免疫抑制剂的制作方法

专利名称：免疫抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫抑制剂，特别是含有选择性抑制活化T细胞的抑制剂作为活性成分的免疫抑制剂。更为具体地，本发明涉及用于治疗由于由活化T细胞所诱导异常免疫应答而造成疾病的治疗剂，这些疾病如器官移植的排异反应、由骨髓(造血干细胞)移植造成的移植物抗宿主疾病、自身免疫疾病、炎症反应、纤维化或由自身免疫疾病或其相关疾病所致并伴随组织损伤或感染的功能异常或过敏性疾病。
生物的免疫系统是由于识别和排除病原性外源微生物如细菌和病毒而形成的监视和防御系统。因此，生物体区别自身细胞或组织(自身-抗原)与外源微生物(非-自身抗原)，并且不对自身抗原产生应答，或者对其产生不造成免疫应答的应答(免疫耐受)。因此，生物形成了迅速而有效地排除非自身-抗原的获得性免疫性。
在免疫系统中，T细胞(T淋巴细胞)具有重要的作用。
外周的年幼CD4 T细胞通过同时接受经过T细胞受体而来源于抗原呈递细胞抗原的信号和共刺激分子同时的信号而活化。然后，它们增殖并分泌IL-2，即T细胞生长因子(Thp)。Thp分化成Th0细胞，然后，分化成Th1细胞或Th2细胞。这些细胞进一步增殖，产生多种细胞因子并产生致细胞病变效应。
当在这一系列免疫应答中异常反应发生时，淋巴细胞，尤其是T细胞对自身-抗原产生强烈应答，并可能产生组织损伤。这种状态称为自身免疫疾病。引发异常免疫应答的原因之一是对病毒或细菌的正常免疫应答通过一些系统而变为对自身-抗原的免疫应答。由自身免疫疾病所诱导的组织损伤或感染引起多种炎症反应，组织纤维化或功能异常等。
尽管器官移植的排异反应或由骨髓(造血干细胞)移植所致的移植体对宿主的疾病是正常的免疫应答反应，但在治疗上有必要抑制它们。该免疫应答的机制基本上是相同的，并且活化的T细胞在此反应中起主要作用。
近年来，活化T细胞在过敏性疾病中的作用已引起注意。即，已证实细胞因子如主要由活化Th2细胞产生的IL-4和IL-5活化肥大细胞或嗜酸性粒细胞从而诱导即发型超敏反应，且主要由Th1细胞产生的干扰素-γ(IFN-γ)诱导迟发型超敏反应。
因此，需要具有选择性抑制活化T细胞活性而用于治疗以下疾病的治疗剂，这些疾病包括自身免疫疾病、移植免疫性、由前述疾病所引起的慢性活化型免疫炎症反应及过敏性疾病。
在这些环境下，已经研究过控制T细胞活化机制中介质的治疗方法。其中，用环孢菌素或FK-506、抗-细胞因子治疗、抗-粘附分子(活化相关分子)治疗或单克隆抗体的强烈抗T细胞抑制效应引起了注意。然而，与以前使用的糖皮质激素类似，这些化合物不具有对活化T细胞潜在的选择性，并且副作用的问题仍然存在。
意外的是，自身免疫疾病是可在任何器官中出现的全身性疾病。此外，随着器官移植和造血干细胞移植的发展，移植的排异反应和移植物抗宿主疾病的问题预期会增长。此外，过敏性疾病称为“文明病(civilized diseases)”，并且有众多此病的患者，这是由于完全治愈该病的困难所致。
有多种活化T细胞在其中起主要作用的疾病，因此有必要开发出治疗该病的有效治疗剂。然而，目前还没有选择性抑制活化T细胞而治疗由此活化T细胞所致的疾病的这样的药剂。
因此，本发明的目的是提供具有对活化T细胞选择性抑制活性并具有低副作用的有效免疫抑制剂。更为具体地，本发明的目的是提供用于治疗以下疾病的治疗剂，这些疾病包括自身免疫疾病、在自身免疫疾病或其相关疾病中出现的具有组织损伤或感染的炎症反应、器官移植的排异反应、由骨髓(造血干细胞)移植所致的移植物抗宿主疾病及过敏性疾病。
因此，为了解决这些问题，本发明人通过在活化T细胞中选择性诱导编程性细胞死亡的机制而找出具有选择性抑制活化T细胞活性的化合物。此外，本发明人已发现这些化合物具有阻止或控制由活化T细胞所致疾病的潜在活性。
因此，本发明的一方面提供包括选择性抑制活化T细胞的抑制剂作为活性成分的免疫抑制剂。
在本发明中，活化的T细胞为那些通过产生和分泌多种细胞因子而增殖，然后导致一系列免疫应答的T细胞。
因此，本发明特征在于通过诱导选择性编程性细胞死亡并且防止或治疗由这些活化T细胞所致异常免疫应答而造成的疾病而抑制活化的T细胞。
因此，本发明免疫抑制剂的具体方面是提供治疗以下疾病的药剂，这些疾病包括器官移植的排异反应、由骨髓(造血干细胞)移植所致的移植物抗宿主疾病、自身免疫疾病、由自身免疫疾病或其相关疾病所致的具有组织损伤或感染的炎症反应、纤维化、功能异常或过敏性疾病。
