疫苗的制作方法

专利名称：：疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类新的疫苗制剂，制备该类制剂的方法及其在治疗中的应用。具体讲，本发明涉及一类新的治疗单纯疱疹病毒感染的制剂，更具体说来涉及治疗单纯疱疹病毒2(HSV-2)感染的制剂。HSV-2是生殖器疱疹的原发病原学体，HSV-2和HSV-1(疱疹成因体，单纯疱疹病毒)的特点在于主要在神经元神经节细胞中诱发急性病又会导致隐性感染。据估计，仅仅在美国大约有5百万人患有生殖疱疹，每年临床记录病例有50万(原发和复发性感染)，原发感染主要发生在青春期后，其特点在于局部出现皮肤疼痛损伤，持续2-3周。在原发性感染后的六个月后，有50％的患者仍会复发这种病。其中25％左右的患者每年将会复发10-15次。免疫损害的患者中，据统计高复发率要比一般的患者高。HSV-1和HSV-2病毒均在表面具有许多糖蛋白成分，这些成分称为gA、gB、gC、gD、gE等。糖蛋白D位于该病毒膜上，在感染细胞胞桨中也发现有(Eisen-bergR.J.等人；JofVirol198035428-435)。gD包含信号肽在内的393个氨基酸，其分子量约为60kD。在所有HSV包膜糖蛋白中，这可能是其最好的特性(Cohen等人，J.Virology60157-166)。在体内据说这对于病毒附着于细胞膜上起着重要作用。而且，业已证明糖蛋白D也能在体内诱发中和抗体(Eing等人，J.Med.Virology12759-65)。然而，仅管在患者血清中中和抗体的效价高，但隐性HSV-2病毒仍能被再激活并诱导所说疾病复发。仅仅具有诱导中和抗体的能力还不足以控制这类疾病，为了防止这类疾病的复发，对于任何疫苗来说，不仅需其刺激中和抗体，而且还要能刺激通过T-细胞介导的细胞免疫。本发明的方法能实现这些目的。本发明提供的疫苗包括与3-O-脱酰单磷酰基脂A(3D-MPL)(一种单磷酰脂A的脱酰衍生物)及适宜的载体混合的HSV糖蛋白D或其免疫学片段。一般而言，该糖蛋白D来源于HSV-2。所说载体可以是水包油型乳液或明矾，所说3D-MPL的量(每剂)为10μg～100μg，优选25μg～50μg，其中所说抗原一般每剂为2～50μg。可根据英国专利(2220211号)(R1B1)中披露的方法制备3D-MPL。本发明的实施方案中，使用截短的308个氨基酸的HSV-2糖蛋白D，该糖蛋白D包括1-306天然存在的糖蛋白的氨基酸和外加在截短的无膜固着区蛋白的C末端的天门冬酰胺和谷氨酰胺。此种形式的蛋白质包括能被分裂产生成熟的283个氨基酸蛋白的信号肽。Genentech的Ep-B-139，417中已对在中国仓鼠卵细胞中产生的这种蛋白质作了介绍。优先选用该成熟的断片制备本发明的疫苗制剂，该断片称作rgD2t。可用化学或其他方法将HSV抗原与粒状载体结合，最优选的办法是通过化学方法借助位于肝炎B表面抗原表面上的游离巯基与粒状肝炎B表面抗原结合，参见中请待批的U.K9027623.9号申请。本发明的制剂在诱导保护性免疫方面，甚至在抗原剂量非常低(例如低至5μgrgD2t)时也是非常有效的。本发明的制剂在使之免遭原发性感染和刺激方面效果特别优异，无论对于特异性体液(中和抗体)还是对于效应基因细胞介导(DTH)免疫应答方面均是如此。水包油型的无毒乳液优选含无毒油(如角鲨烷或角鲨烯)、吐温80这类乳化剂，载体水。所说载体水例如磷酸盐缓冲盐水。本发明还提供一种如其中所说的用于医药治疗，特别用于治疗或预防HSV感染的疫苗制剂。本发明的疫苗包括免疫保护量的HSVgD或其免疫学片段，该疫苗可用惯常方法制备。在Voller等人编辑的“NewTrendsandDevelopmentsinvaccines”(Universityparkpress，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978)中概括性地披露了疫苗的制备方法。