专利名称：诊断和治疗癌症的方法以及鉴定正常细胞样品中致病标记的方法
技术领域：
本发明涉及转化细胞，如癌细胞的分子或标记的鉴定。还涉及鉴定与病理状况，如癌相关分子的方法。
背景和现有技术现已确信，很多病理状况，如感染、癌症、自体免失调等，其特征在于某些分子不恰当地表达。因此这些分子可以作为特定病理或者异常状态的标记。除了用作诊断“靶”外，即鉴定为诊断这些异常状态的标记物外，这些分子还可用于产生诊断和/或治疗剂的试剂。一个非限制性的这种实例是癌标记用于生产一种对特定标记特异性的抗体。而另一个非限制性的实例是一种与主要组织相容性复合体分子(MHC)复合的肽，用于产生抗异常细胞的溶细胞性的T细胞。
当然，制备这些物质必须先有用于产生这些物质的试剂资源。从细胞中纯化是一种费力而很不可靠的方法。另一种优选的方法是分离编码一种特异标记的核酸分子，然后用这种分离的编码核酸分子来表达目的蛋白质分子。
到目前为止，已采用了二种策略来检测这种抗原，如在人类肿瘤中的抗原。这些将会涉及到遗传方法和生化方法。遗传方法的例子可见作为参考文献引用的dePlaen等人的在Proc.Natl.Sci.USA852275(1988)中的描述。这种方法中，从一个肿瘤中得到的一个cDNA文库的几百个质粒库已被转染到受体细胞，例如COS细胞，或者转染到肿瘤细胞系的抗原阴性变异株。由抗肿瘤的溶细胞性T细胞克隆通过其刺激反应的能力来筛选表达肿瘤抗原的转染子。生化方法的实例可见作为参考文献引用的Mandelboim等人在Nature 36969(1994)中的描述，它以酸性洗脱结合到肿瘤细胞I型MHC分子上的肽，然后用反相高效液相层析(HPLC)分离为基础。抗原肽经过与抗原加工缺陷型的突变细胞系的空载I-型MHC分子结合并诱导与细胞毒T淋巴细胞的特异反应后而被鉴定。这些反应包括诱导溶细胞性T细胞系(CTL)增生肿瘤坏死因子(TNF)的释放和靶细胞的溶解，可以用MTT检测法或51Cr释放测定法进行检测。
这二种研究抗原分子的方法有以下缺点首先，这些方法极不方便，既费时又昂贵；第二，这些方法依赖于建立预先确定其特异性的溶细胞的T细胞系(CTL)；第三，由于根据其T细胞的所有组成类型，各CTLs既可从具有不同疾病的病人中得到，也能从健康人体得到，因此它们与体内该疾病的病理过程的相关性尚没能得到证实。
这二种已知的抗原鉴定和分子定义的方法的内在问题由下面事实来说明，迄今这二种方法只是对非常少的人肿瘤新抗原的限定方法获得了成功。可参见下列文献，van der Bruggen等人，Science 2541643-1647(1991)；Richard等人，J.Exp.Med.178489-195(1993)；Coulie等人，J.Exp.Med.18035-42(1994)；Kawakam；等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913515-3519(1994)。
此外，上述方法还依赖于所需肿瘤类型的已建立的永久细胞系的可得性。从某种肿瘤类型建立细胞系非常困难，参见Oettgen等人，Immunol.Allerg.Clin.North.Am.10607-637(1990)。我们也知道，有些上皮细胞类肿瘤在体外对CTLs不太敏感，因此不能用常规的分析方法。这样一些问题促进本领域中发展其它方法来鉴定肿瘤相关抗原。
一个主要的方法参见作为参考文献引用的Sahin等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9211810-11913(1995)中的描述。也可参见作为参考文献引用的美国专利申请系列号08/580,980，现已授权的美国专利号5,698,396和系列号为08/479,328的专利申请，其申请日期分别是1995年6月7日和1996年1月3日。总之，该方法包括，在原核宿主中表达cDNA文库(这些文库是从肿瘤样品中获得的)。然后，通过吸附和稀释血清以进行免疫筛选所表达的文库，从而检测能引起高效价体液应答的抗原。这种方法称为SEREX方法(用重组表达克隆进行抗原的血清学鉴定)。该方法已用来证实已鉴定过的肿瘤相关抗原的表达，也用于检测新抗原。可参考上述的专利申请和Sahin等人的，出处同上，以及Crew等人在EMBO J1442333-2340(1995)中的描述。
SEREX方法在食道癌样品中已得到应用，现在已鉴定出一种食道癌相关抗原，并分离和克隆了其编码核酸分子，可参考本文作为参考文献引用的申请日为1996年10月3日的系列号为08/725,182的美国专利申请。
一些肿瘤相关基因与基因三联体，即称为SSX基因之间的关系正在研究之中。参见Sahin等人，出处同上；和Tureci等人，CancerRes.564766-4772(1996)。已鉴定出一个这样的SSX基因，称为SSX2，起初作为在70％滑液肉瘤中存在的涉及染色体易位事件(t(X；18)(p11.2；q11.2)的二个基因中的一个被鉴定。参见Clark等，NtureGenetics 7502-508(1994)；和Crew等，EMBO J 142333-2340(1995)。后来发现这种基因在很多肿瘤细胞中都有表达，现在认为是由Tureci等出处同上所述的称为HOM-MEL-40的肿瘤相关抗原。迄今为止，发现其只在肿瘤细胞和正常睾丸中表达。由于它们只在肿瘤细胞和睾丸细胞中表达，因此它与肿瘤抗原“CT”家族中其它成员平行。Crew等人也分离并克隆了与SSX2具有89％核苷酸序列同源性的SSX1基因，参见Crew等，出入同上。针对鉴定SSX基因的其它工作又已鉴定出SSX3，可参考Deleeuw等人在Cytogenet.Genet 73179-183(1996)中的描述。鉴于SSX的出现平行于其它CT抗原的事实，本发明人相信其它的SSX基因也可分离出来。
对上述的SEREX技术经改良，并结合其它技术，现已用来克隆了二种其它的SSX基因，称为SSX4和SSX5，以及SSX4基因的一种可变剪接变体。该工作在作为参考文献引用的1997年5月5日申请的美国专利号为08/851,138以及在也作为参考文献引用的Chen等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941914-1918(1997)中都有描述。
