEGF145不通过和ECM相连的肝素-类分子结合而结合ECM。
为了进一步研究VEGF145和ECM相互作用的模式，我们测定了肝素和肝素酶处理从ECM释放前-结合态VEGF145的能力。当含有ECM的结合态125I-VEGF145或125I-bFGF和肝素温育或经肝素酶-Ⅱ消化时观察到了相似的差别。但涂布有ECM的孔和结合缓冲液于37℃温育两小时时，20％的结合态125I-bFGF和13％的结合态125I-VEGF145从ECM上解离下来。这种释放部分由于存在于ECM中的蛋白水解酶活性。当10μg/ml肝素在缓冲液中温育时，和78％前-结合态125I-bFGF的释放相比，只有33％的125I-VEGF145从基质中释放。当肝素酶-Ⅱ加到结合缓冲液中时，观察到了一种更显著的差异。该酶释放72％结合态125I-bFGF，但只释放17％结合态125I-VEGF145(图9b)。当用非标记的VEGF145进行实验，利用商品单克隆抗-VEGF抗体检测和ECM结合的VEGF时，得到了相似的结果。
为估计肝素酶-Ⅱ消化的效率，ECM代谢性地标记上35S-硫酸盐，带有标记的ECM用肝素酶-Ⅱ消化。消化释放了80-85％带有标记的硫酸盐残基。为了确定VEGF145是否能结合于不含硫酸化糖胺聚糖的ECM上，BCE细胞在有30mM氯酸盐的介质中生长，后者如Miao,H.Q.等，生物化学杂志271,4879-4886,1996中所述是糖胺聚糖硫酸盐的抑制剂。有或没有氯酸盐存在时产生的ECM进一步用肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的混合物消化。虽然ECM中硫酸盐成分的含量下降＞95％，这些处理都不严重抑制VEGF145和ECM的结合。
BCE细胞产生的ECM含有bFGF，它促进内皮细胞的有丝分裂。然而，由于bFGF不含硫酸化肝素之类的分子不结合，所以当内皮细胞植于有氯酸盐存在产生的ECM中时，它们并不增殖。VEGF145和有氯酸盐存在产生的ECM结合，因此我们验证了和这种ECM结合的VEGF145是否保留有生物活性。涂布有氯酸盐存在下产生的ECM的孔和浓度添加的VEGF145或VEGF165温育。随后孔被充分洗涤，孔中植入HUVEC细胞。和VEGF145温育的ECM诱导血管内皮细胞的增殖，而和VEGF165温育的ECM诱导血管内皮细胞的增殖，表明结合ECM的VEGF145是有生物活性的(图10)。
实施例ⅥVEGF145和其它VEGF形式的比较表1:VEGF145和其它VEGF形式之间差异的总结
a．和VEGF165的比较VEGF165含有VEGF基因的外显子1-5,7和8，缺少外显子6。它以与VEGF145相似的亲和力结合肝素。VEGF145和人脐静脉来源的内皮细胞上的单一受体结合，该受体被鉴定为KDR/flk-I受体。相反，VEGF165和存在于血管内皮细胞和几种其它细胞类型上的另外两种高亲和受体结合(Neufeld,G.等，癌症转移评论15:153-158,1996)。还不清楚VEGF165是否结合，如果结合的话，和VEGF165相比，内皮细胞应该对VEGF145表现出更严格的生物反应。VEGF165对氧化试剂敏感。这些在发炎组织和受伤之类的情况下尤其严重。然而，当受氧化损伤的VEGF165和发现于内皮细胞上的肝素-类分子结合时，受损伤VEGF165的活性得到恢复(Gitay-Goren,H.等，生物化学杂志271,5519-5523，1996)。VEGF145也有这种特性。另外，VEGF165非常弱地和ECM结合，如果结合的话。VEGF165和ECM微弱的结合随着ECM经肝素酶消化而受到抑制。相反，VEGF145和ECM的结合不因先将ECM用肝素酶消化而受到改变。因此，虽然VEGF165和VEGF145有着相似的肝素-结合亲和力，VEGF145被分泌并和ECM有效地结合，这一点和VEGF165不同。