专利名称：Fsh和fsh变体制剂,产品和方法
技术领域：
本发明涉及到该领域已知的促卵泡激素(FSH)或促卵泡激素变体(FSH变体)的新制剂，制成品和使用制剂的方法。本发明还提供了有益的、多用途和稳定的溶液、制剂和医药产品，它们以前从未用于医疗。这些制剂和产品对于以在一段治疗时期增加FSH或FSH变体的血清含量为目的的治疗服法尤其有用。这样，本发明尤其满足了在不育治疗中对于含有FSH或FSH变体的方便稳定和防腐的溶液，制剂和产品以及对它们的使用的需求。
背景技术：
FSH可用于不育症。患者通过每天或两天一次的肌肉(IM)或皮下(SC)注射给药，注射量随其反应而调整，通常为75-300IU/天。FSH的半衰期很短，使得患者必须连续进行几天注射，视其卵巢和睾丸反应每天或两天一次。一种更稳定的FSH或FSH变体的制剂可提高其在治疗中的应用。
尽管FSH从未通过除IM或SC以外的获准给药方式进行给药，其他的药用蛋白可在较长的一段时期内给药。包括常规IM或SC注射、透皮贴剂(transdermal patches)、植入物、渗透泵、微型泵、药筒(cartridge)、肺送递系统及其它方式在内的送递方法均可在诸如辅助患者适应，降低不适或辅助给药等方面具有作用。这些长期的治疗服法通常需要稳定的溶液或制剂中加入防腐剂。
防腐剂一方面防止或尽可能将的制剂中的有害微生物污染。对于传统的非蛋白治疗剂，抗微生物防腐剂如双氯苯双胍己烷、苯酚、苯乙醇、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸、烷基对羟基苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基及其他类似基团)、氯下烷铵、氯化苄乙氧铵、sodium dehydroacetate andthimerosal及其各种混合物通常加入制剂以确保其在销售期间和/或多种服用时无菌(Akers,MJ,Pharmaceutical Sciences,17thedition.,Mack,Easton,PA.,1279-1280,1985)。这一大类防腐剂对蛋白质的稳定有害。例如，十分有效的防腐剂间甲酚据报道可同蛋白质结合并使之变性(Development of PharmaceuticalParenteral Dosage Forms,Bontempo,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,pp.118-119,1977)。诸如人类生长激素这样的激素溶液的稳定性还面临着特殊的困难(Maa YF and Hsu C,International Journal of Pharmaceutics,140,pp.155-168,1996)。
FSH是异二聚体糖蛋白激素家族中的一员，该家族包括促甲状腺素(TSH)、绒毛膜促性腺激素(CG)和黄体生成素(LH)(Pierce JGand Parsons TF,Annu.Rev.Biochem.,50,465-495,1981；Baenziger and Green,Biochem.Biophys.Acta.,947,287-306,1988)。本家族的成员为异二聚体，通过非共价作用将两个不同的亚基结合在一起。人FSH(hFSH)二聚体包括(ⅰ)一条成熟的92氨基酸的α亚基，它是人类家族其它成员(如，绒毛膜促性腺激素(“CG”)、黄体生成素(“LH”)和促甲状腺素(“TSH”))所共有的；(ⅱ)一条成熟的111氨基酸的β亚基，它为FSH所特有(Shomeet al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39:187-205(1974)；Shome,et al.,Prot.Chem.,7:325-339,1988)。α和β亚基非共价结合，这使得该结合被认为对蛋白质去稳定剂更敏感。
人类或其它哺乳类的天然FSHα和β亚基氨基酸序列以及这些序列的一些变体在1982年以前便已了解得很清楚，人类或其它哺乳类活性FSH在哺乳细胞中的克隆和表达在1985年以前便已完成。从纯化的蛋白中对光有的促性腺激素α亚基(FSHα)进行测序(Bellisarioet al.,J.Biol.Chem.248:6796(1973)；Morgan et al.,J.Biol.Chem.250:5247(1973))随后将其克隆并表达(Fiddes et al.,Nature 281:351(1979)；Nature 286:684(1981)；J.Molec.Appl.Genet.1:3-18(1981))。FSHβ亚基也从纯化的蛋白中进行测序(Shomeet al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39:187(1974)；Saxena et al.,J.Biol.Chem.251:993(1976))；(Sairam et al.,Biochem.J.197:541(1981)；Fujiki et al.,Biochem.Biophs.Acta624:428(1980))。