许多标记只在正常睾丸和肿瘤细胞中发现，而在其它正常细胞中没有发现的事实表明，在这方面进行进一步的研究将会找到其它的相关分子。但是，至今发现的这些分子的多样性并不能对可能会发现的其它分子的特征提供任何指导。
本文公开的本发明前的大多数工作，所用的都是来自癌细胞的cDNA文库。正如本文所开发的，现在已表明也可用非转化的，或正常细胞来源的而以前来源于癌细胞的cDNA文库来检测这种分子。令人惊奇的是，过去完全假定肿瘤标记只在癌细胞中表达，现在表明情况并不完全如此。对各种血清样品，如自体血清所筛选出的睾丸细胞文库是一个有用的正常细胞文库的例子。
上述的SEREX方法已被证实在鉴定感兴趣的分子方面非常有用。然而本发明人发现，当小的cDNA分子是一个给定文库中感光趣的分子时，这种鉴定方法并不理想。鉴定小cDNA分子的方法是本文所述的本发明的一个方面，这些小cDNA分子与本文所讨论类型的病理学相联系是令人感兴趣的。
联会丝复合蛋白1(下文称为“SCP1”)是一种与精母细胞减数分裂前期相关的蛋白质。编码鼠SCP1的基因已定位到染色体1p.12-p.13，可参见作为参考文献引用的Sage等人在Biochem.Biophys.Acta1263258-260(1995)中的描述。据报道，人类SCP1只在睾丸中表达，可参见作为参考文献引用的Meuwissen等人在EMBO J115091-5100(1992)中的描述。
Meuwissen等，出处同上描述SCP1蛋白质是联会丝复合体的主要组分，是减数分裂前期同源染色体间形成的一种三联大分子聚合体。参见Wettstein等人在Annu.Rev.Genet 3331-413(1984)和Heyting等人在Genome 3181-89(1986)中的描述。这种蛋白质更详细的报道可参考下列文献，Meuwissen等人，Genomics 37101-106(1997)；Gillies等人，Curr.Trac.Lab.Carlsberg 40135-161(1975)；Schmekel等人，Exp.Cell Res22620-30(1996)；Moses等人，Symp.Soc.Exp.Biol.38245-270(1984)；Carpenter，Bioessays 6232-236(1987)；Loidl等人，Genome 33759-778(1990)；Moens，Bioessays 16101-106(1994)；Roeder，Trends Genet6385-389(1990)。
SCP1的基因定位与以前鉴定的所有睾丸癌抗原(CTAs)不同，后者定位于X-染色体上。
现已发现，SCP1在肿瘤细胞中表达，特别是在肾癌细胞、神经胶质瘤和乳腺癌中表达。但在除睾丸细胞外的其它正常细胞中不表达。因此，它用作一种CTA，但其区别在于它不仅在黑素瘤中而且在上述那些肿瘤类型中都有强烈表达。
这在转化细胞的诊断和治疗方法上都具有重要意义，这可从下面的描述看出。这种分子也与正常减数分裂相关的事实表明该分子与染色体复制、细胞分裂和癌变发生之间具有重要的联系。
优选实施方案的详细描述实施例1通过一些实验已鉴定并分离出只在睾丸细胞中发现(因此这些基因只在睾丸细胞中表达)的与mRNA相应的cDNA。为此，用一种方法产生在人类睾丸细胞特异性表达的cDNA片段，该细胞从无肿瘤的病人分离出的活体解剖物而获得。这种方法可参考作为参考文献引用的Diatchenko等人在Proc.Natl.Acad.Sci UAS936025-6030(1990)中的描述。具体地说，分别从二个不同的睾丸组织样品中提取2mg的mRNA，用作测试探针。经过从十种健康组织样品(结肠，胃，脑，休眠的和激活的外周血单核细胞，骨骼肌，肝，肾，肺和皮肤)提取的mRNA合成cDNA来获得引发cDNA。测试探针和引发cDNA经杂交后，按Diatchenko等，出处同上进行抑制扣除杂交PCR。然后用所得到的分离片段来分离全长转录物。为此，用同样的cDNA(即正常的睾丸文库)，使用5mg的mRNA来构建cDNA噬菌粒文库。产生含4×106个原始克隆的文库，经过标准分离程序后，将噬菌粒文库杂交到硝酸纤维素膜上，再用上述片段进行印迹。印迹之后，冲洗膜，结合到固定化cDNA上的噬菌粒都可洗脱下来。洗脱的全长分子用已知的方法来制备双链cDNA，这种cDNA再连接到预处理的载体上，然后用来转染和扩增。得到400,000个重组子的表达文库。
实施例2在创建上述的表达文库之后，进行免疫筛选实验以检测肿瘤病人血清中抗该文库的表达产物的IgG是否存在。为此，将患有肾细胞癌病人的血清样品稀释到1∶100，再从200,000个重组体中进行筛选，参考作为参考文献引用的Tureci等在Cancer Res 564766-4772(1996)和美国专利号5,698,396中的描述。用抗人体的Fc特异性的碱性磷酸酶标记的抗体进行温育，然后按已知的方法用染料5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和氮蓝四唑来显色，可以观察到反应性克隆。在所述筛选的200,000个克隆中，有5个呈阳性，并发现其中有三个克隆与以前鉴定的蛋白质，即SCP1有部分相同性，这种蛋白在精母细胞减数分裂前期特异性表达，并与同源染色体配对行为相关，是减数分裂I中产生单倍体细胞所必需的。这三株阳性克隆经测序发现它们相应于SCP1的核苷酸726-2401，147-2728和634-2462，但是几个位点处的氨基酸有变化，例如在225位由TTT取代CAT，导致由F代替H，在226位谷氨酰胺取代甘氨酸(GAG替代GGG)。这表示第716、767、768、771位核苷酸发生了变化。在第208位也有变化，但这是一个沉默突变。SCP1的序列见SEQ ID NO1所示，可参见作为参考文献引用的Meuwissen等在Genomics 37101-106(1997)中的描述。