Fullerton的US4,235,877号专利中介绍了脂质体胶囊。Likhite的US4,372,945和Armor等人的US4,474,757号专利中披露了蛋白与大分子的结合。每剂疫苗中蛋白的量是按下述原则选定的，即能诱导免疫保护应答，但对接受免疫剂的对象无明显的付作用。该量随所用的特殊免疫原而异。一般而言，每剂疫苗包括1-1000μg蛋白，优选2-100μg，最优选4-40μg。对具体疫苗的适宜的蛋白量是在进行许多标准的研究基础上确定的，这些研究包括观察受治疗者抗体效价和其他应答。首次免疫接种后，约4周后受治疗者可接受加强免疫。除对易受HSV感染的人接种外，本发明的药物组合物还可用于对HSV感染的患者进行免疫治疗。本发明还提供了一种下面将予介绍的制备方法，所说方法包括将HSV-2糖蛋白D或免疫片段与载体(如水包油型乳液或明矾)和3D-MPL进行混合。重组单纯疱疹病毒糖蛋白D亚单位疫苗佐药效力的比较在此研究中，用豚鼠模型来评价几种佐剂对改善重组糖蛋白D保护性免疫免遭单纯疱疹病毒HSV-2(rgD2t)感染的能力。实验的佐剂有氢氧化铝、氢氧化铝和3-脱酰-单磷酰基脂A的混合物及水包油型乳液中得到的3-脱酰-单磷酰基脂A。1.抗原HSVrgD2t是转染的中国田鼠卵巢(CHO)细胞中产生的截断的糖蛋白遗传工程重组体(Ep0139417)2.抗原佐剂的制剂和免疫接种程序表为了评价几种rgD2t制剂的保护性免疫，用豚鼠模型进行了二次实验，在第一次实验中，用按如下方法制备的含低剂量抗原(5μgrgD2t)4种佐剂制剂对几组豚鼠免疫接种三次。在最后免疫接种后两周，阴道内用HSV-2病毒对实验组予以攻击，并每天对原发和复发HSV-2病的发展进行监测。在第二次实验中，以较大规模动物组对这些制剂进行评价。也对诸如抗原剂量和佐剂成分这些影响所说制剂效率的因素进行了实验。2.1抗原佐剂制剂第一次实验中用下面的佐剂制剂对豚鼠进行免疫接种，每剂给药剂量为5μg(0.25ml体积)。2.1.1rgD2t/明矾(氢氧化铝)明矾是从Superfos(Alhydrogel，(Boehimte)Superfos，Demmark)得到的。于4℃下，将5μg经纯化的rgD2t吸附(过夜)子氢氧化铝(明矾)上，该氢氧化铝相等于0.25mg当量Al3+，于0.25mlNaCl(150mM)、磷酸盐(10mM)缓冲液(pH6.8)中。2.1.2rgD2t/氢氧化铝和3D-MPL3D-MPL是从RibiImmunochemResearch.Inc得到的。按上述2.1.1方法，将5μggD2t吸附(过夜)于明矾上后，对佐剂制剂进行离心分离，除去上层清液，然后将含100μg3D-MPL的等体积吸附缓冲液加到该与明矾结合的rgD2t中。对这些rgD2t/明矾制剂而言，均发现98％以上的rgD2t与氢氧化铝佐剂结合。2.1.3水包油型乳液中(R)的rgD2t/3D-MPL将12％(重量/体积)卵磷脂加到角鲨烯油和0.08％吐温80中以制备所说水包油型乳液。以浓度比最终的希望的高于100倍的条件下加入3D-MPL。然后将1％的该制剂(0.25ml体积)与水相中的5μgrgD2t混合，产生含100μg3D-MPL的1％的水包油乳液。在第二次实验中，使用按上述方法制备的但含有不同量的rgD2t和/或免疫刺激质的类似制剂，按总体积0.5ml的剂量对其给药。下面将对这些制剂予以介绍。rgD2t/明矾每剂(0.5ml)中，5或20μgrgD2t；0.5mg当量Al3+。rgD2t/明矾和3D-MPL每剂(0.5ml)中，5或20μgrgD2t；0.5mg当量Al3+。rgD2t/3D-MPL的油/水乳液(R)按上述(2.1.3)方法用5或20μgrgD2t配制1％水包油乳液。0.5ml的剂量中含5μg或20μgrgD2t，50μg3D-MPL的1％(水包油)乳液。