Integrated Genetics报道了人类CG的重组表达(Biotechology Newswatch(p.3,June 20,1983)；Chemical andEngineering News 61:47(Nov.21,1983)；Genetic Technology News3:9(Dec.12,1983))以及它的活性形式(biotechnology Newswatch,Jan.16,1984),也报道了FSH的成功克隆(Genetic EngineeringNewsletter 4:4(August 10,1984))和重组FSH在哺乳类细胞中的活性形式(DNA 4:76(Jan.16,1985))。Amgen还报道了活性牛LH在CHO细胞中的表达(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:7280(Nov.1985))。
有相当多的文献证据表明异源二聚体蛋白激素可在生理或酸环境中解聚(Ryan,R.J.,et al.,Recent Progr.Hormone Res.26:105-137；1970,Strickland,TW and Puett,D,J.Biol.Chem.,257:2954-2960；1982,Reichert LE and Ramsey Rb,J.Biol.Chem.,250:3034-3040；1975)。完整的二聚体对于FSH的生物活性和分泌是十分重要的(Baenziger JU and Green ED,Biochem.Biophys.Acta,947:287-306,1988；Corless,et al.,J.CellBiol.,104:1173-1181,1987)。降低FSH的不稳定性的尝试包括将两亚基合并到一个稳定分子中以产生一个单链分子，以及产生额外的二硫键以稳定两亚基间的相互作用(Sughara T.,et al.,J.Biol.Chem.,271:10445-10448,1996；Heikoop J.C.,et al.,NatureBiotech,15:658-62,1997)。
Donaldson，美国专利号No.5,162,306，直接相关于包括FSH和LH的兽用组合物。这些组合物在麝香草酚(5-甲基-2(1-甲基乙基)苯酚)中表现得很稳定。据Danaldson报道，麝香草酚是U.S.P.XXI中的在已公布的SUPER-OV制剂中对糖蛋白无害的防腐剂之一(美国专利号No.5,162,306)。
来自绝经后妇女的尿源FSH(hMG，其商品如Organon的Menotropin或HumagonTM以及Serono的urofollitropin或MetrodinTM)30多年来在生殖辅助技术(ART)计划中用于排卵病人的多卵泡发育以及诱导无卵泡型不孕症患者的排卵(Fauser BCJM andVan Heusden AM,Endocrine Rev.,18,7l-106,1997)。最近，来自CHO细胞的重组人FSH(rhFSH)已经可以得到(Keene J.L.,et al.,J.Biol.Chem.,264:4769-4752,1989；Loumaye E.,et al.,HumanReprod.Update,1:188-199,1995；Olijve W.,et al.,Mol.Hum.Reprod.,2:361-369,1996)。
当前的药用FSH(hMG或rhFSH)以冻干形式提供在75 IU/瓶或150 IU/瓶的安瓿瓶中可在2-25℃下保存一年半到两年。建议进行十天以内的起始药量为75IU或150IU的每日注射以使hFSH的浓度达到稳定，此浓度约为一次单独给药后浓度的1.5-2.5倍。这一给药法产生的药物浓度对于治疗效果十分必要，因为FSH通过阈机制发挥作用(Schoemaker J.,et al.,ANN.NY.Acad.Sci.687:296-299,1993)。根据患者的反应，可进行多至3个疗程的不断增加药量的治疗。患者或其伴侣必须每天将冻干的药物以溶剂再配并立即给药(Package insert N1700101A,published in February 1996,for FertinexTM(urofollitropin for injection,purified)forSubcutaneous injection,by Serono Laboratories,Inc.,Randolph,MA)。不用的物质应予以抛弃。
因此，该领域需要开发FSH或FSH变体蛋白的稳定和防腐制剂及相关制成品以提高病人的顺应性。当长期治疗是必须或有益的时尤其需要这些稳定制剂例如用FSH治疗不育症时。提供可获准用于在24小时或更长的时期内的多用途给药的FSH或FSH变体产品也是需要的。本发明还提供了FSH或FSH变体及相关制成品的新的稳定溶液和制剂和防腐溶液和制剂，它们也可获准在24小时或更长的时期使用。
发明概要该发明提供了新的FSH或FSH变体的制剂，它们的制备，它们在医疗和兽医学上的生育力紊乱的治疗中的应用及相关制成品。
在一方面，本发明提供了防腐的溶液和制剂，它包括FSH或FSH变体和一种防腐剂，该防腐剂选自酚、间甲苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸(甲，乙，丙，丁酯及其类似物)、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，的水性稀释液。此防腐溶液和制剂还可以根据情况而含有一种选定的缓冲液或盐。