实施例3通过实验来检测SCP1分子在正常组织中是否表达。这可通过Northern印迹法和RT-PCR来检测。Northern印迹法参见作为参考文献引用的Chomczynsky等在Anal.Biochem 72248-254(1976)中的描述。详细过程如下，从各种组织样品中取出mRNA，经福尔马林/MOPS胶电泳检查其完整性，然后从各样品中取10mg印迹到尼龙膜上，进行预杂交，然后与32p标记的由SCP1的2715-3264核苷酸(SEQ ID NO1)组成的cDNA的探针一起温育。特别是该探针在含50％甲酰胺、6×SSC/、5×Denhardt’s和0.2％SDS的溶液中在42℃条件下杂交过夜。用逐趋严格的条件冲洗膜，最后在65℃用含1×SSC、0.2％SDS的洗液冲洗，在-70℃下放射自显影达7天。
通过提取总RNA，用寡聚-dT(18)来引导，然后进行逆转录来完成RT-PCR。所用的引物如下5’-GTACAGCAGA AAGCAAGCAA CTGAATG(SEQ ID NO2)和5’-GAAGGAACTG CTTTAGAATC CAATTTCC-3’(SEQ IDNO3)所预期的引物大小是564碱基对。
睾丸是唯一的检测呈阳性的正常组织样品。
上述的RT-PCR流程也可用于肿瘤组织样品。这些结果在下面表格中列出。Northern印迹法证实了用肾癌、乳腺癌和神经胶质瘤样品测定所得出的结论。
实施例4按照Maniatis等，分子克隆实验手册(冷泉港实验室，1982年)所述用Southern印迹进一步实施上述分析法。简而言之，核酸内切酶Hae III用于从睾丸和外周血淋巴细胞中提取的DNA。等量的样品经染色、紫外灯下显影检查，然后在含6×SSC、4×Denhardt’s和5％SDS溶液中与SCP1的全长cDNA进行杂交，接着冲洗并进行放射自显影，如上所述。
所得到的带型显示这些基因是一个基因家族，而不是一个单基因。
实施例5进行最后一组实验以检查SCP1蛋白的存在。经过Western印迹做到这点。采用SCP1特异性的免抗血清，参见作为参考文献引用的Schmekal等在Chromosoma 102682-692(1993)中的描述。细胞裂解产物(每个泳道10μg)与2×SDS样品缓冲液(0.1M Tris-Hcl，PH6.8，0.2M二硫苏糖醇，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)混和，在12％SDS凝胶上通过PAGE电泳，然后印迹到尼龙膜上。在TBS中用5％的脱脂乳封闭膜1小时，以封闭非特异性的结合，然后用1∶100稀释的兔一抗SCP1抗血清温育膜。接着将印迹与碱性磷酸酶缀合的抗IgG一起温育1小时。每次温育后用TBS和0.01％的吐温洗膜。用与前面相同的方式监测阳性反应。
在正常睾丸细胞和肿瘤细胞的裂解物中检测到一种大小为125kDa的蛋白质，而在其它样品中没有检测到这种蛋白，这表明SCP1是肿瘤细胞的一个标记。
实施例6由SCP-1基因编码的蛋白的氨基酸序列经分析，其肽的序列相应于HLA结合基序。使用作为参考文献引用的Parker等，J.Immunol.142163(1994)教导的算法可做到这点。在下表中列出了氨基酸序列、推测可能与其结合的HLA分子和在SCP-1上的位置。产生的复合物可激发溶细胞性的T细胞应答。这可由本领域的技术人员按，例如作为参考文献引用的Van der Bruggen等，J.Eur.J.Immunol.243038-3043中(1994)教导的方法来测定。MHC分子肽 位置A1 NSEGLSRVY 98-106A1 SSELEEMTK 416-424A1 EVELEELKK 430-438MHC分子 肽位置A1CTEDDFEFPF41-50A1NIDSDPALQK61-70A1RTEQQRLENY392-401A1IADEAVKLQK685-694A1IAEMVALMEK704-713A2KLYKEAEKI 108-116A2KLQENRKII 133-141A2KMITAFEEL 220-228A2VVTEFETTV 376-384A2VELEELKKV 431-439A2VLGEKETLL 439-447A2LLQAREKEV 470-478A2RMLTQIENL 554-562A2NLQETETQL 561-569A2QLNVYELKV 632-640A2NLLEEVEKA 674-682A2KMREDRWAV 947-955A2ALQKVNFLPV67-76A2FLLEESRDKV287-296A2KLTHJKEVEL424-433A2KQFEKIAEEL451-460A2GLLQAREKEV469-478A2TQLRNELEYV567-576A2KQVENKNKYI603-612A2KQLNVYEIKV631-640A2NVYEIKVNKL634-643A2YLWTSAKNTL835-844A2KLKEAEKLFV964-973MHC分子 肽 位置A3KLSSKRELK 502-510A3NLRKQVENK 600-608A3TLGGDSTFFK27-36A3KLYKEAEKIK108-117A3KMITAFEELR220-229A3LLYDNKQFEK446-455A3KLELELESAK642-651A3LLETPDIYWK797-806A24 VYMDLNSNI 210-218A24 NYEDQLIIL 400-408A24 VYEIKVNKL 635-643A24 LYDNKQFEKI447-456B7AQRKAIQEL 143-151B7ATRHLCNLL 178-186B7TPKKAPSSL 925-933B7DPALQKVNFL65-74B7QAREKEVHDL472-481B7LPKRGQRPKL494-503B7RPKLSSKREL500-509B7KPKLQQRENL859-868B8ELRQKESKL 126-143B8ESRDKVNQL 291-299B8SAKQKFGEI 649-657B8ISKDKRDYL 828-836MHC分子 肽 位置B8 IAKMDRKKKL956-965B35ISKDKRDY 828-835(8MER)B35TPKKAPSSL 925-933B35LPKRGQRPKL494-503B35RPKLSSKREL500-509B35KSKEQEQSSL733-742B35KPKLQQRENL859-868B44TEDDFEFPF 