rgD2t/3D-MPL的水包油乳液(S)按如下方法制备载体于含0.4％(体积/体积)吐温80的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中加入5％(体积/体积)Pluronic(环氧乙烷-环氧丙烷的嵌段共聚物)L121和10％角鲨烷，然后用微射流器将所得的混合物微流体化十次(M/110型，Microfluidics公司制)，这样得到的乳液仅含亚微细粒。然后于此乳液中加入50μg3D-MPL。将含3D-MPL的一体积的该乳液与等体积的浓缩二倍的抗原混合，使短暂涡流化以确保各成分完全混合。最终制剂是(0.5ml剂量中)由0.2％吐温80、2.5％PluronicL121，5％角鲨烷、50μg3D-MPL和5μg或20μgrgD2t组成。2.2免疫接种程序表分别于0，28和95天时用5μgrgD2t(在4种不同的佐剂制剂中配制)对雌性Hartley豚鼠(200-250gr)各组免疫接种三次。经皮下注射(0.25ml)进行免疫接种。按同样办法对对照组动物进行注射(仅用佐剂或无接种)。对不同的组按如下方法进行免疫接种第一组(n＝4)5μgrgD2t/3-MPL(100μg)的水包油乳液(R)第二组(n＝4)5μgrgD2t/明矾和3D-MPL(100μg)第三组(n＝4)5μgrgD2t/明矾第四组(n＝5)仅用明矾第五组(n＝5)仅3D-MPL(100μg)第六组(n＝8)未处理每2周对动物抽血以按如下所述方法通过ELISA和中和测定以进行抗体测定。通过诱导迟发型超敏反应应答的办法对不同制剂诱导T细胞介导免疫的能力进行了实验。下面将对用于评价不同rgD2t制剂诱导体液和细胞免疫应答的读数予以披露。为了对不同rgD2t制剂诱导的保护性免疫进行比较。最后一次免疫接种后2周，用105空斑形成单位(pfu)的HSV-2，菌株MS经阴道内攻击所有的豚鼠，每天监测实验动物的急性感染临床症状以及复发疱疹病迹象。病毒攻击后5天收集阴道拭子样品并对拭子样品进行滴定以测定感染病毒。豚鼠阴道内攻击模式下面将予详述。第二次实验中，用更大规模的实验动物组来对rgD2t制剂免疫原性进行评价。比较了两种抗原剂量(5和20μg)并对不同的佐剂组合物进行了实验。一剂中用的3DMPL的剂量为50μg，其效果与以前用的100μg的剂量比较。按如下方法分别在1，28和84天时对实验各组雌性Hartley豚鼠免疫接种三次。第I组(n＝8)20μgrgD2t/3DMPL(50μg)的水包油型乳液(R)。第II组(n＝8)5μgrgD2t/3DMPL水包油乳液(R)第III(n＝10)20μgrgD2t/3DMPL(50μg)水包油乳液(S)。第IV组(n＝10)5μgrgD2t/3DMPL(50μg)水包油乳液(S)。第V组(n＝10)20μgrgD2t/明矾+3DMPL(50μg)第VI组(n＝10)5μgrgD2t/明矾+3DMPL(50μg)第VII组(n＝4)仅明矾+3DMPL(50μg)第VIII组(n＝4)仅用3DMPL(50μg)水包油乳液(R)第IX组(n＝8)不处理以0.5ml一剂进行免疫接种。对照组也按同样方法(仅用佐剂)进行免疫接种(第VII，VIII两组)或不加以处理(第IX组)。按第一次预防性实验所介绍的步骤。用每剂(0.25ml)含100μg3D-MPL的gD2t明矾+3D-MPL制剂对最后一组(第X组)进行免疫接种。第X组(n＝10)5μgrgD2t/明矾+3DMPL(100mg)每两周对动物抽血以按如下所述的方法通过ELISA和中和测定来对个体抗体进行测定。第二次免疫接种后收集阴道冲洗物并进行测定以证明对gD2t(lgG类的抗gD2t抗体)具有特异性的全身抗体的存在。最后免疫接种后两周，用105pfuHSV2(菌株MS)阴道内攻击豚鼠，攻击后，每天对其进行监测以观察急性感染的临床症状(攻击后4～12天)以及疱疹病复发(攻击后13～39天)的迹象。3.读数用几组读数来对接种rgD2t制剂诱导的特异性抗体及细胞介导反应进行评价，在豚鼠阴道内测定这些制剂的保护值。