另一方面，本发明提供了包含FSH或FSH变体和一种选定的缓冲液的稳定的溶剂或制剂，缓冲液优选为含有盐水或选定的盐类的磷酸缓冲液。
在另一方面，本发明提供了向包括对有需求的患者给药的用于不育症治疗的FSH或FSH变体的防腐制剂，它溶于含至少一种防腐剂的溶液中，该防腐剂选自酚、间甲苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸(甲，乙，丙，丁酯及其类似物)、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，另一方面，本发明提供了不育症治疗方法，包括对有需求的患者给药FSH或FSH变体的稳定制剂，它溶于一稳定溶液中，该溶液优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液。
本发明另一方面提供了制备至少一种FSH或FSH变体的多剂量制剂的方法，包括将FSH和至少一种防腐剂相混合，该防腐剂选自酚、间甲苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、氯甲酚、苄醇烷基对羟基苯甲酸(甲，乙，丙，丁酯及其类似物)、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，的水性溶液。
本发明另一方面提供了制备至少一种FSH或FSH变体的稳定制剂的过程，该制剂包括同稳定溶液或制剂相混合FSH或FSH变体，该溶液或制剂优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液。
本发明还提供了用于人类医疗的制成品，包括包装材料和药瓶，瓶中含有FSH或FSH变体和一种防腐剂的溶液，此处所述的包装材料包括一个表明该溶液可使用超过24小时或更长时间的标签。本发明还提供了用于人类医疗的制成品，包括包装材料和药瓶，第一个药瓶含有冻干的FSH或FSH变体，第二个瓶中含有防腐剂，此处所述的包装材料包括一个标签用以指导患者用防腐溶液再配FSH或FSH变体以形成可在所述条件下使用超过24小时或更长时间的溶液。
发明还提供了用于人类医疗的制成品，包括包装材料和药瓶，含有冻干的FSH或FSH变体和第二种稳定溶液或制剂，该溶液或制剂优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液，此处所述的包装材料包括一个表明该溶液可使用超过24小时或更长时间的标签。
本发明还提供了用于人类医疗的制成品，包括包装材料和药瓶，第一个药瓶含有冻干的FSH或FSH变体，第二个瓶中含有防腐剂，此处所述的包装材料包括一个标签用以指导患者用防腐溶液再配FSH或FSH变体以形成可在所述条件下使用超过24小时或更长时间的溶液。
本发明还提供了用于人类医疗的制成品，包括包装材料和药瓶，含有冻干的FSH或FSH变体和第二种稳定溶液或制剂，该溶液或制剂优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液，此处所述的包装材料包括一个标签用以指导患者用稳定溶液再配FSH或FSH变体以形成可在所述条件下使用超过24小时或更长时间的溶液。
详述一方面，本发明提供了重组或/纯化或分离而得的FSH或FSH变体溶液和制剂，制成品，使用或治疗方法以及药用产品，它们的稳定超出预期且/或适于长期或多方面用途。效用这些具备改进的性质或稳定性的FSH或FSH变体的溶液和制剂，制成品，使用或治疗方法对于妇女和男子不育的治疗十分有效。这些制剂和制成品还适用于可注射的和可供选择的递送系统，例如，但不限于鼻腔、肺、透粘膜、透皮肤、口腔、皮下、肌间或非肠胃的持续释放，液体或干制剂。通过防止或降低活性或稳定性的丧失，或通过提高给药的效率或期望值，如在以下任一方面的提高，模式、频率、药量、舒适度、使用方便性、体内或体外的生物活性等等，所提供的TSH和TSH变体在单独或与至少一种额外的促性腺激素组合给药时，同已知的商品比较还具有增强的体内效力。引用本文引用的出版物或专利均在此列为参考，它们表明了该领域与本发明同期以及引用的相关发明申请的归档日期的状况。归为参考的引用如下:Ausubel,et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,NY(1987-1999)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEditon,Cold SpringHarbor,NY(1989)；Harlow and Lane,Antibodies,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Collogan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,N.Y.