42-50B44KEAEKIKKW 111-119B44AEKTKKYEY 194-202B44TEQQRLENY 393-401B44RELKNTEYF 507-515B44AESKQLNVY 628-636B44EEETLKTLY 903-911B44YEREETRQVY202-211B44AENSRLEMHF232-241B44KENKMKDLTF278-287B44REKEVHDLEY474-483B44KEVHDLEYSY476-485B44DEVKCKLDKS585-594B44LELESAKQKF645-654B44EERKSELGLY723-732B44SEEETLKTLY902-911MHC分子 肽位置B52KQKPFALFV3-11B52LQIATNTIC345-353B52ENYEDQLII399-407B52CQHKIAEMV700-708B52LQKVNFLPVL 68-77前面的实施例证实了本发明的几个特征。它们包括检测样品中的转化细胞，如癌细胞存在与否的诊断方法。这些实施例表明存在一个SCP基因家族，例如SCP-1。因此，本发明特别涉及检测睾丸来源之外的其它样品中的SCP基因的SCP蛋白或者mRNA，其中两者或者两者之一的存在是病理学，例如癌症或者一些其它类型的转化细胞的指标。可实现的典型的诊断分析类型是进行扩增试验，如PCR，或进行免疫测定。特别优选测定SCP-1，作为对乳腺癌，卵巢癌，肾细胞癌或神经胶质瘤的确定。
如上所述，SCP蛋白只与减数分裂专一相关。一般，除了生殖细胞外，其它细胞不经过减数分裂。因此，除了进行减数分裂的生殖细胞外，其它细胞若表达了SCP蛋白如SCP-1，就清楚表明是一种异常现象。据认为，表达了SCP蛋白可促进癌细胞的遗传不稳定性，导致畸形，例如非整倍体，在早期的癌变中出现这种现象。因此，本发明的一个方面是通过分析SCP蛋白或由该蛋白产生的肽来检测异常状况存在的方法，其中，存在这种蛋白或者该蛋白质水平异常(可包括其存在)是异常状况，例如癌症的征兆。有很多方法可用来进行这种分析。例如，如本文所述，在病人样品发现了这种蛋白的抗体。使用例如，本文所述的方法，或者用纯化的SCP蛋白或其抗原片段等方法可测定这些抗体。使用可从样品分离的抗体或用SCP蛋白和标准技术制得的抗体也可分析这种蛋白质本身。这种抗体可按需要标记，并用于标准免疫分析。
类似地，可采用任一或全部核酸杂交系统，包括扩增分析，例如PCR、碱性探针杂交分析等。各种抗体，例如多克隆抗体，单克隆抗体，产生抗体的杂交瘤，重组产生的抗体，其结合片段，杂交试剂盒，DNA探针等都是本发明的另外特征。
其中的任何一种也可用于进行恶化/好转的研究。很清楚，在正常细胞中不存在或者只有低水平表达的SCP蛋白，因此可简单地通过用上述任一或所有方法监测这种蛋白质的水平，其表达等情况来监测涉及SCP表达的异常过程。
很明显，这些方法也能用于跟踪治疗方案的功效。实际上，可以用上述任一分析方法取得SCP蛋白或者待测蛋白的基线值，施用给定的治疗剂，然后再监测蛋白质水平，观察SCP水平的变化作为评估该方案效果的指标。
可用四聚体肽结构来监测这些蛋白质水平，例如下面作为参考文献引用的文献公开的结构，Braud等，Nature 391795-799(1998)；Altman等，Science 27494-96(1996)以及申请日为1998年3月27日的美国专利申请系列号No.09/049,850。
鉴定SCP蛋白与病理状况例如癌症具有相关性，也提供了针对该状况的一些治疗方法。上述实验证实在蛋白质表达时产生了抗体，这表明它可以用作为一种疫苗。因此，本发明进一步的实施方案是通过免疫治疗方法治疗以一个或多个SCP蛋白水平反常或异常为特征的病症。方法之一是施用一定量的SCP蛋白，或者激发或增强免疫应答有效量的来源于该蛋白质的免疫原性肽。该蛋白或者肽可与一种或多种已知的免疫佐剂、共刺激性分子或者MHC辅助结合肽，例如皂苷、GM-CSF、白介素、LIF-3、乳化油如维生素E、热休克蛋白等组合。如果肽太小不足以产生有效的抗体应答，可将其偶联到已知的用于刺激应答的缀合物上。
类似地，免疫治疗法包括施用抑制SCP蛋白有效量的抑制抗体。这些抗体可以是，例如，由上述任一标准方法产生的抗体。
用来源于随后与MHC分子非共价复合的SCP蛋白的肽也可诱发T细胞应答，从而在受试者体内刺激针对任何这类复合物的溶细胞的T细胞增生。还要特别提到，用免疫反应细胞，例如，树突细胞、淋巴细胞或任何其它免疫反应细胞也可在体外诱导T细胞，然后再植入受试者。
注意，也可通过施用预处理以使之成为非增生性的并提呈用于应答的相关T细胞或B细胞表位的细胞来实现产生T细胞和/或抗体。
治疗方法也包括基因治疗，其中优选10到100个核苷酸长度的反义分子施用到受试者体内，既可以用纯的核酸分子也可通过载体，如脂质体，以促进其掺入细胞内，随后抑制这种蛋白质表达。这种反义序列也可掺入到适当的疫苗中，例如病毒载体(如，痘苗)、细胞构建体，如众所周知的BCG疫苗的变体等。
一种另外的基于DNA的治疗方法是通过使用一个含有一种或多种核苷酸序列的载体进行的，最好采用多种核苷酸序列，每种各编码一段来源于表达蛋白的免疫活性肽。可用所有可能的变化来组合这些表达肽的序列，如，一种来自各蛋白，几种来自一种或多种蛋白质，和一种来自各种附加的蛋白，多种来自一些蛋白，以及均不来自其它蛋白等。
其它治疗方法包括施用SCP-1蛋白本身，从其衍生的一个或多个抗原性肽，如实施例6所提供的那些肽以及所谓的多表位疫苗。这些多表位疫苗包括多个抗原性肽，如实施例6中所述的那些肽，优选通过连接序列结合在一起。所得的肽可结合到I型MHC或者II型MHC分子上。这些蛋白、肽或多表位疫苗，可以与合适的佐剂、共刺激分子或结合的辅助肽组合施用。也可以用设计成表达这种蛋白、肽和多表位结构等的遗传构建体形式来施用。肽和多表位结构可用所谓的“小基因”来表达，即设计成表达整个SCP1分子的部分或按上述结合在一起的该分子的各部分的DNA分子。
用药量和给药方式将根据待治疗的病症和个体的不同而有所不同。可使用标准用药形式，如静脉内、皮内、皮下、口服、直肠和经过皮肤用药。关于配方，可将这些蛋白质和/或肽与佐剂和/或载体，如皂苷，GM-CSF、一种或几种白介素、维生素E、FLT-3以及一种或多种热休克蛋白等组合。