要通过本发明免疫抑制剂有效预防和治疗的自身免疫疾病有，例如，自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、溃疡性结肠炎、多发性硬化(MS)、硬皮病、重症肌无力、多发肌炎/皮肤肌炎、淋巴瘤性甲状腺肿、自身免疫性血细胞减少症、斯耶格伦综合症、脉管炎综合症或系统性红斑狼疮等。
在本发明的另一实施方案中，过敏性疾病有，例如，支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、荨麻疹、花粉病等。
本发明免疫抑制剂在治疗上对于通过选择性抑制活化T细胞而预防或治疗疾病是有用的，并具有低的副作用。
可通过测定对活化T细胞，例如，按下述从小鼠中分离的具有迟发性超敏(DTH)反应的T细胞编程性细胞死亡的诱导活性而筛选作为本发明活性成分的化合物。
根据本发明者的研究，他们发现了由下式(I)所代表的类黄酮类或色酮类
其中，R为氢原子或可由一个或两个羟基所取代的苯基，Rha为α-L-鼠李糖残基，并且点线表示具有或不具有双键。
因此，本发明的另一方面提供包括由式(I)所代表类黄酮类或色酮类作为活性成分的免疫抑制剂。
其中，优选使用式(I)的色酮类，其中R为氢原子，或式(I)的黄酮类，其中R为4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基或3，5-二羟基苯基。更为具体地，式(I-a)的smitilbin、式(I-b)的落新妇苷、式(I-c)的engeletin或式(I-d)的eucryphin更为优选。
本发明一些类黄酮类或色酮类是已知的化合物，然而，其抗炎症活性才被检测到，并且还不清楚其对异常免疫反应的改良活性。式(I-a)的smitilbin是由本发明者新发现的化合物。因此，本发明的另一实施方案提供式(I-a)smitilbin。


图1显示实施例4中实验2的结果。
图2显示实施例4中实验4的结果。
图3显示实施例4中实验5的结果。
图4显示实施例4中实验6的结果。
图5显示实施例4中实验7的结果。
图6显示实施例5中实验2的结果。
用诱导从小鼠中分离的具有延迟性超敏反应的(DTH)活化T细胞的编程性细胞死亡的式(I)类黄酮类或色酮类将对本发明的免疫抑制剂进行更为详细的描述。
作为本发明活性成分的式(I)的类黄酮类或色酮类为来自植物，例如，光叶菝葜(Smilax glabra Roxb)，一种百合科植物的化合物。光叶菝葜，即土茯苓(Smilacis Glabrae)的根茎在中国作为家用药物而治疗慢性皮炎、梅毒患者皮炎或汞中毒。
式(I)的类黄酮类或色酮类，如smitilbin(I-a)、落新妇苷(I-b)、engeletin(I-c)和eucryphin(I-d)可分别用适当的溶剂提取而以纯化的形式从土茯苓根茎中获取。
本发明的免疫抑制剂不局限于含有纯化形式类黄酮类或色酮作为活性成分的药剂。其可以是含有植物如土茯苓的提取物作为包括类黄酮类或色酮类的活性成分的药剂。土茯苓的根茎提取物(之后称为RSG ext)可以为冻干粉末形式或液体形式。
提取可用合适的溶剂于室温渗滤植物或在回流装置中进行。干燥过的且粉末状的植物优选用于该提取过程，且溶剂可以为具有中度极性的有机溶剂，低级醇或水。例如，此溶剂可以为乙酸乙酯、氯仿、石油醚、甲醇、乙醇和水及其混合物。溶剂对植物或干燥粉末植物的比例没有限制，并且可在植物重量约5到10倍的范围内变化，提取2到5次。提取后，将溶剂浓缩至适当的量，并且通过用不同种溶剂的分别提取、层析、离子交换树脂层析或膜滤过来纯化剩余物以获得本发明的类黄酮类或色酮类。此外，通过上述任何纯化的阶段而获得的合成的类黄酮类或色酮类可用于本发明中。
本发明的类黄酮类或色酮类所具有的对活化T细胞的选择性免疫抑制活性由对从小鼠中分离的具有迟发型超敏(DTH)反应活化T细胞的编程性细胞死亡作用而得到证实。即，将本发明的类黄酮类或色酮类与从被诱导成肝脏免疫损伤小鼠中分离的具有DTH反应的肝脏非实质细胞(之后称为NPC)一起培养以得到NPC非粘附部分的细胞死亡。在凝胶琼脂糖电泳的DNA片段化中，DNA梯子带型出现，并且证实细胞死亡为编程性细胞死亡。由式(I)的类黄酮类或色酮类所造成的细胞死亡在非粘附部分(主要由CD4+T细胞和CD8+T细胞所组成)中见到，并且在粘附部分的NPC中没有见到。此外，细胞死亡在肝细胞(之后称为HC)、正常小鼠的NPC细胞和胰脏细胞中没有观察到。从这些方面，应当明白本发明的式(I)的类黄酮类或色酮类选择性地抑制由DTH反应而活化的T细胞(主要由非粘附部分的NPC所组成)。
此外，式(I)的类黄酮类或色酮类通过选择性抑制活化T细胞所造成对损伤组织的改良效应，也通过抑制从具有DTH反应所诱导肝脏损伤小鼠中分离的HC中丙氨酸氨基转移酶(ALT)的释放而认识到。