(1994-1999)；Colligan et al.,eds.,Current Protocols inProtein,John Wiley and Sons,N.Y.(1994-1999).定义本文定义的促卵泡激素“FSH”或促卵泡激素变体“FSH变体”，无论是重组产生还是分离获得的，在本领域中已被熟知。这里使用的FSH指的是全长的成熟蛋白，它包括无论是重组产生还是人源分离获得的人类FSH或“hFSH”(见Shome B.,et al.,J.Prot.Chem.,7:325-339,1988；Saxena B.B.and Rathnam P.,J.Biol.Chem.,251:993-1005,1976；Watkins,et al.,DNA,6:205-212,1987；Shome B.and Parlow A.F.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39(1):203-205,1974；Beck,et al.,DNA,4:76,1985；美国专利号5,405,945和美国专利号5,639,640-每一引用均合并与参考文献中)，但不限于此。序列标识号No.5提供了人类FSHα亚基的蛋白序列，序列标识号No.6提供了人类FSHβ亚基的蛋白序列。各种FSH变体也为本领域所熟知(见Shome et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39:187(1974)；Saxena et al.,J.Biol.Chem.251(4):993-1005(1976)；Sairam et al.,Biochem.J.197:541(1981)；另见Closset Eur.J.Biochem J 197:541(1981)；Fujiki,J.Biol.Chem.253:5363-5368(1978)；Sairam,Biochem.J.541-552(1981)-每一引用均独立包含于参考文献中)。***先前工艺的FSHβ亚基还包括Saxena序列及Sairm在关于(a)进化上保守的氨基酸和(b)已详知的且被表征的序列错误的讨论中提及的一类序列。本领域人员应当知道先前工艺确认的氨基酸用(ⅰ)化学上近似的氨基酸或(ⅱ)进化上保守的氨基酸的替换对含有这样修饰过的hFSHβ亚基的FSH异二聚体的生物学活性无影响。
特别是在关于Saxena hFSH序列的说明以及关于功能FSH分子间的已确认的氨基酸替换的讨论中，Sairam定义了先前工艺中的一类FSHβ链序列。更具体地，1981年，根据Saxena et al.,Shome et al.,Closset et al.和Fujiki et al.,Sairam在Sairam,Biochem J197:541,551(1981)中发表确认了保守氨基酸序列。先前工艺(1)为Saxena的FSHβ亚基序列优于Shome的FSHβ亚基提供了证据；(2)提出了羧基端的异质性address；(3)提出受分子中种间差异影响的部分对激素的活性影响并不重要；(4)强调了种间以及三种糖蛋白FSH,LH,TSH的β链间的同源性。
C端异质性在除猪FSH外的所有已发表序列中均有报道，猪FSH的C端残基只能是甘氨酸。对于27位，Saxena认为这个位置上是一个色氨酸残基，对于FSH-B的24位。进化上的保守亦支持它为一个色氨酸。对于44位和46位，Saxena显示44位上的残基应是精氨酸而非赖氨酸，46位上应为赖氨酸而非精氨酸。猪、码、绵羊的序列也反映了进化对于44位上精氨酸的压力。21、22和44位上的变化涉及到结构上的保守替换或进化上的保守(同源)替换，它们均有生物活性。
Sairam,Shome和Closset的参考文献在21-22的残基均公布为异亮氨酸和丝氨酸，而在这些位置Saxena公布为亮氨酸和苏氨酸，Fujiki公布为异亮氨酸和苏氨酸。公布的这些不仅是进化上的保守替换而且是结构上的保守替换。41位上天冬氨酸和天冬酰胺之间的变化涉及到两个进化上保守的残基，它们均提供生物活性，天冬氨酸为Sairam,Shome,Closset和Fujiki公布，天冬酰胺为Saxnea,Closset和Sairam公布。这些保守替换和进化上保守的替换的公布指导有经验的技术人员在hFSH-B链类群中分辨FSHβ亚基变体。
此处的FSH的变体是羧端经删除的β亚基，它短于序列标识号N0:6的全长成熟蛋白。序列标识号NOS:11、12和13给出了人类β亚基的羧端删除。β亚基的羧端变体被认为同已知的α亚基形成二聚体而成为FSH变体异二聚体。另外已知了许多种FSH，包括猪FSH(序列标识号NOS:7和8)，马FSH(序列标识号NOS:3和4)，牛FSH(序列标识号NOS:1和2)，绵羊FSH(序列标识号NOS:9和10)及在Combarnous Y.,Endocrine Reviews,13(4),670-691,1992-包含于参考文献-中所引用的。如本文进一步给出，其他的羧基变体被认为可由该领域的技术人员从给定的物种中制造和制备出。