当采用核酸治疗方法时，可用各种载体，如痘苗或腺病毒载体。可使用任何能用于真核转染的载体，如转染人细胞的载体。这些载体可用于制备细胞，如树突细胞，在其表面存在有关的肽/MH复合物。这些细胞在用药前可用标准方法使其变成非增生性的。
本发明所用的多表位是几组二个或多个具潜在免疫原性的或者免疫刺激性的肽，它们可用各种方式互相连接起来，以测定这类分子是否可以刺激和/或激发一种免疫应答。
这些肽可以直接结合在一起，或者通过用侧翼序列结合。Thompson等在Proc.Natl.Acad.Sci USA 92(13)5845-5849(1995)中教导了相关表位序列的直接连接。众所周知，多表位可以用作疫苗。参见作为参考文献引用的Gilbert等，Nat.Biotechnol.15(12)1280-1284(1997)；Thomson等，出处同上；Thomson等，J.Immunol.157(2)822-826(1996)；Tam等，J.Exp.Med.171(1)299-306(1990)。特别是在Tam的这篇文献中表明，多表位当用于小鼠模型中时有利于产生抗体和保护性免疫。此外，该文献表明，多表位经消化后可产生由MHCs所提呈的肽。Tam通过显示，CTLs识别由多表位“串”加工的各个单个表位而证实了这点。例如，在测定有多少表位可在多表位中连接，并且还能诱发识别时可使用该方法，这种方法也可用于测定表位不同组合的功效。这些不同的组合可以是为表达肿瘤排斥抗原特定亚型的病人而特制的。这些多表位可作为多肽结构，或通过使用核酸传递系统而导入。本领域有许多不同的方式可用于导入编码单个表位或上述的多表位的DNA分子。例如，参见作为参考文献引用的Allsopp等，Eur.J.Immunol.26(8)1951-1959(1996)。可使用腺病毒、痘病毒、Ty-病毒类颗粒、质粒和细菌等。可在小鼠模型中试验这些系统，以确定哪一种系统似乎最适用于给定的人类的类似情况。在人类临床试验中也可试验它们。
本发明的另一特征是上述SCP-1的突变蛋白形式和其编码核酸分子。这些突变蛋白可与SCP分子同样的方式使用。
本发明也包括一种测定由受试者产生的能引起免疫应答的物质的方法，其中产生来自受试者正常细胞，如睾丸细胞的cDNA文库，将文库的cDNA分子插入到表达载体中，将载体转染进宿主细胞以产生转染的宿主细胞，然后培养这种转染的宿主细胞以表达所需的物质。下一步，裂解细胞形成细胞裂解物，然后将它与含有免疫活性物质的免疫学结合配体的，来自受试者体液的样品接触。该步骤从所说样品中除去了对非转染宿主细胞特异性的免疫结合配体。然后将所得的样品与用不含任何文库cDNA的相同载体转染的宿主细胞裂解样品接触，该步骤除去了对载体产生的抗原具有特异性的免疫结合配体。然后，再将样品与裂解物接触，以使任何特异性结合配体的物质结合上去，此后可测定事实上是否有结合配体已结合到该物质上，从而测定该免疫活性物质。这种方法类似于美国专利号5,698,396所述，除了其文库来自正常细胞，如睾丸细胞。如上例指出的，这类文库可用来鉴定肿瘤抗原。体液样品也可取自和取睾丸细胞(自体血清)同样的受试者，或者取自不同的个体。如申请号为08/580,980的申请所述，这样鉴定的cDNA与结合配体一样可以分离出来。用于转化的有关宿主细胞可以是真核的或者原核的细胞，例如，E.coli，表达载体可以是任何标准表达载体，如病毒载体，噬菌体载体等。所用样品可以是用于生物分析中的任何样品类型，如血清、血脑脊液、尿、粪便样品，组织样品如皮肤等。用这种方法可以鉴定各类抗原，如癌症相关抗原，自体免疫抗原，病原体如病毒相关的抗原等。这种方法可按常规实施，特别是可经过将上述裂解物固定到例如，膜上，如尼龙或纤维素膜上。
本发明的其它特征对本领域的技术人员来说是显而易见的，在此不必重复。
所用的术语和表述是用作描述性术语，而不是用于限定，使用这些术语和表述并不是想排斥所示和所述特征或其部分的任何等同的特征，因为应认识到在本发明范围内可对其进行各种修改。(1)一般信息(i)申请人Tureci，Ozlem；Sahin，Ugur；Pfreundschuh，Michael(ii)发明名称诊断和治疗癌症的方法以及鉴定正常细胞样品中致病标记的方法(iii)序列数3(iv)通讯地址(A)联系人Felfe & Lynch(B)街第三大街805号(C)城市纽约市(D)州纽约州(F)邮编10022(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘，3.5英寸，144kb存储(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordpeffect(vi)当前申请资料(A)申请号08/892,702(B)申请日1997年7月15日(C)分类435(vii)律师/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登记号30,946(C)卷号LUD 5491(ix)电信信息
(A)电话(212)688-9200(B)传真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度3393碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO1GCCCTCATAG ACCGTTTGTT GTAGTTCGCG TGGGAACAGC AACCCACGGT TTCCCGATAG 60TTCTTCAAAG ATATTTACAA CCGTAACAGA GAAAATGGAA AAGCAAAAGC CCTTTGCATT 120GTTCGTACCA CCGAGATCAA GCAGCAGTCA GGTGTCTGCG GTGAAACCTC AGACCCTGGG 180AGGCGATTCC ACTTTCTTCA AGAGTTTCAA CAAATGTACT GAAGATGATT TGGAGTTTCC 240ATTTGCAAAG ACTAATCTCT CCAAAAATGG GGAAAACATT GATTCAGATC CTGCTTTACA 