因此，包括式(I)的类黄酮类或色酮类作为活性成分的本发明免疫抑制剂诱导活化T细胞的选择性编程性细胞死亡，并且因此选择性抑制这些活化的T细胞。因此，本发明的免疫抑制剂对于治疗由活化T细胞所致的疾病是有用的，这些疾病如器官移植的排异反应、由骨髓(造血干细胞)移植所致的移植物抗宿主疾病、自身免疫疾病、由自身免疫疾病或其相关疾病所致的伴随有组织损伤或感染的炎症反应、纤维化、功能异常或过敏性疾病。
含有式(I)类黄酮类或色酮类或含有它们的植物提取物的本发明免疫抑制剂的剂量形式没有特别的限制。式(I)的类黄酮类或色酮类可制备成各种类型的口服制剂或肠道外施用形式，包括胶囊、片剂、使用常规赋形剂的注射液。
例如，将式(I)的类黄酮类或色酮类或粉状提取物与适当的赋形剂如乳糖、淀粉或其衍生物或纤维素衍生物混合，并且然后装入明胶胶囊中。
同样，如果必要，可通过混合此活性成分与上述赋形剂以及进一步与粘合剂如羧甲基纤维素钠、藻酸或阿拉伯树胶以及水以得到颗粒而制备片剂。然后，其可与作为润滑剂的滑石或硬脂酸进一步混合，并通过常规的制备片剂的机器压缩成片剂。
用于肠道外途径的可注射制剂也可通过将该活性成分溶解于具有增溶佐剂的无菌蒸馏水液或无菌生理盐水液中并将其装入足够大的容器中加以制备。稳定剂或缓冲液可用于此可注射溶液中。此可注射制剂可静脉内或通过滴注施用。
在式(I)的类黄酮类或色酮类的施用中，有效的剂量没有特别的限制并且可根据各种因素而改变，如目的疾病、患者病情、疾病的严重性、年龄、并发症的存在以及施用途径、制剂、施用次数等。建议口服施用的一般日剂量在1-1000mg/天/人的范围内，优选在1-500mg/天/人的范围内，而建议肠道外施用的一般日剂量在口服剂量的1/100到1/2的范围内。这些剂量也可随年龄及患者病情而改变。
包括具有选择性抑制活化T细胞活性的化合物作为活性成分的本发明免疫抑制剂将通过用具有由DTH反应而诱导肝脏损伤的小鼠并检测对从这些小鼠中分离的活化T细胞的编程性细胞死亡诱导活性而在下面的实施例中更为详细地描述。然而，应当明白本发明不局限于这些实施例。
实施例1土茯苓根茎提取物(RSG ext)的制备用10倍重量的蒸馏水于100℃提取干粉状的土茯苓根茎2次，每次1小时。将合并的提取物于1,700g离心，并将得到的上清液冷冻干燥从而得到11％产率的粉状形式的RSG ext。
通过HPLC测得RSG ext中落新妇苷的含量为0.273％。实施例2土茯芩根茎提取物，黄酮类及色酮类的制备a.提取和分离将6kg干燥和切碎的土茯苓根茎用30L甲醇在回流装置中提取2小时，并过滤以得到提取物。将剩余物用18L甲醇提取，用与上述相同的方式重复一次以得到提取物。然后，再次用18L甲醇提取剩余物，并按与上述相同的方式重复一次以得到提取物。在减压下浓缩合并的提取物以得到568g甲醇提取物。
将此甲醇提取物悬浮于1L水中并用1L石油醚提取悬液三次，且随后用1L乙酸乙酯提取三次。分别浓缩合并的石油醚提取物以得到23g石油醚提取物，且也浓缩合并的乙酸乙酯提取物以得到80g乙酸乙酯提取物。
将70g乙酸乙酯提取物进行硅胶(1,000g)柱层析，并用2L二种氯仿及甲醇混合液(分别为19∶1和4∶1)加以洗脱以分别得到32.5g级份A和28g级份B。
将25g级份A进一步进行硅胶(500g)柱层析，并以1L二种氯氯仿及甲醇的混合液(分别为9∶1和4∶1)洗脱以分别得到2.5g级份A-1及7.5g级份A-2。然后，将2.0g级份A-2进一步用Cosmosil75C18-OPN柱以甲醇-水(2∶3和3∶2，每次200ml)通过HPLC进行纯化以得到72mg式(I-d)的eucryphin。
另一方面，将28g级份B进一步用Cosmosil 75 C18-OPN柱以甲醇-水(3∶7、1∶1和7∶3)通过HPLC进行纯化从而分别得到8.2g式(I-b)的落新妇苷和11.5g级份B-2。将得到的级份B-2进一步用氯仿-甲醇(9∶1，500ml)通过硅胶(350g)柱层析且通过制备薄层层析加以纯化以得到2.6g式(I-a)的smitilbin及42mg式(I-c)的engeletin。
下表1显示分别来自568g甲醇提取物的黄酮类及色酮类的量及产率。
表1