3.1ELISA用ELISA来检测和确定豚鼠血清和阴道洗涤物中gD-特异性抗体的数目，用rgD2t作外包抗原。3.1.1检查血清中对rgD2t具有特异性的IgG抗体每一小孔中用50μl抗原和抗体溶液。用PBS将抗原稀释到其浓度为1μg/ml，并于4℃下将其吸附(过夜)到具96小孔的微量滴定板的小孔中(MaxisorpImmuno-plate，Nunc，Denmark)，用PBS吐温0.1％(洗涤缓冲液)冲洗吸附抗原的小孔5次，于37℃下用含1％牛血清白朊、4％新生牛血清和0.1％吐温的PBS(饱和缓冲液)孵育1小时。用所说饱和缓冲液将血清稀释3倍(开始以1/100的比例稀释)后加到rgD2t涂复的小孔中，再于室温下孵育2小时。把所说板按如上所述方法洗涤后用饱和缓冲液将生物素结合的绵羊抗豚鼠IgG(IgG1和IgG2Specific，Serotec，SoparBiochem.，Belgium)稀释(1/3000)后加到每一小孔中，于37℃下孵育1小时30分钟。洗涤后加入经饱和缓冲液按1/1000比例稀释的生物素基化的抗生蛋白链菌素过氧化物酶配合物(Amersham，UK)，于37℃下培育30分钟，按如上所说方法洗涤各孔后，用邻苯二胺(Sigma0.04％)、H2O2(0.03％)的柠檬酸(0.1M)缓冲溶液(pH4.5)进行培育。加入2MH2SO415分钟后显色反应即停止，在492nm处读出吸收度。ELISA效价定义为产生吸收度(在492nm处测定的光密度等于最大吸收度的50％(中点效价))血清稀释度的倒数。ELISA效价系采用计算机程序，用4参数线性回归分析计算的。3.1.2阴道洗涤物中对rgD2t具有特异性的IgG抗体的测定按如下方法，先用ELISA对阴道洗涤物标定其总的IgG含量。于4℃下，用经PBS稀释的1μg/ml(每个小孔50μl)经纯化的山羊抗豚鼠IgG(Sigma，Belgium)涂复Maxisorp免疫板过夜，洗涤该板，按上述方法用饱和缓冲液进行培育。用饱和缓冲液按2倍稀释度(开始以1/100稀释)连续稀释阴道洗涤物，然后将其加到所说板上。在每一板上包括经纯化的豚鼠IgG(Sigma，Belgium)标准曲线(2倍稀释，开始以100ng/ml的浓度)。于室温下培育2小时后，按如上方法洗涤该板，将用饱和缓冲液稀释(1/1000)的对豚鼠IgG1和IgG2具有特异性的生物素结合的绵羊抗体(Serotec，SoparBiochem，Belgium)加到每一小孔中，于37℃下培育1小时30分钟。然后按上述(3.1.1)的方法进行操作(加入生物素基化的抗生蛋白链菌素过氧化酶配合物和显色)。用计算机程序，通过4参数单线性回归分析法，由IgG标准曲线确定阴道洗涤物中存在的总的IgG浓度。在标定其IgG总含量后，再用描述过的抗-gD抗体血清量同样的ELISA来试验阴道洗涤物以证明对rgD2t具有特异性的IgG抗体的存在。其结果是用光密度(在492nm、0.5μg/ml总IgG)表示的。3.2中和反应测定按如下方法进行96个小孔形式的中和反应测定直接在96小孔的板(25μl/小孔每一血清稀释物，两份)中直接配制试样(连续2倍稀释)。将50微升含4000pfu病毒HG52和补体(最后在小孔中以1/100稀释)的混合物加到每一小孔中，该板于37℃下培育1小时，然后将100微升BHK21细胞悬浮液(4×105个细胞/ml)加到每一小孔中(4×104/ml个细胞)。在1000rpm的转速下，将所说板离心处理5分钟，于37℃、7％CO2存在下培育5天。培育后，慢慢除去培养基并于每一小孔中加入100μl结晶紫(CristalViolet)溶液(10％甲醇，90％H2O、0.3％结晶紫)，室温下培育20分钟，用自来水充分洗涤所说板，用显微镜即可容易监测到空斑的存在。中和效价定义为最高血清稀释度(此时未观察到病毒空斑)的倒数(100％保护细胞病变作用)。此时在对照小孔中观察到细胞全部致病作用(细胞单层100％溶解)，注意这一点是重要的。