300AAAAGTTAAT TTCTTGCCCG TGCTTGAGCA GGTTGGTAAT TCTGACTGTC ACTATCAGGA 360AGGACTAAAA GACTCTGATT TGGAGAATTC AGAGGGATTG AGCAGAGTGT TTTCAAAACT 420GTATAAGGAG GCTGAAAAGA TAAAAAAATG GAAAGTAAGT ACAGAAGCTG AACTGAGACA 480GAAAGAAAGT AAGTTGCAAG AAAACAGAAA GATAATTGAA GCACAGCGAA AAGCCATTCA 540GGAACTGCAA TTTGGAAATG AAAAAGTAAG TTTGAAATTA GAAGAAGGAA TACAAGAAAA 600TAAAGATTTA ATAAAAGAGA ATAATGCCAC AAGGCATTTA TGTAATCTAC TCAAAGAAAC 660CTGTGCTAGA TCTGCAGAAA AGACAAAGAA ATATGAATAT GAACGGGAAG AAACCAGGCA 720AGTTTATATG GATCTAAATA ATAACATTGA GAAAATGATA ACAGCTCATG GGGAACTTCG 780TGTGCAAGCT GAGAATTCCA GACTGGAAAT GCATTTTAAG TTAAAGGAAG ATTATGAAAA 840AATCCAACAC CTTGAACAAG AATACAAGAA GGAAATAAAT GACAAGGAAA AGCAGGTATC 900ACTACTATTG ATCCAAATCA CTGAGAAAGA AAATAAAATG AAAGATTTAA CATTTCTGCT 960AGAGGAATCC AGAGATAAAG TTAATCAATT AGAGGAAAAG ACAAAATTAC AGAGTGAAAA 1020CTTAAAACAA TCAATTGAGA AACAGCATCA TTTGACTAAA GAACTAGAAG ATATTAAAGT 1080GTCATTACAA AGAAGTGTGA GTACTCAAAA GGCTTTAGAG GAAGATTTAC AGATAGCAAC 1140AAAAACAATT TGTCAGCTAA CTGAAGAAAA AGAAACTCAA ATGGAAGAAT CTAATAAAGC 1200TAGAGCTGCT CATTCGTTTG TGGTTACTGA ATTTGAAACT ACTGTCTGCA GCTTGGAAGA 1260ATTATTGAGA ACAGAACAGC AAAGATTGGA AAAAAATGAA GATCAATTGA AAATACTTAC 1320CATGGAGCTT CAAAAGAAAT CAAGTGAGCT GGAAGAGATG ACTAAGCTTA CAAATAACAA 1380AGAAGTAGAA CTTGAAGAAT TGAAAAAAGT CTTGGGAGAA AAGGAAACAC TTTTATATGA 1440AAATAAACAA TTTGAGAAGA TTGCTGAAGA ATTAAAAGGA ACAGAACAAG AACTAATTGG 1500TCTTCTCCAA GCCAGAGAGA AAGAAGTACA TGATTTGGAA ATACAGTTAA CTGCCATTAC 1560CACAAGTGAA CAGTATTATT CAAAAGAGGT TAAAGATCTA AAAACTGAGC TTGAAAACGA 1620GAAGCTTAAG AATACTGAAT TAACTTCACA CTGCAACAAG CTTTCACTAG AAAACAAAGA 1680GCTCACACAG GAAACAAGTG ATATGACCCT AGAACTCAAG AATCAGCAAG AAGATATTAA 1740TAATAACAAA AAGCAAGAAG AAAGGATGTT GAAACAAATA GAAAATCTTC AAGAAACAGA 1800AACCCAATTA AGAAATGAAC TAGAATATGT GAGAGAAGAG CTAAAACAGA AAAGAGATGA 1860AGTTAAATGT AAATTGGACA AGAGTGAAGA AAATTGTAAC AATTTAAGGA AACAAGTTGA 1920AAATAAAAAC AAGTATATTG AAGAACTTCA GCAGGAGAAT AAGGCCTTGA AAAAAAAAGG 1980TACAGCAGAA AGCAAGCAAC TGAATGTTTA TGAGATAAAG GTCAATAAAT TAGAGTTAGA 2040ACTAGAAAGT GCCAAACAGA AATTTGGAGA AATCACAGAC ACCTATCAGA AAGAAATTGA 2100GGACAAAAAG ATATCAGAAG AAAATCTTTT GGAAGAGGTT GAGAAAGCAA AAGTAATAGC 2160TGATGAAGCA GTAAAATTAC AGAAAGAAAT TGATAAGCGA TGTCAACATA AAATAGCTGA 2220AATGGTAGCA CTTATGGAAA AACATAAGCA CCAATATGAT AAGATCATTG AAGAAAGAGA 2280CTCAGAATTA GGACTTTATA AGAGCAAAGA ACAAGAACAG TCATCACTGA GAGCATCTTT 2340GGAGATTGAA CTATCCAATC TCAAAGCTGA ACTTTTGTCT GTTAAGAAGC AACTTGAAAT 2400AGAAAGAGAA GAGAAGGAAA AACTCAAAAG AGAGGCAAAA GAAAACACAG CTACTCTTAA 2460AGAAAAAAAA GACAAGAAAA CACAAACATT TTTATTGGAA ACACCTGAAA TTTATTGGAA 2520ATTGGATTCT AAAGCAGTTC CTTCACAAAC TGTATCTCGA AATTTCACAT