FSH异二聚体或FSH变体异二聚体可由适当的方法生产，如，重组生产、由天然来源分离或纯化、化学合成、或综合使用各方法。FSH异二聚体或FSH变体异二聚体的非限制实施例包括一α亚基和一β亚基，它包括以下序列，但不限于这些序列(a):α-亚基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亚基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亚基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亚基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亚基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亚基(SEQ ID NO:5)
APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK术语“重组”的使用指的是通过重组DNA技术进行FSH或FSH变体的重组生产(如Boine et al.,Seminars in ReproductiveEndocrinology 10,45-50,1992，另如本文进一步提供或示例)。已知了几个物种的α和β亚基的基因组或cDNA序列(Fiddes,J.C.,etal.,J.Molec.Appl.Genet.1:3-18(1981)；Esch F.S.,et al.DNA 5:363-369(1986)；Watkins P.C.,et al.,DNA 6:205-212(1987)；Hirai T.,et al.,J.Mol.Endocrinol.5:147-158(1990)；Maurer,R.A.,et al.,Mol.Endocrinol.1:717-723(1987)；Guzman K.,et al.,DNA Cell Biol.10:593-601(1991)；Kumar TR,et al.,Gene.1995 Dec 12；166(2):335-6；Kumar TR,et al.,Gene.1995 Dec 12；166(2):333-4-在此引入作为参考)。序列标识号14-20提供了α和β亚基的几个DNA序列。用编码α和β亚基的DNA转染真核细胞，无论各有一个启动子的每一亚基在一个载体上还是在两个载体上，均可产生完整的二聚体，用其他本领域已知的方法亦可。
根据本发明所使用的FSH或FSH变体不仅可通过包括由哺乳细胞或转基因制备在内的重组方法产生，还可从其它生物来源纯化，如尿源纯化。可接受的方法包括在Hakola,K.Molecular and CellularEndocrinology,127:59-69,1997；Keene,et al.,J.Biol.Chem.,J.Biol.Chem.,264:4769-4775,1989；Cerpa Poljak,et al.,Endocrinology,132:351-356,1993；Dias,et al.,J.Biol.Chem.,269:25289-25294,1994；Flack,et al.,J.Biol.Chem.269:14015-14020,1994；Valove,et al.,Endocrinology,135:2657-2661,1994和美国专利号3,119,740中所描述的方法。
“基本纯”用于蛋白或多肽时指的是它们从其它细胞或非细胞分子中分离而得并含有其它蛋白分子。基本纯的制备物纯度至少85％，至少95％更优。基本纯的蛋白可通过为熟练技术人员所掌握的多种技术来制备，例如高压液相色谱(HPLC)和本领域中已知的或本文阐述的方法。
术语“给药”指的是向有需要的患者体内引入本发明的制剂以治疗疾病或症状。
术语“患者”指的是接受疾病或症状治疗的哺乳类动物。患者可以是以下生物，人类、绵羊、猪、马、牛、兔及其他类似生物，但并不限于此。
术语“烷基对羟基苯甲酸酯(alkylparaben)”指的是可用作抗微生物试剂的生理可耐受的C1-C6烷基对羟基苯甲酸酯。非限制性的例子至少包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。
术语“水性稀释剂”指的是含水的液体溶剂。水溶剂系统可以只包括水或水加上一种或多种可混合溶剂，还可以含溶于其中的溶质如糖或其它赋形剂。较常用的可混合溶剂是短链的有机醇，如甲醇、乙醇、丙醇，短链的酮，如丙酮，以及多羟基醇，如甘油。
“等渗试剂”是一种生理可耐受的化合物，它使制剂的透性适当以防止与制剂接触的细胞膜的水的净流入(net flow)。诸如甘油这样的化合物常在已知浓度下用于该目的。其他合适的等渗试剂包括氨基酸和蛋白质(例如甲硫氨酸和白蛋白)、盐(例如氯化钠)、和糖(例如葡萄糖、蔗糖和乳糖)以及其他本领域已知的化合物，在此引为参考。
术语“防腐剂”指的是加入至制剂中作为抗微生物、抗真菌、抗支原体、抗病毒、抗朊病毒和/或抗细菌试剂的化合物或组合物。含有本发明的制剂的防腐FSH或FSH变体更好地符合了商品化多用途产品的防腐效果的法令法规。合适的防腐剂包括但不限于氯化苄乙铵、洁尔灭、双氯苯双胍己烷、苯酚、间甲苯酚、苄醇烷基对羟基苯甲酸酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯及其他类似基团)、脱氢乙酸钠、邻甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞苯甲酸和它们中的至少一种的混合物。例见Wallhauser,K.,Develop.Biol.Standard.24,pp.6-28(Basel,S.Krager,1974)。