3.3迟发型过敏反应(DTH)正如通过诱发迟发型过敏反应测量那样，对不同rgD2t制剂进行实验以测定其诱发T细胞特异免疫应答的能力。此实验中。使用为第一次实验所制备的佐剂制剂，这些制剂每0.25ml剂量含5μgrgD2t，免疫接种按如下程序进行初级免疫接种经肌肉注射0.25ml免疫制剂；加强免疫接种21天后，经肌肉注射0.25ml免疫制剂；皮肤实验8天后，经真皮内给5μgrgD2t(含盐水中)用盐水对所有豚鼠进行皮试对照试验。此外，对照组豚鼠(未免疫接种的动物)也用rgD2t进行了皮试。24和48小时后，在真皮注射处监测到红斑和硬结。3.4豚鼠阴道内实验LRStanberry等人在“J.ofInfectiousDisease”(1982，146397-403)和“Intervirology”(1985，24226-231)中对豚鼠生殖器感染HSV模式已作了披露。简言之，最后免疫接种后两周时，阴道内滴注HSV2菌株MS105(pfu)以攻击豚鼠；在攻击后12天期间，每天观察外生殖器皮肤损害的发生率及严重程度以监测原发性感染的临床病程。病毒攻击后5天时，收集阴道拭子，并按下述方法进行空斑测定以滴定传染性的HSV2。然后从13到60天每天对动物进行检测以确定复发的疱疹损害的发生率。按0-4的损害级评级(0无损害或暗红色；0.5暗红色；1水疱；1.5为≥4个小水疱；2较大水疱；2.5由等级2那样的较大水疱融合所产生的几个大水疱；3水疱的大小和数目均有增加；3.5损害复盖了生殖器皮肤的全部外表面；4有浸渍的溃疡损害)来描述外生殖器皮肤上的疱疹损害。按下面定义的标准来评价用不同的rgD2t疫苗所提供的保护程度。原发疾病(0-12天)保护如观察到有下述损害则认为动物未受到保护任何时候有一个以上的红区；一个红区在同一区域至少连续持续3天(0.5级损害)；一个或几个水疱(≥1级损害)。复发疾病(13-60天)保护假如观察到0.5级损害至少连续持续2天或在任何时候观察到其损害级≥1，均认为该动物复发疾病为阳性。复发疾病发作于无任何损害或暗红色前后一天。动物损害的严重程度是由原发感染期间(1-12天)测定的级别值之和来计算的。损害发生率表示观察期间(1-12天[原发疾病]或13-60天[复发疾病])损害等级≥1的动物数目。3.5阴道拭子的病毒效价病毒攻击后5天时收集阴道拭子，用带有藻酸钙并预先在加有2％胎牛血清，2mMl谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100μg/ml庆大霉素和1μg/ml两性霉素B的BasalEagle的介质(拭子介质)中浸湿的拭子拭抹阴道穹窿。把每一拭子弄破后放入有1ml拭子介质的无菌的12×75mm的5ml同质异晶聚合物管内。为了取出所说病毒，将该试管涡流处理，并冷冻直至使用。为了测定其效价，于37℃下，将每小孔有5×105个细胞的6小孔培养板培养过夜。解冻后用拭子介质制备样品连续稀释液。除去该6个孔中的培养基后，将每个稀释样品(200μl)分两份转移到细胞单分子层上并在37℃下保持一小时。于每一小孔中加入含1.5％羧甲基纤维素的培养基4ml，然后在37℃下培养该板2天。培养期后，缓缓除去培养基，于15分钟内向每一小孔中加入1ml结晶紫溶液(10％甲醇、90％水、0.3％结晶紫)，然后对该板进行彻底清洗并数空斑数，用pfu/ml表示HSV2效价。4.结果在第一组实验中，用由四种不同的制剂配制的低剂量的抗原(5μgrgD2t)对几组豚鼠免疫接种。为了选择更有效的rgD2t佐剂组合物应选用最适宜的抗原剂量，所说更有效佐剂组合物对豚鼠给药后再进行阴道内接种HSV2时应能提供保护使之免患原发或复发HSV疾病(预防效价)。4.1诱导体液免疫接种如表1所示，经用含3D-MPL作为免疫刺激物的rgD2t制剂接种的实验组比用rgD2t/明矾疫苗免疫接种的组在其血清中表现出较高的ELISA和中和效价。用rgD2t3D-MPLO(油)/W(水)(R)或rgD2t明矾3D-MPL免疫接种3次后诱导出可靠的平均中和效价。