CAGTTGATCA 2580TGGCATATCC AAAGATAAAA GAGACTATCT GTGGACATCT GCCAAAAATA CTTTATCTAC 2640ACCATTGCCA AAGGCATATA CAGTGAAGAC ACCAACAAAA CCAAAACTAC AGCAAAGAGA 2700AAACTTGAAT ATACCCATTG AAGAAAGTAA AAAAAAGAGA AAAATGGCCT TTGAATTTGA 2760TATTAATTCA GATAGTTCAG AAACTACTGA TCTTTTGAGC ATGGTTTCAG AAGAAGAGAC 2820ATTGAAAACA CTGTATAGGA ACAATAATCC ACCAGCTTCT CATCTTTGTG TCAAAACACC 2880AAAAAAGGCC CCTTCATCTC TAACAACCCC TGGACCTACA CTGAAGTTTG GAGCTATAAG 2940AAAAATGCGG GAGGACCGTT GGGCTGTAAT TGCTAAAATG GATAGAAAAA AAAAACTAAA 3000AGAAGCTGAA AAGTTATTTG TTTAATTTCA GAGAATCAGT GTAGTTAAGG AGCCTAATAA 3060CGTGAAACTT ATAGTTAATA TTTTGTTCTT ATTTGCCAGA GCCACATTTT ATCTGGAAGT 3120TGAGACTTAA AAAATACTTG CATGAATGAT TTGTGTTTCT TTATATTTTT AGCCTAAATG 3180TTAACTACAT ATTGTCTGGA AACCTGTCAT TGTATTCAGA TAATTAGATG ATTATATATT 3240GTTGTTACTT TTTCTTGTAT TCATGAAAAC TGTTTTTACT AAGTTTTCAA ATTTGTAAAG 3300TTAGCCTTTG AATGCTAGGA ATGCATTATT GAGGGTCATT CTTTATTCTT TACTATTAAA 3360ATATTTTGGA TGCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 3393(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2GTACAGCAGA AAGCAAGCAA CTGAATG 27(2)SEQ ID NO3的信息
(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO3GAAGGAACTG CTTTAGAATC CAATTTCC 28
权利要求
1.一种测定转化细胞存在的方法，包括分析取自除睾丸外的其它组织的细胞样品中SCP基因家族成员的表达，其中其表达是该样品中存在转化的细胞的指标。
2.权利要求1的方法，其中所述的SCP基因家族成员是SCP-1。
3.权利要求1的方法，包括测定该样品中对所述的SCP基因家族成员特异性的抗体。
4.权利要求1的方法，还包括测定该样品中所说的SCP基因家族成员的mRNA的存在。
5.权利要求3的方法，包括通过聚合酶链式反应测定mRNA的存在。
6.权利要求1的方法，包括分析该样品的一种SCP蛋白质。
7.权利要求1的方法，其中所说的SCP蛋白是SCP-1。
8.权利要求5的方法，包括通过免疫测定来分析该样品。
9.权利要求1的方法，其中所说的转化细胞是一种癌细胞。
10.权利要求8的方法，其中所说的癌细胞是一种肾癌细胞、神经胶质瘤、卵巢癌或者乳腺癌细胞。
11.一种治疗患有特征为至少一种SCP蛋白质含量不适的疾病的个体的方法，包括(i)从该个体取出含免疫反应细胞的样品，(ii)将含有免疫反应细胞的样品与用编码一种SCP蛋白质的核酸分子转染的细胞系在有利于产生针对由所说SCP蛋白产生的肽的溶细胞的T细胞的条件下接触，该SCP蛋白是由与所说症状相关的异常细胞表达的，(iii)导入足量的该溶细胞的T细胞到所述个体，以溶解所说的细胞。
12.权利要求10的方法，其中所说的SCP蛋白是SCP-1。
13.一种治疗患病个体的方法，该疾病的特征是存在一种起源于SCP蛋白并与细胞表面的MHC分子复合的肽，该方法包括(i)鉴定与所说症状相关的细胞表达的一种SCP基因；(ii)鉴定提呈该SCP基因部分表达产物的一种MHC分子；(iii)用所述SCP基因转染具有该MHC分子的宿主细胞；(iv)培养该转染的细胞以表达该SCP基因并提呈与该MHC分子复合的所述肽；(v)所述个体导入足量的该细胞，以激发其针对该异常的细胞的免疫应答。
14.权利要求12的方法，其中所说的免疫应答包括一种B细胞应答。
15.权利要求12的方法，其中所说的免疫应答是一种T细胞应答。
16.权利要求13的方法，其中所说的B细胞应答包括产生对所说的SCP蛋白质或从其衍生的肽具有特异性的抗体。
17.权利要求14的方法，其中所说的T细胞应答包括产生对提呈所说SCP来源肽的细胞特异的溶细胞的T细胞。
18.权利要求14的方法，还包括处理这种细胞，以使其成为非增生性。
19.一种治疗具有一种SCP蛋白量异常的症状特征的个体的方法(i)鉴定与该症状相关的异常细胞表达的一种SCP基因；(ii)转染与带有该SCP基因病人具有相同的MHC类型的宿主细胞；(iii)向该个体导入足够量的这种细胞，以激发其产生一种针对该异常细胞的免疫应答。
20.权利要求18的方法，还包括处理该细胞以使其成为非增生性的。
21.一种治疗具有一种SCP蛋白量异常的症状特征的个体的方法，包括向该个体施用足量转染细胞，以减轻这种症状，该转染细胞是由以下二种核酸序列转染而得的，(i)编码该SCP蛋白的一种核酸序列，(ii)编码提呈起源于该SCP蛋白的肽的一种MHC分子的核酸序列，其中该肽是由与该症状相关的细胞提呈的。
22.权利要求20的方法，还包括处理该细胞使其成为非增生性的。
23.一种治疗具有特征为一种SCP蛋白量异常的症状的个体的方法，包括向该个体施用足量的基本上由非增生的细胞组成的试剂，以诱导对其产生的免疫应答，该非增生细胞表面已表达了一种所说异常细胞特征性的肽。