b.化学结构(物理数据)的鉴定用质普及NMR分析鉴定已知化合物落新妇苷、engeletin及eucryphin的化学结构。由于化学式(I-a)的smitilbin为一种新的化合物，该化合物的化学结构通过下面的物理数据加以测定。外观无色针形晶体(来自氯仿-甲醇混合物液(9∶1))。熔点179～181℃。[α]25D-161.4°(c 0.2，MeOH).UV(MeOH)λmax(logε)＝217nm(4.394)，291nm(4.279).IRνmax＝3500(OH)，1620(C＝O)，1360，1160，1040，970，820，780cm-1.HR-FAB-MSm/z＝451.1234(根据C21H23O11计算；451.1240)1H-NMR(DMSO-d6)0.79(3H，d，J＝6.0Hz，H-6″)，2.37(1H，m，H-5″)，3.04(1H，t，J＝9.5Hz，H-4″)，3.20(1H，dd，J＝9.5 & 2.9Hz，H-3″)，3.47(1H，brs，H-2″)，4.15(1H，d，J＝2.0Hz，H-3)，4.74(1H，s，H-1″)，5.43(1H，d，J＝2.0Hz，H-2)，5.90(1H，brs，H-6)，5.92(1H，brs，H-8)，6.70(2H，brs，H-4′，6′)，6.81(1H，brs，H-2′)，11.63(1H，s，OH-5)。13C-NMR(DMSO-d6)80.85(C-2)，74.38(C-3)，193.64(C-4)，164.75
(C-5)，101.19(C-6)，167.77(C-7)，96.20(C-8)，163.30(C-9)，97.30(C-10)，127.38(C-1′)，115.00(C-2′)，145.86(C-3′)，116.18(C-4′)，145.62(C-5′)，118.87(C-6′)，99.55(C-1″)，71.01(C-2″)，71.01(C-3″)，72.11(C-4″)，69.84(C-5″)，18.11(C-6″)。
用L-鼠李糖单水合物鉴定来自式(I-a)化合物酸水解产物的Rf值。
在上面实施例1中获得的RSGext或在实施例2中获得的化合物用于下面的实验中。实施例3小鼠的肝脏损伤模型实验1具有由延迟型超敏(DTH)反应诱导肝脏损伤的小鼠的制备及其分析方法。a.方法将6-8周龄BALB/c小鼠(雄性及雌性，22±2g)，通过以5天的间隔在其腹部皮肤涂抹0.1ml 1％的苦基氯乙醇溶液致敏2次。第二次致敏后5天，以每只小鼠中收集血样，且然后将小鼠注射以10μl0.2％的苦基氯橄榄油液用于诱导损伤。诱导后0、6、12、18及24小时后，收集血样，并分离脾细胞、HC及NPC。此血液用于测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性。
分别将脾细胞与NPC与抗-小鼠LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)抗体反应，及将HC与抗-小鼠ICAM-1(细胞间粘附分子-1)抗体反应。冲洗后，将这些细胞与FITC-标记的羊抗-大鼠IgG反应。然后，用PBS冲洗细胞并再次悬浮从而用FACScan系统(BectonDickinson)测定细胞表面抗原的表达。
此外，将HC与NPC或从正常小鼠及肝脏损伤小鼠分离(分别于0、6、12、18及24小时后)的脾细胞共培养。上清液中ALT的释放分析用下面的方法进行。
将HC(1×105个细胞/ml)悬浮于WE培养基(含有2mM L-谷氨酰胺、10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的William’s培养基E)中。将细胞种植于24 孔板中并于37℃在具5％(v/v)CO2空气中预培养5小时。预培养后，HC用WE培养基冲洗2次，且然后将WPC(4×105个细胞/ml)或脾细胞(5×106个细胞/ml)加入到小孔中。3小时连续培养后，收集上清液用于分析ALT活性。b.结果第一部分观察到血清ALT活性、脾细胞及NPC上的LFA-1的表达以及HC上ICAM-1表达的改变。同样，观察肝脏损伤小鼠肝细胞的组织学改变。
结果，LFA-1在脾细胞上的表达在诱导肝脏损伤6小时后达到峰值。与此相比，NPC上LFA-1的表达和HC上ICAM-1的表达在诱导肝脏损伤后12小时达到峰值，血清ALT活性在18小时后达到峰值。
至于小鼠中的组织学改变，在诱导肝脏损伤时(0小时)肝脏状态几乎是正常的。然而，观察到在诱导肝脏损伤后6小时有轻度炎症浸入，12小时后有显著的炎症浸入且18小时后有大量肝细胞坏死。第二部分观察诱导肝脏损伤后NPC与脾细胞对HC ALT-释放活性的改变以及具有正常及肝脏损伤小鼠NPC或脾细胞的HC培养上清中ALT的释放改变。
结果，NPC的ALT释放活性在诱导肝脏损伤后12小时达到峰值。对于脾细胞，在诱导肝脏损伤后6到12小时期间该释放活性维持在峰值。诱导肝脏损伤后12小时NPC的活性水平显示出比诱导肝脏损伤后12小时脾细胞活性水平强大约12.5倍。