b．和VEGF121的比较VEGF145不含有VEGF基因的外显子6和7。和VEGF145相反，VEGF121不和肝素结合。象VEGF145一样，VEGF121不和发现于血管内皮细胞和类型癌细胞上的两种较小的VEGF受体结合。VEGF121和VEGF145都由细胞分泌。但VEGF121不和ECM结合。象VEGF165和VEGF145一样，VEGF121由于氧化失活，但和VEGF145的活性不由于和肝素-类分子的结合而恢复。c．和VEGF189及VEGF206的比较VEGF189含有由VEGF基因的外显子6和7编码的肽。和VEGF145相比，它以更高的亲和力和肝素结合。它还很好地和ECM结合。然而，不象VEGF145，VEGF189不被分泌到VEGF189产生细胞的介质中，仍和细胞相连。VEGF206的特性和VEGF189的相似。
虽然如VEGF189所观察到的那样，肝素可以从ECM中释放VEGF145，但VEGF145可能不利用ECM中的肝素-硫酸盐和基质结合。我们目前还不能够说明与完整的VEGF189的血管形成反应。这可能是由于VEGF189和VEGF189产生细胞，以及与发现在VEGF189产生细胞邻近的ECM的紧密联系。相反，我们已经证明VEGF145是由产生细胞释放的，促进体内血管形成。该发现表明VEGF145和ECM的亲和力可能低于VEGF189。因此，VEGF145拥有一种独特的特性组合，使它和其它VEGF形式相比，成为一种更合适的治疗试剂。
实施例Ⅶ利用VEGF145的基因-转化-介导的血管形成治疗编码VEGF145的DNA用于基因-转化-介导的血管形成治疗已有描述，例如，本文一并参考国际专利申请PCT/US96/02631(1996,9,6出版)WO96/26742中的描述。腺病毒构建体自主复制缺陷型人腺病毒5系统可以用于基因-转化。编码VEGF145的核酸分子可以克隆进质粒ACCMVPLPA的多聚衔接物上，该质粒含有CMV启动子和侧翼有缺失了E1A和E1B基因(对于病毒复制所必需)之部分腺病毒序列的SV40多聚腺苷酸化信号。该质粒和质粒JM17共转化(脂质转染)到293细胞。后一质粒含有带有额外4.3bp插入片段以使pJM17太大而不能被包装的整个人腺病毒5基因组。同源挽救重组结果产生不存在E1A/E1B序列的、包含转基因的腺病毒载体。虽然这些重组子在哺乳动物细胞中是非复制型的，它们能够在已经转化有E1A/E1B的293细胞中繁殖，反向提供这些关键基因产物。通常转染后10-14天发生的CYTOPATHIC效应证明受转染的细胞受调控。为了鉴定成功的重组子，表现CYTOPATHIC效应的平板上的细胞上清液用蛋白水解酶K(50mg/ml，含有0.5％十二烷基磺酸钠和20mM EDTA)于56℃处理60分钟，酚氯仿抽提，乙醇沉淀。成功的重组子利用和CMV启动子及SV40序列互补的引物(生物技术，15:868-72,1993)PCR扩增VEGF145核酸插入片段和设计用来伴随扩增腺病毒序列的引物(生物技术，15:868-72,1993)得以鉴定。重组子即为两次纯化的噬菌斑。在293细胞中繁殖的病毒贮液滴度变动在1010到1012病毒微粒之间，用前经CsCl双重梯度离心纯化。用于产生重组腺病毒的系统有5Kb转基因插入片段的包装极限。有CMV启动子驱动的、带有SV40多聚腺苷酸序列的VEGF145基因正好在包装限度之内。重组载体是通过经常规方法纯化的噬菌斑。得到的病毒载体在293细胞中繁殖直到滴度在1010-1012病毒微粒变动范围之间。细胞以80％的融合感染，36-48小时时收集。经过数次冻融循环后，细胞碎片通过常规的离心沉淀，病毒经CsCl双重梯度离心进一步纯化(不连续1.33/1.45CsCl梯度；用5mMTris,1mM EDTA(PH7.8)制备铯；90,000xg(2hr),105,000xg(18hr))。