术语“磷酸缓冲液”指的是含磷酸根离子的赋形剂。磷酸缓冲液一般由磷酸或磷酸盐制备，如钠盐或钾盐。本领域已知几种磷酸盐，如钠和钾的单价、二价和三价盐。已知磷酸盐还以水合的形式存在。磷酸缓冲液的pH范围很关，如从4到10,5到9则更优，最好是在6.0和8.0之间。本发明的制剂pH值最好在约6.8到7.8之间，包括pH7.0、7.2、7.4。钠离子或钾离子为较优选的离子，它们单独或共同存在于溶液中，如磷酸氯化钠缓冲液(PBS)。磷酸氯化钠缓冲液在本领域中为人们熟知，如Dulbecco的磷酸氯化钠缓冲液。溶液中盐的浓度在5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM到500mM之间变化。离子含量最好在10mM、50mM或100mM以上。
术语“药瓶”宽泛地指适于在无菌状态下盛放FSH和稀释液的容器。本文使用的药品的例子包括安瓿瓶、药筒(cartridge)、包装泡(blister package)或其它适用于泵(包括渗透泵)，导液管，透皮贴剂(transdermal patches)，药筒，肺、跨粘膜或非肠胃送递系统的容器。适合包装用于肺、跨粘膜或透皮给药的产品的药瓶在本领域已为人们所熟知。
术语“稳定性”指的是本发明的制剂的物理、化学和结构构象的稳定。蛋白质制剂的不稳定可能导致化学降解或蛋白分子聚集成高度多聚体，这是由于异二聚体解聚成单体、去糖基化、糖基修饰及其它结构修饰造成的，它们至少可以减低包含于本发明中的FSH多肽一种生物活性。
“稳定”溶液和制剂是指其中的一种蛋白的降解、修饰、聚集、生物活性的丧失等程度及处于可接受的控制之内且该程度随时间的增加亦非不可接受，优选的“稳定”溶液或制剂为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液。稳定性可通过本领域所熟知的方法评测，包括测量样品的光散射、光表观衰减(吸收或光密度)、大小(例如分子量排阻层析)、体内或体外生物活性和/或通过差示量热扫描法(DSC)。其他本领域所熟知的方法也可根据本发明而使用。
术语“治疗”指的是对适于FSH给药的患者进行给药、跟踪监控、处理和/或看护，其目的在于获得卵泡或睾丸刺激或其它受FSH调控的生理反应。治疗可以包括用于诱导或提高卵泡或精子发育或诱导排卵的FSH给药，但不限于此。另外，预期治疗可用于恢复雄性的正常精子发生。
“盐”指的是生理可耐受的FSH的盐。该盐由蛋白质的任一或多个带电基团和任一或多个生理可耐受的无毒阴离子或阳离子之间形成。有机和无机盐包括由诸如盐酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富马酸、氢溴酸、羟基乙酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、安息香酸、抗坏血酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸(naphthalenesulfonic)、丙酸、碳酸等这样的酸或诸如铵、钠、钾、钙或镁等这样的离子制备而的得。本领域的其它适合的盐也包括在内。
术语“缓冲液”或“生理可耐受的缓冲液”指的是在制剂中可安全用于药用或兽用的化合物且其在制剂所需的pH范围内可维持制剂效能或控制pH。可在温和的酸pH和碱pH间控制pH的可行缓冲液包括诸如磷酸、乙酸、柠檬酸、精氨酸、TRIS和组氨酸这样的化合物，但不限于此。“TRIS”指的是2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇和它的任何药学上可接受的盐。优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液。其他生理可耐受的或适于在所需条件下控制pH的缓冲液包括于本发明内，它们已为具备本领域普通技术的人员所知。编码FSH或FSH变体的核酸利用依据于一寡核苷酸或已知核酸序列的探针可检测cDNA或基因组文库以得到编码已知FSH序列的克隆。可以用探针同基因组或cDNA序列进行杂交以从相同或不同的有机体中分离同源DNA序列。本领域的技术人员认为不同严紧程度的杂交可用于分析且杂交或介质洗涤均可以是严紧的。随着杂交条件变得更加严紧，探针和目标之间的互补程度会提高。严紧程度可通过温度、离子强度、pH和部分变性剂如甲酰胺的存在而加以控制。例如，通过控制甲酰胺的含量于0-100％之间而改变反应溶液的极性可以便捷地改变杂交的严紧程度。可检测结合所需的互补度(序列识别)将随介质杂交和/或介质洗脱的严紧度而变化。最佳互补度为100％；然而，必须认识到降低杂交和/或介质洗脱的严紧度可补偿探针和引物序列上的微小变化。
本领域中的RNA或DNA的扩增方法已为人所熟知，它们可根据本发明所提供的指导无需过度的试验，而在合适的实验中使用。通过PCR的选择性扩增方法可对核酸序列小片段，如编码已定义的FSH变体β链的核酸，进行操作。这样的扩增技术可向扩增序列加入便捷的终止信号、限制性切点等类此序列。