4.2诱导效应基因T细胞应答(DTH)皮试结果(表2)表明用3D-MPLO/W乳液配制的rgD2t诱导的DTH应答最强。rgD2t明矾3D-MPL也诱导特异DTH应答。用鼠作的类似实验也表明与rgD2t明矾制剂对照，在诱导体内效应基因T细胞应答中，rgD2t同明矾和3D-MPL一起使用效果非常好。4.3接种对HSV原发疾病的影响在第三次免疫接种后两周，用HSV-2对豚鼠进行阴道内攻击。接种对原发HSV-2感染临床及病毒进程的影响示于图1中，摘录于表3中。与感染及患急性原发疾病的对照组(4-6组)相比，对皮肤损害发生率及严重程度的监测表明经rgD2t3D-MPL油/水制剂接种的全部动物未发生疱疹病。而且攻击后5天，如经阴道病毒滴定的测定的那样，这些动物的阴道内无任何病毒复制。经rgD2t/明矾3D-MPL接种的实验组也获得了十分类似的结果，观察期内这组动物从未发生疱疹水疱(损害级＜1)。而且，在收集的阴道拭子中能检测出其量极小的病毒复制，相反，用吸附于明矾上的rgD2t接种的动物受到的保护极差(皮肤损害率为75％)。4.4接种对HSV病复发的影响结果图示于图1、摘录于表4中。用含3D-MPL的rgD2t制剂接种的实验组(1和2组)大大改变了疱疹病的复发，这两组比对照组或rgD2t明矾处理的组的复发率及复发天数要少得多。为了对影响含3D-MPL预防rgD2t疫苗的效力的因素进一步进行评价，用更多豚鼠进行第二组实验。比较两种抗原剂量(5和20μg)并用不同的佐剂组合物进行实验。分别在0，28，84天时给药共进行三次免疫接种。每两周对动物抽血以通过ELISA和中和反应测定个体抗体。第二次免疫接种后收集阴道洗涤物并进行实验以证明有对rgD2t具有特异性的全身性抗体存在。诱导体液免疫从表5中可以看出含3D-MPL的所有rgD2t制剂均能在豚鼠血清中刺激高的ELISA和中和效价。免疫接种后三次诱导的平均ELISA和中和效价同含5Mg或20μgrgD2t的rgD2t制剂接种的实验组的血清中效价是非常相似的。同含50μg3D-MPL(第VI组)或100mg3D-MPL(第X组)的rgD2t明矾疫苗免疫接种的实验组中测定的体液应答差别不大。令人感兴趣的是所有接种组的阴道洗涤物中均能检测出全身性抗-rgD2t抗体(IgG类)。此种粘附的抗-rgD2t抗体应答由于在原发感染期间在生殖器道内降低了传染性病毒的负荷而起着重要的保护作用。接种对HSV原发病的影响第三次免疫接种后两周时用HSV2在阴道内攻击豚鼠。接种对原发HSV2感染的临床和病毒学过程的影响摘录于表6中。和对照组进行比较即可发现，用含50μg或100μg3D-MPL(VI和X组)的5μgrgD2t明矾3D-MPL制剂接种的动物，皮肤损害的严重程度(P＜0.05)及皮肤损害发生率均大大降低了。用5μgrgD2t的3D-MPLO/W乳液接种的组(III组)也观察到了十分类似的结果。攻击后5天，在三个接种组中收集的阴道拭子中均可检测出病毒复制非常低。接种对HSV复发病的影响该结果列于表6中。和对照组比较，可发现三个接种的实验组中皮肤损害发生率及复发天数均大大降低了(P＞0.05)，其复发发作次数也比对照组低。5.结论从实验豚鼠获得的结果清楚表明在HSV2接种前对豚鼠投药时，用含3D-MPL的水包油型乳液得到的rgD2t制剂或同氢氧化铝结合使用免疫接种时对于提供保护以免患原发和复发HSV2病是非常有效的。这种rgD2t3D-MPL制剂能够改善特异性体液(中和抗体)和效应基因细胞介导(DTH)的免疫应答。用低剂量的rgD2t(5μg)即能获得这些结果。6.gD2t制剂在灵常类中的免疫原性6.1rgD2t/明矾和rgD2t/明矾3D-MPL型免疫原性的比较用南非小猿aethiops(AfricanGreen猿，AGM)评价rgD2t/明矾和rgD2t/明矾3D-MPL疫苗的免疫原性。在0，1，3个月时进行了三次免疫接种，测定特异性体液(ELISA和中和效价)及效应基因细胞介导(DTH)的免疫应答。