体内注射之前，病毒贮液通过如G25葡聚糖的葡聚糖柱凝胶过滤脱盐。得到的病毒贮液有一种约在1010-1012病毒微粒变动范围之间的终病毒滴度。腺病毒构建体因此就高度纯化了，不含有野生型(潜在的复制型)病毒。猪血管形成的局部缺血模式在器械无菌的条件下对家猪(30-40kg)进行左部胸廓切开术。(Hammond临床研究杂志92:2644-52和Roth等，临床研究杂志91:939-49,1993)。导管置于左部心房和主动脉，提供了一种测定局部血流和检测血压的手段。左心房缝上线以便心电图录音和心房搏动。最后，邻近LCx的周围放置一苦味质。稳定程度的局部缺血形成后，处理组接受包含由CMV启动子驱动的VEGF145基因的腺病毒构建体。对照动物接受用由CMV启动子驱动的包含有报道基因，LacZ的腺病毒构建体进行的基因转移。
研究从苦味质放置35±3天后开始，这是附属血管形成和搏动-诱导的机能障碍稳定的时候(Roth等，动物生理杂志253:1-11279-1288,1987和Roth等，循环82:1778-89)。有知觉的动物悬吊在吊物器上，以线上数字形式记录LV、LA和主动脉的压力及心电图(在静止和心房以200bpm的速率搏动)。利用Hewlett Packard超声波图象系统获得两二维和M-方式图象。图象从接近中间-乳头状的肌肉水平的右胸骨旁获得，并且记录在VHS磁带上。记录处于基础状态的右心房搏动(HR=200bpm)期间动物的图象，这些研究在基因转移前一天完成，并且在14±1天后重复。速率-压力产物左心房压力在基因转移之前和之后的两组中相似，表明类似的心肌需氧量和装载条件。用常规标准进行心电图测定(Sahn等，循环58:1072,1978)。测定5次连续搏动的舒张-末壁的厚度(EDWTh)和收缩-末壁的厚度(ESWTh)，取平均值。壁厚的百分比(％WTh)以[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100计算。不考虑动物所接受的基因如何分析这些数据。为了证明心电图测定的再现性，在连续的两天中测定该动物的心电图，表现出高度的一致性(r2=0.90；p=0.005)。
苦味质放置35±3天后，恰在苦味质闭合时，但在基因转移之前，用搏动期注射进左心房的可比性物质(Levovist)进行可比性心电图研究。基因转移14±1天后重复该研究。用基于计算机的视频分析程序(Color Vue Ⅱ，新组合微型声能学，Indianapolis,Indiana)从视频图象测定峰对比强度，其提供视频强度的客观尺度。不考虑动物所接受的基因如何分析这些对比研究。
在研究完成时，将动物麻痹，进行中线胸廓切开术。分离短头动脉，插入插管，将其它的血管扎起来。动物接受静脉内注射肝素(10,000IU)和罂粟硷(60mg)。供以氯酸钾诱导心脏舒张抑制，横跨-钳制主动脉。通过短头动脉插管(120mmHg压力)输送生理盐水，由此薰香冠状动脉。灌注(120mmHg压力)戊二醛溶液(6.25％,0.1M二甲胂酸缓冲液)直到心脏被固定好(10-15分钟)。移出心脏，用顺着左前下行的(LAD)，左卷曲的(LCx)和右冠状动脉注射的颜色-标记的染料鉴定底座。检查苦味质经以确定是闭合的。取自正常灌注和局部缺血区域的样品分成3份，心内和心周围的3份可塑包埋。为了定量毛细管数目，如前所述(Mathieu-Costello等，动物生理杂志359:H204,1990)进行显微分析。从每个亚样品(每个区域的心内和心周围)取四个1μm厚的横切片，在400X分辨率下用点-计数确定毛细管数目/纤维数目之比。每个区域内，心内和心周围的毛细管数目和纤维数目之比应该相似。那么每区40-50处平均应提供透壁毛细管和纤维数目的比率。