根据上面的结果，讧实此活化的T细胞可通过诱导小鼠中的肝脏损伤加以制备。即，通过以5天的间隔在其腹部皮肤上涂抹苦基氯而致敏小鼠2次，并在致敏后5天，将苦基氯(即，相同抗原)注射至肝脏中用于诱导肝脏损伤从而制备活化的T细胞。特别地，NPC上LFA-1的表达及HC上ICAM-1的表达在注射苦基氯至肝脏中12小时后达到峰值，因而导致强烈的免疫应答。因为在此免疫应答中血清ALT升高达到峰值，故证实此肝脏损伤由于免疫应答而出现。
此外，注射苦基氯至肝脏中12小时后具有分离自小鼠NPC的HC培养上清液中的ALT活性达到峰值。因此，为了检测在体外系统中对活化T细胞的选择性抑制活性，优选使用具有通过迟发型超敏(DTH)反应而免疫学诱导肝脏损伤的小鼠。
因此，将经过皮肤以苦基氯致敏然后注射相同抗原(苦基氯)进入肝脏中而诱导肝脏损伤后12小时的小鼠用于下面的实施例中。实施例4落新妇苷和RSG ext的效应实验1肝脏损伤小鼠的制备用与上述实施例3中所述相同的方式，将6-8周龄的BALB/c小鼠(雄性，22±2g)与6-8周龄的ICR小鼠(雄性，22±2g)通过以5天的间隔在其腹部皮肤上涂沫0.1ml 1％苦基氯乙醇溶液而致敏2次。第二次致敏后5天，从每只小鼠中收集血样，然后将小鼠注射以10μl 0.2％苦基氯橄榄油液到肝脏中用于诱导肝脏损伤。注射后12小时，收集血样并分离肝细胞。通过常规方法测定血液的ALT及AST活性。此外，从正常及肝脏损伤小鼠中分离肝细胞，并通过二步灌流方法分离HC与NPC。然后，将这些细胞立即用于共培养测试或编程性细胞死亡测定。
此外，将部分NPC在培养板上孵育3小时，从而将附着细胞与非附着细胞分离。通过台酚蓝染色测定发现分离的HC和NPC约90％是存活的。实验2编程性细胞死亡测定之一(编程性细胞死亡细胞的计数)a.方法使用从诱导12小时后肝脏损伤小鼠中分离的HC和NPC，以及从NPC中分离的附着细胞与非附着细胞部分。
将这些细胞在37℃分别与作为测试化合物的5×10-5g/ml落新妇苷及RSG ext在RPMI 1640培养基中孵育1小时。孵育后，将这些细胞用Hoechst 33342(Molecular Probes，Inc.美国)于室温染色1分钟。用RPMI 1640培养基冲洗三次后，将得到细胞用磷酸缓冲液(PBS)中2％的甲醛固定。通过在荧光显微镜下计数5个不同视野中总共200个细胞而测定总细胞群体中编程死亡的细胞。
为了对照研究，用相同的方式孵育没用测试化合物处理的细胞。b.结果落新妇苷和RSG ext对来自肝损伤小鼠NPC和HC编程性细胞死亡的效应示于图1中。如图1中所示，编程性死亡细胞在总的没有药物处理HC和NPC中的比例分别约为10％和5％。相反，以5×10-5g/ml落新妇苷或RSG ext(处理)显著增加编程性死亡细胞在总NPC中的比例，而没增加在HC中的比例。编程性死亡细胞在从NPC分离的非附着部分中的比例被这两种药物中任一种药物而增加，但在附着细胞部分中没有观察到影响。实验3编程性细胞死亡测定之二；DNA片段化分析(凝胶琼脂糖电泳)a.方法使用从正常小鼠和诱导12小时后肝脏损伤小鼠中分离的NPC。用落新妇苷或RSG ext处理这些细胞，然后按如下用凝胶琼脂糖电泳进行DNA分离分析。
将从正常小鼠和诱导后12小时肝脏损伤小鼠中分离的NPC于37℃在RPMI 1640培养基中单独孵育1小时或与5×10-5g/ml 落新妇苷或RSG ext一起孵育1小时。孵育后，冲洗并离心以药物处理或未处理的106个细胞部分。将得到的沉淀物重悬于0.6ml含有0.2％TritonX-100的裂解缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 7.5)中并于冰冷状态下静置10分钟。于20,000g离心后，将得到的上清液与等体积TE-饱和酚混合并轻轻搅拌混合物2～3分钟，然后再次离心。将得到的上清液用氯仿-异戊醇(24∶1)溶液混合，然后将混合物再次于20,000g离心。将获得的上清液于-20℃贮存于0.3M NaCl及70％乙醇中过夜以得到DNA沉淀。
将这样得到的DNA沉淀与1μl 1mg/ml RNA酶A于37℃孵育30分钟。向该溶液中加入1∶10(v/v)比例的含有0.02％溴酚蓝、0.02％二甲苯腈蓝FF、50％甘油及0.1％SDS的上样缓冲液。电泳于2％凝胶琼脂糖中用50V进行75分钟，并用溴化乙锭观察DNA。b.结果在凝胶琼脂糖电泳的DNA片段化过程中，当用落新妇苷或RSGext处理细胞时，在分离自肝脏损伤小鼠的NPC中出现DNA梯子带型。另一方面，从正常小鼠中分离的以这些药物处理的NPC与脾细胞中，没有DNA梯子带型出现。即，没有观察到正常小鼠NPC和脾细胞的编程性细胞死亡。