6.1.1实验步骤每种制剂一剂含20mgrgD2t和0.5mg等量Al3+，一剂用50μg3D-MPL。分别在0，28和84天时，对南非小猿aethiops(AGM)免疫接种3次。经肌肉注射一剂(0.5ml，20rgD2t)进行免疫接种。每±2周进行抽血以通过ELISA和中和检测以测定抗体。正如用诱导迟发型过敏反应(DTH)应答进行测定那样，也实验了该两种制剂诱导T细胞介导免疫的能力。第二次免疫接种后13天，对猿经真皮内在腹部以不同剂量的rgD2t给药(每剂在含盐水中含20，5和1μgrgD2t)。也对这些猿仅用含盐水进行皮试以作对照用。24和48小时后在真皮内注射处监测红斑和黑色硬结。6.1.2结果a)诱导体液免疫性接种前，猿的血清未表现出任何抗HSV2抗体活性(数据未示出)。如表7所示，二次免疫接种后诱导出有效的ELISA和中和效价。rgD2t/明矾接种的猿的抗体应答并未随第三次免疫接种而加强，相反，接受第三次rgD2t/明矾3D-MPL免疫接种的猿ELISA和中和抗体应答均提高了(平均ELISA效价10056；平均中和效价950)。b)诱导效应基因T细胞应答(DTH)同rgD2t明矾制剂不同，皮试结果(表8)表明当rgD2t同明矾+3D-MPL-道使用时对于诱导体内效应基因T细胞应答是非常有力的。所有rgD2t明矾3D-MPL接种的动物，用20mgrgD2t进行皮试时，观察到DTH应答很强。在大多数猿(3/4，5μg剂量，2/4，1μg剂量)中也用较低浓度gD2t(5和1μg)测定特异DTH应答。这样剂量的rgD2t比20mgrgD2t浓度诱导的皮试应答要弱。6.2rgD2t/明矾3D-MPL于恒河猿的致免疫力用恒河猿进行实验以比较含不同rgD2t剂量(100μg、10μg、或5μg)的rgD2t/明矾3D-MPL疫苗的致免疫力。6.2.1实验步骤每种制剂每剂含0.5μg当量Al3+和50μg3D-MPL。按如下方法在0，28和77天时对三组恒河猿(每组4只)免疫接种三次第1组100μgrgD2t明矾+3D-MPL(50μg)第2组20μgrgD2t明矾+3D-MPL(50μg)第3组5μgrgD2t明矾+3D-MPL(50μg)肌内注射一剂1ml以进行免疫接种，每±2周抽血以用于ELISA和中和作用测定检测抗体。6.2.2诱导体液免疫接种前，任何猿的血清均无任何抗HSV2抗体活性。在接受100，20和5μg/gD2t(明矾中)+3D-MPL三组接种猿中观察到ELISA和中和效价均良好(数据未示出)。6.3结论从南非小猿aethiops获得的结果清楚表明含明矾和3D-MPL的rgD2t疫苗大大改善了体液(中和抗体)和效应基因细胞介导(DTH)特异性免疫应答。同此种疫苗相比，rgD2t明矾制剂诱导中和抗体的能力较低并且不能诱导体内DTH应答。从恒河猿获得的结果也表明rgD2t明矾+3D-MPL制剂诱导特异体液应答十分有效，甚至于抗原剂量低(5μg或20μgrgD2t)也是如此。7.总的结论用豚鼠进行实验获得的结果清楚表明含3DMPL水包油乳液的佐剂制剂或与氢氧化铝结合，用重组HSV糖蛋白疫苗，使用经豚鼠阴道内攻击动物模式诱导保护性免疫应答十分有效，即使在抗原剂量很低(5μgrgD2t)时也是如此。保护数据也表明rgD2t3D-MPL制剂在提供保护方面比较有力。这种3D-MPL制剂也能改善特异性体液(中和抗体)和效应基因细胞介导(DTH)的免疫应答。而且也表明该rgD2t明矾3D-MPL制剂在抗体水平上改善致免疫力，并在灵长类中诱导效应基因T细胞应答，表明该佐剂的作用并不只限于小的动物。表1经rgD2t制剂免疫接种的豚鼠血清在病毒攻击前后的抗HSV抗体应答</tables>(1)rgD2t剂量＝5μg在0，28和95天时免疫接种三次的动物，二周后这些动物以105pfuHSV2攻击。(2)攻击前一天收集的血清(＝第三次免疫接种后14天)。(3)攻击后二周收集的血清。按算术平均效价±SD给出的数值。