已知的DNA或RNA扩增方法包括，多聚酶链反应(PCR)和相关扩增过程(例见Mullis,et al.的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；Innis的美国专利号5,142,033；Wilson et al.的美国专利号5,122,464；Innis的美国专利号5,091,310；Gyllensten,et al.的美国专利号5,066,584；Gelfand,et al.的美国专利号4,889,818；Silver,et al.的美国专利号4,994,370；Biswas的美国专利号4,766,067；Ringold的美国专利号4,656,13)，以及RNA依赖的扩增，其使用目标序列的反义RNA作为双链DNA合成的模板(Malek,et al.的美国专利号5,130,238；商品名NASBA,Ausubel，见上文；Colligan，见上文；Sambrook，见上文；全文引入作为参考)，但扩增方法并不限于这些。
例如，多聚酶链反应(PCR)技术可用于从基因组或cDNA文库直接扩增聚核苷序列或相关DNA序列。在诸如克隆编码表达蛋白的核酸序列，获取FSH或FSH变体，产生用作从样品中检测所需mRNA的探针、用于核酸测序或其他目的的核酸这样的实验中PCR和其他体外扩增法方法都是有用的。充足的指导技术人员的体外扩增方法实例可见于上文中Berger,Sambrook，和Ausubel的文献，以及Mullis,etal.的美国专利号4,683,202(1987)；Innis,et al.,PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications,Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,CA(1990)。用于基因组PCR扩增的商品化试剂盒在本领域已为人所知。例见Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可提高长PCR产物的产量。用于构建核酸的合成方法表达上述FSH或FSH变体所需的核酸还可通过直接化学合成法制备，如Narang,et al.,Meth.Enzymol.68:90-99(1979)中的磷酸三酯法；Brown,et al.,Meth.Enzymol.68:109-151(1979)中的磷酸二酯法；Beaucage,et al.,Tetra.Letts.22(20):1859-1862(1981)中的diethylphosphoramidite法；Beaucage andCaruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862(1981)中描述的固相phosphoramidite三酯法；利用自动合成仪；Needham-VanDevanter,et al.,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述方法；以及美国专利号4,458,066中的固相支持物法。化学合成通常产生单链寡聚核苷酸，其可通过同互补序列杂交或以单链为模板用DNA聚合酶进行多聚化来转变成双链DNA。本领域的技术人员认为尽管化学合成的DNA限于100个碱基以内的序列，可以通过连接较短序列以得到较长的序列。重组表达盒如本领域所知，利用重组表达盒可以表达已知FSH或FSH变体的编码核酸。核酸序列，如编码全长亚基的cDNA或基因组序列，可用于构建重组表达盒，该盒可引入所需的宿主细胞。但在本领域中，据认为为获得有功能的异二聚体必须同时表达两个亚基，无论在它们在一个质粒或两个不同质粒中引入。一个典型的重组表达盒包括同可作用于其上的的转录起始调控序列相连的一段多聚核酸，该调控序列在宿主细胞中可控制各亚基的多聚核酸的转录。本领域熟知用以表达FSH的这些方法(例如CHO细胞产生的重组人类FSH(hFSH)；(KeeneJ,L.,et al.,J.Biol.Chem.,264:4769-4752,1989；Loumaye E.,et al.,Human Reprod.Update,1:188-1999；Oliyve W.,et al.,Mo.Hum.Reprod.,2:361-369,1996)。
异源和非异源的启动子(如内生启动子)均可用于编码FSH或FSH变体亚基的核酸的直接表达。通过重组技术的普通生产方法已为本领域所熟知.例见Sambrook,et al.,1989；Ausubel,et al.,1987-1987，均全文引入作为参考。载体和宿主细胞编码FSH和FS或变体α和β亚基的多聚核酸可同含用以在宿主中扩增的选择标记的载体相连。一质粒载体(或多个质粒载体，当α和β亚基在不同载体上时)通常在沉淀物中，如磷酸钙沉淀，或同带电的脂成复合物而被引入。如果载体是病毒，可利用适当的包装细胞系对其进行体外包装然后转导入宿主细胞。