根据DNA片段化分析的结果，从由于以落新妇苷处理而接种抗原(苦基氯)而诱导12小时后肝脏损伤小鼠中分离的NPC的细胞死亡特征为编程性细胞死亡。用在上面实验2(通过用Hoechst 33342染色没有观察到正常小鼠NPC细胞的死亡)中得到结果可很好地鉴定出这些结果。
本发明者已通过流式细胞术分析发现经皮肤以苦基氯在肝脏中致敏后NPC细胞组成有巨大变化。本发明人也发现在接种抗原之前切除脾脏时，血清ALT水平(肝脏损伤水平参数)显著下降。因此，淋巴细胞在肝脏的浸入和定位导致NPC组成的变化，表明此为肝脏损伤的主要原因。
此外，实施例3中实验结果清晰显示组织学中的炎症浸入和体外NPC肝细胞细胞毒性在接种抗原后12小时达到峰值。此时，NPC含有72.6～78％LFA阳性细胞，其中包括47.9％CD4+和23.2％CD8+T细胞。通过用抗CD4单克隆抗体加补体处理这种NPC，ALT从HC中的释放完全受到抑制。并且通过用抗CD8抗体处理这种细胞，ALT从HC中的释放趋于被抑制。
根据上述这些发现及前面实施例4的结果，得出落新妇苷或RSGext诱导对非-附着NPC而非对附着NPC的编程性细胞死亡。因此，估计T淋巴细胞群(为非-附着NPC的主要成分)为落新妇苷或RSGext的主要靶标。
此外，落新妇苷或RSG没有诱导对从正常小鼠中分离HC、和NPC及脾细胞的编程性细胞死亡。通过这些结果，证实主要包括T细胞的活化免疫细胞受落新妇苷或RSG ext的选择性抑制。实验4ALT-释放分析(之一)a.方法从诱导肝脏损伤后12小时的小鼠中分离HC与NPC。将这样获得的HC悬于WE培养基中，并种植于96-孔微培养板(2×104个细胞/0.2ml/孔)，并在具有5％(v/v)CO2的空气中于37℃孵育5小时。孵育后，将HC以WE培养基冲洗2次并与8×104个细胞的NPC共培养3小时。将NPC与不同浓度落新妇苷或RSG ext于37℃预孵育1小时。共培养后，收集上清液用于通过常规方法分析ALT及AST活性。b.结果结果示于图2中。
很显然，通过与NPC共培养3小时后HC的ALT及AST水平显著上升。相反，通过与用落新妇苷或RSG ext预处理的NPC共培养，NPC的ALT释放活性受到剂量依赖性抑制，并且AST释放活性也受到落新妇苷的剂量依赖性抑制。5×10-5g/ml的落新妇苷导致ALT释放的完全抑制。实验5ALT-释放分析(之二)a.方法按照与实验4中所述相同的方式从诱导后12小时肝脏损伤小鼠中分离HC及NPC。这样将HC悬于WE培养基中，并种植于96孔微培养板(2×104个细胞/0.2ml/孔)中，并且在具有5％(v/v)CO2的空气中于37℃孵育5小时。孵育后，将HC用WE培养基冲洗2次并与8×104个细胞的NPC(用5×10-5g/ml 落新妇苷或RSG ext分别预处理5、15、30、60和120分钟)于37℃共培养3小时。共培养后，收集上清液用于通过常规方法分析ALT活性。b.结果结果示于图3中。
很显然HC的ALT释放通过与以落新妇苷或RSG ext预处理的NPC共培养而受到时间依赖性抑制。通过预处理NPC 30多分钟，ALT释放受到完全抑制。
然而，当用高浓度落新妇苷或RSG ext预处理HC大于2小时时，ALP释放没有改变。实验6口服药物后ALT-释放活性a.方法使用6-8周龄的BALB/c小鼠(雄性，22±2g)或6-8周龄ICR小鼠(雄性，22±2g)。通过与实验1中所述相同的方法在皮肤上涂抹苦基氯而将小鼠致敏。然后，分别在诱导肝脏损伤后0、5及10小时后口服100mg/kg 落新妇苷或200mg/kg RSG ext三次。最后一次服用2小时后，收集血样用于测定血清ALT活性，并且同时分离HC及NPC用于其培养。将上清液中的ALT活性与血清ALT活性比较。b.结果结果示于图4中。
当小鼠口服用药时，显然与没用药物处理的对照小鼠细胞相比，血清ALT活性与NPC对HC的细胞毒性显著下降。
这些结果与实验4中结果相一致。简言之，当将获自肝脏损伤小鼠的NPC用落新妇苷或RSG ext预处理并与HC共培养时，与没用药物处理的对照小鼠细胞相比，通过共培养而获得的上清液中的ALT活性下降，并且NPC对HC的肝细胞毒能力显著下降。实验7用药时间研究a.方法通过与实验1中所述相同的方法诱导肝脏损伤。为了测定落新妇苷与RSG ext对诱导期(致敏期间)及效应期(诱导肝脏损伤后)的效应。在第一次致敏后10天每天一次及分别于诱导后0、5和10小时三次让小鼠口服落新妇苷(50和100mg/kg)及RSG ext(100及200mg/kg)。