24.一种治疗具有特征为SCP蛋白量异常的症状的个体的方法，包括向该个体施用足量抗体以治疗该症状，该抗体特异性结合到所述SCP蛋白或其衍生的肽上，所述抗体与一种有效的治疗剂偶联。
25.一种治疗具有特征为一种SCP蛋白量异常的症状的个体的方法，包括向该个体施用足量的表达一种SCP蛋白的非增生性细胞样品，以减轻这种症状。
26.一种预防个体以SCP蛋白量异常为特征的症状发作的方法，包括向该个体施用足量含有SCP蛋白和佐剂的疫苗，以预防该个体的癌症症状的发生。
27.一种预防个体以SCP蛋白量异常为特征的症状发作的方法，包括向个体施用足量的含有起源于该SCP蛋白的一种肽的疫苗，以预防该个体发作所述的症状。
28.一种预防个体以SCP蛋白量异常为特征的症状发作的方法，包括向可表达该蛋白或其衍生的肽的细胞施用足量的载体以预防该个体发作所述癌症症状，该载体含有编码该SCP蛋白的基因。
29.一种治疗具有以SCP蛋白量异常为特征的症状的个体的方法，包括(i)鉴定异常表达该SCP蛋白的个体的细胞；(ii)分离这种细胞的样品；(iii)培养这种细胞，(iv)向个体导入足量的这种细胞，以刺激针对该细胞的免疫应答。
30.权利要求28的方法，还包括该细胞在导入个体之前使其转化为非增生性的步骤。
31.一种用于追踪减轻SCP蛋白异常表达为特征的症状的治疗方案进展的方法，该方法包括(a)首先测定个体样品下列参数的水平，该参数包括(i)来自所述SCP蛋白的肽，(ii)对提呈所述肽的细胞具有特异性的一种溶细胞性T细胞；(iii)特异性结合所述SCP蛋白的所述肽的一种抗体；(b)其次在一定时间测定(a)步骤中的参数水平，与(a)中测定水平比较，以测定该治疗方案的效果。
32.一种治疗其特征为与该症状相关的SCP蛋白异常表达的病理细胞症状的方法，包括给需要的个体施用有效量的(a)SCP蛋白抑制剂，或者(b)SCP基因表达的抑制剂。
33.权利要求31的方法，其中所说的SCP蛋白抑制剂是一种抑制性抗体。
34.权利要求31的方法，其中所说的SCP基因表达抑制剂是一种反义分子。
35.一种分离的SCP-1蛋白的突变蛋白，该突变蛋白具有在SEQID NO1中所述的氨基酸的序列，但在225位由苯丙氨酸替代组氨酸，在226位由谷氨酰胺替代甘氨酸。
36.一种分离的核酸分子，它编码权利要求33的分离的突变蛋白。
37.一种测定能引起免疫应答的物质的方法，包括(a)从来自个体的正常细胞中产生cDNA文库，(b)将所述cDNA文库的cDNA分子插入到表达载体中，(c)将该表达载体转染到宿主细胞中以产生转染的宿主细胞，(d)培养该转染的宿主细胞以产生所说的物质，(e)裂解该转染的宿主细胞，以形成一个裂解物，(f)将该裂解物与来自个体的样品接触，该个体怀疑可能已经引发了该物质对裂解的非转染宿主细胞的免疫应答，(g)将经过(f)步骤后的所述样品与用不含cDNA的所述载体转染的宿主细胞样品接触，(h)将经过(g)步骤后的所述样品与该裂解物接触，使该物质的结合配体结合到该裂解物中的所述物质上，(i)检测所述结合，以测定所说的免疫活性物质。
38.权利要求36的方法，其中所说的正常细胞是一种睾丸细胞。
39.权利要求36的方法，其中所说的样品是血清。
40.权利要求36的方法，其中所说的样品和该正常细胞取自同一个个体。
41.权利要求36的方法，其中所说的样品和该正常细胞取自不同的个体。
42.用于刺激对SCP蛋白的免疫应答的物质的组合物，包括多个来源于该SCP蛋白的氨基酸序列的肽，其中所述肽结合到以异常量表达SCP蛋白的细胞的表面上的一个或多个MHC分子上。
43.权利要求41的物质的组合物，其中至少部分所说多个肽结合到MHC分子上，并引起针对其的溶细胞应答。
44.权利要求42的物质的组合物，还包括一种佐剂。
45.权利要求43的物质的组合物，其中所说的佐剂是皂苷，GM-CSF或者白介素。
46.一种特异性结合SCP蛋白的分离的抗体。
47.权利要求45的抗体，其中所说的抗体是单克隆抗体。
48.权利要求46的抗体，其中所述的单克隆抗体是人源化的单克隆抗体。
49.权利要求45的抗体，其中所说的SCP蛋白是SCP-1。
50.权利要求48的抗体，其中所说的抗体是单克隆抗体。
51.一种与起源于SCP蛋白的肽特异性结合的分离抗体。
52.权利要求50的抗体，其中所说的抗体是一种单克隆抗体。
53.一种分离抗体，它特异性结合下列物质形成的复合物，(i)起源于SCP蛋白的肽和(ii)含有该肽的一种MHC分子；但不单独与(i)或(ii)结合。
54.权利要求52的抗体，其中所说的抗体是一种单克隆抗体。
55.测定一种症状好转、恶化或发作的方法，这种症状的特征在于SCP蛋白水平异常，该方法包括监测来自该症状病人样品的下列参数，该参数选自(i)SCP蛋白；(ii)起源于该SCP蛋白的肽，(iii)对起源于该蛋白的肽和与其结合的MHC分子特异性的溶细胞的T细胞，测定的参数是该症状好转，恶化或发作的指标。
56.权利要求54的方法，其中所说的样品是一种体液。
57.权利要求54的方法，其中所说的样品是一种组织。
58.权利要求54的方法，其中将该样品与一种和该SCP蛋白或肽特异性结合的抗体接触。
59.权利要求57的方法，其中所说抗体用一种放射活性标记或一种酶标记。
60.权利要求57的方法，其中所说的抗体是单克隆抗体。
61.权利要求54的方法，包括扩增编码该SCP蛋白的RNA。
62.权利要求60的方法，其中所说的扩增包括进行聚合酶链反应。
63.权利要求54的方法，包括将所说的样品与特异性杂交到编码或表达所述SCP蛋白的核酸分子上的核酸分子接触。
64.权利要求54的方法，包括分析该样品中的所述肽。
全文摘要
本发明涉及一种以前鉴定过的作为细胞转化的标记的蛋白质SCP－1的识别,并教导了这种蛋白质和有关分子的诊断及治疗用途;还揭示了用一种正常细胞作原材料来鉴定免疫活性物质和病理状态指示物的方法。
文档编号A61K48/00GK1263560SQ98807141
公开日2000年8月16日 申请日期1998年6月25日 优先权日1997年7月15日
发明者厄兹莱姆·图雷茨, 乌尔·沙欣, 米夏埃尔·普夫翁德舒 申请人:路德维格癌症研究所