为了确定改善了的区域功能和血流源于转基因表达，可以用PCIR和RT-PCR检测接受VEGF145基因转移的动物心肌中转基因VEGF145cDNA和mRNA。用CMV启动子的有义引物[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC]和中间VEGF145基因序列的反义引物，利用PCIR扩增预期的500bp片段。用起始VEGF145基因序列的有义引物和中间VEGF145基因序列的反义引物，利用RT-PCR扩增预期的400bp片段。
最后利用针对VEGF145的抗体。接受VEGF145基因转移的动物细胞和心肌中，VEGF145蛋白质表达表现在基因转移后48小时以及14±1天。
自主复制缺陷型人腺病毒5系统用于制备含有载体的转基因。体内注射的物质应该高度纯化，不含野生型(潜在复制型)腺病毒。由此使心脏中腺病毒感染和炎症的渗透最小化。通过冠状动脉导管将材料直接注射进冠状动脉腔，它可以有效地定向基因。当以这种方式移送时，肝脏中不应有转基因表达。冠内注射后的任何时候在尿中都不应发现有病毒RNA。
通过左、右两冠状动脉都注射2.0ml构建体(到LCx的并行流好象来自这两个血管)进行注射(4.0ml含有1011腺病毒微粒)。将动物麻痹，通过右颈动脉切割得以进入动脉。置入一5F Cordis鞘。5F多功能(A2)冠状导管用于利用冠状动脉。LCx苦味质的闭合通过对比性地注射进主冠状动脉得以证实。导管头置入动脉腔1cm，以使注射过程中最少的物质损失到邻近主动脉。每头猪都进行这样的步骤。
一旦完成了基因转移，用三种策略确定基因的成功掺入和表达(1)一些构建体可以包含报道基因(LacZ)；(2)相关房室的心肌进行取样，进行免疫印迹实验确定存在有VEGF145蛋白质的量；和(3)利用PCR检测VEGF145mRNA和DNA。
所得到的区域性的收缩功能数据应表明对照猪在转基因前及14±1天后心肌区域的搏动-诱导性功能障碍的程度相似。相反，接受基因转移的猪应表现出搏动过程中心肌区域壁的加厚增强，表明基因转移和本发明与提高搏动过程中心肌区域的收缩有关相一致。正常灌注区域的壁增厚(室间隔膜)在搏动过程中应该正常，不受基因转移影响。通过经胸廓的心电图测定的功能降低百分比应该和相同的模式搏动过程中通过听力测微法测定的减低百分比相似(Hammond等，临床研究杂志92:2644,1993)，证明心电图用于测定心肌功能障碍是精确的。
虽然本文特意描述了优选的实施方案，也应该意识到，根据上述教义，在所附权利要求范围之内，在不脱离本发明的精神和本意的情况下，对本发明进行许多修饰和改变是可能的。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Technion Research＆Development Co.,Ltd.,Collateral Therapeutics(ⅱ)发明名称血管形成因子及其在治疗心血管疾病中的用途(ⅲ)序列数2(ⅳ)通讯地址(A)收信人Wigman,Cohen,Leitner Myers,P.C。
(B)街道900 17TH街，N.W.，1000号(C)城市华盛顿(D)州D.C。
(E)国家美国(F)ZIP:20006(ⅴ)计算机可读形式。
(A)介质类型软盘3.5英寸，1.44Mb存储量(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件ASCII(ⅵ)当前的申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(ⅶ)在先的申请数据(A)申请号08/784,551(B)申请日21-01-1997(C)申请号60/025,537
(D)申请日06-09-1996(ⅷ)律师/代理人信息。
(A)姓名Cohen,Jonathan M.