为了对照研究，使用没有服药的小鼠，并且对于阳性对照研究，将10mg/kg的环磷酰胺(Cy)经皮施用至小鼠。
注射苦基氯至肝脏18小时后，收集血样用于通过常规方法测定血清ALT活性。同时进行肝脏的组织病理学检查。b.结果在图5中，显示了落新妇苷、RSG ext及环磷酰胺(Cy)对肝脏损伤小鼠中血清ALT活性升高的影响。
如图5中所示，与正常小鼠相比，在对照小鼠中观察到血清ALT活性异常的升高。为了与对照小鼠比较，在效应期小鼠中同时给以高剂量落新妇苷和RSG ext的小鼠表现出血清ALT活性显著的下降并且给以低剂量的小鼠显示出血清ALT活性下降的趋势和肝脏损伤的改善。
相反，当在诱导期给药时几乎没有观察到肝脏损伤的改善。施以环磷酰胺的小鼠当在诱导期及效应期中给药时表现出血清ALT活性的显著下降。
在组织病理学检查中，对照小鼠中的主要变化为炎症浸入及肝细胞凝结坏死。在大多数具有降低ALT活性小鼠中这些改变得到改善且证实通过施用落新妇苷和RSG ext或环磷酰胺肝脏损伤的改善。
前面的结果清楚地显示当在迟发型超敏(DTH)反应效应期而非诱导期施用时，落新妇苷和RSG ext显示出对血清ALT和AST活性上升显著的抑制。当用落新妇苷和RSG ext预处理NPC时，观察到对ALT和AST释放的剂量依赖性抑制，且落新妇苷显示出较RSG ext更强的活性。
此外，证实用5×10-5g/ml浓度预处理30多分钟后落新妇苷和RSG ext的这些抑制活性均导致对ALT释放的完全抑制和NPC功能完全丧失。然而，当用这些药物在共培养之前处理时，落新妇苷和RSGext二者均未阻止NPC对HC的细胞毒性。
因此，证实基通过选择性排除免疫细胞主要包括活化T细胞的功能而获得肝细胞损伤的改善。实验8对CCl4-诱导小鼠肝脏损伤的肝保护研究a.方法使用ICR雄性小鼠(每组8只小鼠)。口服落新妇苷(50或100mg/kg)及RSG ext(100或200mg/kg)6天。最后一次服用后一小时，将小鼠腹膜内注射溶于橄榄油中0.2％的CCl4(0.2ml/20g体重)。
对于对照研究，仅使用注射CCl4而没有用药的小鼠。此外，对于阳性对照研究，让小鼠口服150mg/kg联苯二甲基二羧酸(BDD)。
然后，施用CCl4后20小时，收集血样并用于通过常规方法测定血清ALT和血清AST活性。b.结果表2显示测试结果。
表2
*p＜0.01表2清楚地显示在对照组(施用CCl4组)中观察到ALT和AST活性异常的升高。然而，无论在落新妇苷还是RSG ext处理组中没有观察到效应。实验9对CCl4-诱导肝细胞损伤的肝保护研究a.方法从用于上面实验8中的正常小鼠中分离HC。将这些细胞用落新妇苷和RSG ext处理2小时。然后用WE培养液冲洗2次。冲洗后，将0.1ml溶于橄榄油中的0.2％CCl4加入到细胞中，并将得到的细胞孵育1小时。通过常规方法测定上清液中的ALT活性。b.结果落新妇苷与RSG ext没有影响从5×10-6到1×10-4g/ml浓度的CCl4处理HC中ALT的释放。
这些结果显示当在施用CCl4之前用药处理HC时，落新妇苷和RSG ext均未阻止CCl4对HC的细胞毒性。此外，6天的预防性施用这两种药物未能改善小鼠中CCl4诱导的肝脏损伤。因此，这些结果表明，落新妇苷及RSG ext通过选择性抑制主要包括活化T细胞的免疫细胞的功能而不是通过对HC的保护而改善肝脏损伤。实施例5类黄酮类及色酮类的效应实验1通过用苦基氯在小鼠中制备肝脏损伤使用6-8周龄的BALB/c雄性小鼠。用与实施例4中实验1中所述相同的方法，通过以5天的间隔在其腹部皮肤上涂抹0.1ml乙醇中0.1％的苦基氯而将小鼠致敏2次。第二次致敏后5天，将小鼠注射以10μl溶于橄榄油中的0.2％苦基氯至肝脏中。注射后12小时，通过改良的二步灌流方法分离HC与NPC。通过台酚蓝染色排斥测试发现得到细胞有大约90％是存活的，并用于下面的研究中。实验2细胞培养与ALT释放分析(NPC的预处理)a.方法将HC(WE培养基中2×104个细胞/0.2ml/孔)种植于96-孔微培养板并在具有5％(v/v)CO2空气中37℃孵育。
另一方面，将NPC于具有或不具有测试化合物的培养基中孵育1小时。测试化合物分别为式(I-a)的smitilbin、式(I-b)的落新妇苷、式(I-c)的engeletin及式(I-d)的eucryphin。
孵育5小时后，将HC的每个单层用培养基冲洗2次，且然后加入用上述测试化合物预处理或没有预处理的8×44个细胞的NPC。3小时进一步孵育后，收集上清液并用于通过常规方法分析ALT活性。b.结果结果示于图6中。