表2经rgD2t制剂接种的豚鼠的皮肤试验结果</tables>用5μgrgD2t制剂在0天和21天对豚鼠免疫接种(肌内)，29天时经真皮内接种5μgrgD2t含盐水在24及48中时时测得的皮肤实验结果。E＝ID注射处红斑(mm为单位)I＝ID注射处硬结(mm为单位)N＝皮肤试验处坏死表3豚鼠免疫接种rgD2t制剂对原发HSV2感染临床和病毒学病程的影响</tables>(1)rgD2t剂量＝5μg，在0，28和95天时进行三次免疫接种。2周后用105pfuHSV2攻击接种后的动物。(2)在12天的观察期间内，动物的损害等级大于1的数量。(3)1-12天内总的损害级数，算术平均值±SD。(4)攻击后5天收集的阴道拭子进行测定得到的最大HSV效价(pfu/ml)。表4免疫接种rgD2t制剂对豚鼠生殖器HSV2病复发的影响</tables>(1)rgD2t剂量＝5μg.在0，28和95天时分别对试验动物进行3次免疫接种，2周后用105pfuHSV2攻击这些动物。(2)在13-60天的观察期间内试验动物的损害≥1的数目(3)无损害前后一天一次复发发作，其特点是至少2天有红斑(等级＝0.5)或一天有水泡(级数≥1)结果是用算术平均值±SD表示的(观察期13-60天)。(4)实验动物复发泡疹的发作总天数，用算术平均值±SD表示(观察期13-39天)。表5不同佐剂制剂对豚鼠rgD2致免疫力影响的比较</tables>(1)在0，28和84天时对实验动物免疫接种三次，两周后用105pfuHSV2攻击动物。(2)第二次免疫接种后14天收集血清和阴道洗涤物。(3)攻击前一天收集血清(＝第三次免疫接种后14天)。(4)给出的值为算术平均效价±SD(5)相当于光密度(492nm处)每0.5μg/ml总IgG(用标准抗gD2tELISA实验测定的算数平均值±SD。表6免疫接种rgD2t制剂对豚鼠HSV2感染的临床和病毒学病程的影响</tables>实验步骤在0，28和84天时各免疫接种一次。最后免疫接种后二周用105pfuHSV2攻击原发HSV2感染(攻击后观察期4-12天)皮肤损害发生率(％)有水疱(或多个)(损害级别≥1)的动物数皮肤损害严重程度损害级别的和(4-12天)，算术平均值±SD阴道病毒效价激发后5天收集的阴道拭子中的病毒效价(pfu/ml)复发HSV2感染(观察期天数攻击后13-39天)皮肤损害发生率(％)有水疱(多个)(损害级别≥1)的动物数(％)复发天数动物复发疱疹病的总天数算术平均值±SD。若至少连续两天记录的损害级别为0.5(红斑)或若在任一天观察到损害级别≥1(水疱(或多个))则认为动物有复发病(显阳性)。复发发作数算术平均值±SD表7用GD2t明矾或GD2t明矾3D-MPL接种的非洲绿猿的DTH结果</tables>在0和28天时用20μggD2t制剂(肌内注射)免疫接种的猿，13天后用不同剂量的gD2t的盐水在腹部经真皮内对其给药，24和48小时时记下皮试数据。EID注射处红斑I在ID注射处硬结ND＝未做表8GD2T明矾和GD2T明矾3DMPL制剂对非洲绿猿致免疫力的比较血清学应答每剂疫苗含20μggD2tELISA效价＝中点效价NEUT效价＝对细胞致病影响达到100％保护的最高血清稀释度的倒数权利要求1.HSV糖蛋白gD或其免疫学片段与3-脱酰单磷酰基脂A的混合物在制备用于预防或治疗HSV感染的药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种新的单纯疱疹(HSV)疫苗制剂。该制剂包括HSV糖蛋白gD或与3脱酰单磷酰基酯A结合的免疫学片段。文档编号A61K39/245GK1201692SQ9810393公开日1998年12月16日申请日期1998年1月5日优先权日1991年3月21日发明者M·弗朗科特,J·P·普里尔斯,M·施劳维,N·M·J·C·加尔松－约翰逊申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司