(B)注册号40,562(C)证书号0274.008 PCT(ⅸ)电讯信息。
(A)电话(202)4637700(B)传真(202)4636915(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度483个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(ⅱ)分子类型(A)描述VEGF145的cDNA(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型未知(ⅵ)原始来源(A)细胞株Hela和A431细胞(ⅶ)直接来源从Hela和A431细胞的总mRNA翻译而来(ⅷ)在染色体组中的位置未知(ⅸ)特征(A)名称/关键VEGF145的编码序列(B)位置79-483
(C)鉴定方法与其它编码序列的相似性(D)其它信息表达VEGF145(ⅹ)出版物信息未知(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATGAACTTTC TGCTGTCTTG GGTGCATTGG AGCCTTGCCT TGCTGCTCTA CCTCCACCAT 60GCCAAGTGGT CCCAGGCT GCA CCC ATG GCA GAA TTC ATG GAT GTC TAT CAG CGC 114Ala Pro Met Ala Glu Phe Met Asp Val Tyr Gln ArgAGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG TAC162Ser Tyr Cys His Pro Thr Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu TyrCCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCC CTG ATG210Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Pro Cys Val Pro Leu MetCGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT258Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro ThrGAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC CAA306Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His GlnGGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT GAA354Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys GluTGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA AAA AAA TCA GTT CGA402Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val ArgGGA AAG GGA AAG GGG CAA AAA ACG AAG CGC AAG AAA TCC CGG TAT AAG450Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr LysTCC TGG AGC GTA TGT GAC AAG CCG AGG CGG TGA483Ser Trp Ser Val Cys Asp Lys Pro Arg Arg(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度145个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)链型未知(D)拓扑结构线形(ⅱ)分子类型蛋白质(A)描述引起新的附属血管生长的血管内皮生长因子(VEGF145)(ⅲ)假设否(ⅳ)反-义否(ⅵ)原始来源昆虫SF9细胞(A)有机体草地夜蛾(B)细胞株SF9昆虫细胞(ⅶ)直接来源(B)克隆重组杆状病毒(ⅷ)基因组中的位置未知(ⅸ)特征(A)名称/关键VEGF145的编码序列(B)位置1-145(ⅹ)出版物信息未知(ⅹⅰ)序列描述。SEQ ID NO:2:Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys5 10 15Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu20 25 30Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys35 40 45Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu50 55 60Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile65 70 75 80Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe85 90 95Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg100 105 110Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys115 120 125Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Cys Asp Lys Pro Arg130 135 140Arg