如图6中所示，在与没有化合物处理NPC共培养HC的上清液中(对照)观察到ALT活性异常的升高。另一方面落新妇苷、smitilbin和engeltin、具有类似结构的类黄酮类以类似的抑制强度剂量依赖性地抑制ALT活性。Eucryphin(一种色酮)显示出更强的抑制效应。
这些结果表明本发明的类黄酮类或色酮类通过抑制其免疫功能抑制肝脏浸入的NPC即，主要为活化T细胞对HC的细胞毒性。实验3细胞培养与ALT释放分析(HC的预处理)a.方法将WE培养基中的HC与测试化合物或不与测试化合物孵育1小时。然后，将HC种植于96孔微培养板(2×104个细胞/0.2ml/孔)并于具有5％(v/v)CO2的空气中于37℃孵育5小时。5小时后，将HC单层细胞用此培养基冲洗2次，且然后加入8×104个细胞的NPC。3小时连续孵育后，收集上清液用于通过常规方法分析ALT活性。该测试化合物与上面实验2中所述为相同的化合物。b.结果当其用于预处理HC，NPC诱导的ALT释放不受所有测试化合物影响。实验4细胞培养与ALT释放分析(对CCl4的影响)a.方法使用从正常小鼠中分离的HC。用测试化合物处理这些细胞2小时。处理后，冲洗细胞2次，并在加入0.1ml 0.2％CCl4后孵育1小时。收集得到的上清液用于通过常规方法分析ALT活性。对于对照研究，使用未用测试化合物处理的HC。
该测试化合物与实验2中所述为相同的化合物。b.结果在5×10-6到1×10-4g/ml浓度时测试化合物，smitilbin、落新妇苷、engeletin及eucryphin中没有一个抑制以CCl4损伤HC中ALT的释放。因此，这些结果表明这些化合物没有与在目前肝保护剂中见到相同的作为稳定肝细胞膜的肝保护作用。这表明这些化合物的肝保护作用是选择性抑制活化T细胞的免疫功能。
权利要求
1.免疫抑制剂，包括作为活性成分的活化T细胞的选择性抑制剂。
2.权利要求1的免疫抑制剂，其中所述的试剂用于治疗移植排异反应。
3.权利要求1的免疫抑制剂，其中所述的试剂用于治疗由骨髓(造血干细胞)移植所致的移植物抗宿主疾病。
4.权利要求1的免疫抑制剂，其中所述的试剂用于治疗自身免疫疾病。
5.权利要求4的免疫抑制剂，其中所述的自身免疫疾病为自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、溃疡性结肠炎、多发性硬化(MS)、硬皮病、重症肌无力、多发肌炎/皮肤肌炎、淋巴瘤性甲状腺肿、自身免疫性血细胞减少症、斯耶格伦综合症、脉管炎综合症或系统性红斑狼疮。
6.权利要求1的免疫抑制剂，所述的试剂用于治疗炎症反应、纤维化或由自身免疫疾病或其相关疾病所致具有组织损伤或感染的功能异常。
7.权利要求1的免疫抑制剂，其中所述的试剂用于治疗过敏性疾病。
8.权利要求7的免疫抑制剂，其中所述的过敏性疾病为支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、荨麻疹或花粉病。
9.权利要求1-8中任一项的免疫抑制剂，其中所述的试剂包括由下式(I)所代表的类黄酮类或色酮类作为活性成分
其中，R为氢原子或可由一个或2个羟基取代的苯基，Rha为α-L-鼠李糖残基，且点线表示具有或不具有双键。
10.权利要求9的免疫抑制剂，其中式(I)的R为氢原子、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基或3，5-二羟基苯基。
11.权利要求9的免疫抑制剂，其中式(I)的类黄酮类或色酮类为由下面通式所代表的式(I-a)的smitilbin、式(I-b)的落新妇苷、式(I-c)的engeletin或式(I-d)的eucryphin。
12.权利要求1到8中任一项的免疫抑制剂，其中所述的试剂包括含有权利要求9式(I)类黄酮类或色酮类的植物提取物作为活性成分。
13.权利要求12的免疫抑制剂，其中所述的植物提取物为土茯苓根茎提取物。
14.由下面的式(I-a)所代表的simtilbin。
全文摘要
提供一种很有效的免疫抑制剂,其通过选择性抑制活化T细胞而用于治疗自身免疫疾病、炎症反应、纤维化或由自身免疫疾病及其相关疾病所导致的具有组织损伤或感染的功能异常、移植的排异反应、由骨髓(造血干细胞)移植造成的移植物抗宿主疾病或过敏性疾病。
文档编号A61K31/44GK1260173SQ99118849
公开日2000年7月19日 申请日期1999年9月14日 优先权日1998年9月14日
发明者徐强, 济木育夫, 陈婷, 小松加津子 申请人:徐强