权利要求
1．一种治疗哺乳动物心血管疾病的方法，该方法包括用编码VEGF145的多核苷酸转染上述哺乳动物的细胞的步骤。
2．按照权利要求1的方法，其中所说的多核苷酸是克隆到载体中的。
3．按照权利要求2的方法，其中所说的载体包含腺病毒微粒。
4．权利要求3的方法，其中所说的腺病毒载体微粒是通过注射传送到所说哺乳动物中的。
5．权利要求4的方法，其中所说的腺病毒微粒的数量在约1010到约1014之间。
6．权利要求5的方法，其中所说的腺病毒微粒的数量在约1011到约1013之间。
7．权利要求1的方法，其中所说的被转染的细胞是心脏细胞。
8．权利要求4的方法，其中所说的被转染的细胞是冠状动脉细胞，并且其中所说的注射是冠内注射。
9．权利要求8的方法，其中所说的腺病毒微粒被注射进左和右冠状动脉腔约1cm。
10．按照权利要求1的方法，其中所说的细胞是体内被转染的。
11．按照权利要求1的方法，其中所说的细胞是离体被转染的。
12．按照权利要求8的方法，其中所说的多核苷酸是通过插入到冠状动脉中的导管引入到所说的冠状动脉细胞的。
13．按照权利要求12的方法，其中所说的导管包含具有适用于所说的动脉内壁的外表面的可膨胀球状囊，并且所说的多核苷酸分布在所说的球状囊外表面上。
14．按照权利要求1的方法，其中所说的多核苷酸包含序列表中SEQ ID NO.1所限定的碱基序列。
15．权利要求1的方法，其中所说的哺乳动物是人。
16．一种包含编码VEGF145物种的多核苷酸序列的表达载体，所说的物种从包含下列的组中选择(a)VEGF145；(b)VEGF145的一个生物活性片段；和(c)VEGF145的生物活性衍生物或其片段，其中在VEGF145的氨基酸序列中或从该序列有一个或多个氨基酸残基被插入、取代或缺失。
17．按照权利要求16的表达载体，其中所说的物种是VEGF145。
18．按照权利要求16的表达载体，其中所说的多核苷酸包含序列表中SEQ ID NO.1所限定的碱基序列。
19．按照权利要求16的表达载体，其中所说的多核苷酸侧翼是腺病毒序列。
20．按照权利要求19的表达载体，其中所说的多核苷酸序列在其5’末端可操作地连接到在血管内皮细胞中有活性的启动子序列上。
21．按照权利要求19的表达载体，其中所说的表达载体是腺病毒载体。
22．按照权利要求21的表达载体，其中所说的载体还包含缺失了EIA/EIB基因的部分腺病毒序列。
23．一种用于冠内注射表达VEGF145的重组载体的试剂盒，该试剂盒包含克隆进适合体内表达它的载体上的编码VEGF145的多核苷酸，所说载体的合适容器，和将所说的载体注射进患者的说明书。
24．按照权利要求23的试剂盒，其中所说的多核苷酸是被克隆到腺病毒表达载体中的。
25．一种治疗哺乳动物血管疾病的方法，该方法包括给所说的哺乳动物施用治疗有效量的VEGF145以刺激血管内皮细胞增殖的步骤。
26．一种用于提高患病血管内皮化的方法，该方法包括给所说的哺乳动物施用治疗有效量的VEGF145的步骤。
27．权利要求26的方法，其中所说的内皮化是在血管成形术之后的再次内皮化。
28．权利要求27的方法，其中所说的再次内皮化减少或者阻止再狭窄。
29．权利要求27的方法，其中所说的患者是用移植片固定膜治疗的。
30．权利要求27的方法，其中所说的患者是没有用移植片固定膜治疗的。
31．权利要求26的方法，其中所说的哺乳动物是人。
32．权利要求25的方法，其中所说的施用包括基因治疗。
33．按照权利要求32的方法，其中用涂布有编码VEGF145的多核苷酸的可膨胀的球状囊导管实施所说的基因治疗。
34．一种提高肿瘤对药物渗透的方法，该方法包括给患者施用编码VEGF145的核酸分子。
35．权利要求34的方法，其中所说的VEGF145被直接传送到肿瘤细胞。
36．一种治疗组合物，该组合物包含药学上可接受的载体和刺激血管内皮细胞增殖有疗效量的VEGF145。
37．一种过滤了的可注射的腺病毒载体制剂，该制剂包含重组腺病毒载体，该载体不包含野生型病毒，而包含一种已缺失E1A/E1B基因的部分腺病毒序列，和一种由侧翼有部分腺病毒序列的启动子驱动的、编码VEGF145的转基因，和一种药物学上可接受的载体。
38．一种分离的多核苷酸，其包含VEGF基因的外显子1-5,6a和8。
全文摘要
本发明涉及一种新的VEGF蛋白质产物,和编码该新蛋白质产物的包含VEGF基因的外显子1－6和8的核酸,及其在通过作用于骨骼。导管机能和渗透性治疗心血管系统及其疾病中的用途。已经发现VEGF
文档编号A61K48/00GK1236390SQ97199495
公开日1999年11月24日 申请日期1997年9月4日 优先权日1996年9月6日
发明者格拉·诺伊费尔德, 埃利·凯舍特, 伊斯拉埃尔·弗洛达夫斯基, 卓娅·波尔托拉克 申请人:泰克尼恩研究和发展有限公司, 附属治疗学公司