每一亚基的DNA插入组件均须同可对其作用的适当启动子连接，如SV40的早期或晚期启动子或反转录病毒长末端重复序列启动子。其它的合适启动子为有经验的技术人员所熟悉。表达结构还进一步包括转录起始和终止位点以及转录区域内的翻译所必需的核糖体结合位点。该结构表达而得的成熟转录本的编码部分最好包括一起始处的翻译起始密码子和mRNA末端适当位置处的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)。
较优选的表达载体包括至少一个选择标记。这样的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新生霉素抗性基因以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素或氨苄青霉素的抗性基因。合适的宿主细胞的代表性例子包括真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇S2和草地夜蛾SF9细胞；动物或哺乳类细胞，如CHO、COS、AV-12、HEPG2、NIH3T3和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞，其中CHO为较优选的细胞。适合于上述宿主细胞的培养基和环境已为本领域所知。优选的真核载体包括可从Stratagene购得的pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1,pSG；及可从Pharmacia购得的pSVK3,pBPV和pMSG。其它的合适载体为有经验的技术人员所熟悉。
向宿主细胞引入一个或多个载体可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂类介导的阳离子转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来完成。这些方法在许多标准实验室手册中均有描述，如Sambrook的上述文献第一至四章和十六至十八章；Ausubel的上述文献第一、九、十三、十五、十六章。
预计FSH或FSH变体可以以修饰过的形式表达，如成融合蛋白，而且不仅可以包括分泌信号还可以包括附加的异源功能区。例如可以将一段附加的氨基酸，特别是带电氨基酸加至多肽的N末端，以增强其在宿主细胞、纯化或其后的操作和储存过程中的稳定性和耐久性。小肽段也可加入多肽以辅助纯化。这些区域可在所需FSH或FSH变体最终制成前去除。这些方法在许多标准实验室手册中均有一般性描述，如Sambrook的上述文献第17.29至17.42章和18.1至18.74章；Ausubel的上述文献第16、17和18章。蛋白在宿主细胞中的表达利用本发明的核酸序列或本领域已知的序列可以在经重组工程处理的真核细胞，如哺乳细胞中表达FSH或FSH变体的α和β亚基。本领域的技术人员预计对于用以表达编码含两个亚基的蛋白的核酸的众多表达系统知之甚稔。对已知的用于蛋白质真核表达的不同方法不再赘述。
简而言之，典型的编码FSH或FSH变体的核酸通过将α和β亚基的DNA或cDNA分别同启动子(结构或诱导启动子)可行地相连，然后组成表达载体而进行表达。或者载体还可以插入DNA而提供一合适启动子。载体可适用于真核细胞中的复制或整合。典型的表达载体包括用于调控编码本发明蛋白的DNA转录的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为获得克隆入基因的高水平表达，构建至少包括有一个控制转录的强启动子、一个用于翻译起始的核糖体结合位点、以及一个转录/翻译终止子。本领域的技术人员认为可在不降低生物活性的情况下进行修饰。某些修饰可用于辅助克隆、表达或将目标分子并入基因组。这些修饰为本领域技术人员所熟知，它们包括提供定位方便的限制性切点、终止密码子或纯化序列。
另外，还可通过对含编码所需α和β亚基的内源DNA的宿主细胞进行处理以表达该核酸。这些方法在本领域为人们所熟知，如美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761所述，全文引入作为参考。真核表达各种真核表达系统，如哺乳细胞，为本领域中的技术人员所熟知。正如下文的简要解释，编码已知的FSH或FSH变体α和β亚基的一段核酸序列可在这些真核系统中表达。
在酵母中合成异源蛋白为人们所熟知。F.Sherman,et al.,Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是一篇被广泛接受的文献，它描述用于在酵母中生产蛋白的多种方法。酿酒酵母和Pichia pastoris是两种广泛用于真核蛋白生产的酵母。用于在酿酒酵母和Pichia中进行表达的载体、菌株和方案在本领域为人们所熟知并可购自供应商(如，Invitrogen)。合适的载体通常具有表达控制序列，例如，启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶和乙醇脱氢酶启动子，复制原点和终止序列等类似序列。
编码FSH和FSH变体α和β亚基的序列连于多种表达载体用一转染诸如哺乳细胞、昆虫细胞或植物细胞这样的细胞群落。哺乳细胞是用于产生肽链的细胞群落的说明性的例子。尽管哺乳细胞悬浮物也可使用，哺乳细胞系统通常为单细胞层。本领域已经开发出多种可表达完整蛋白的合适的细胞系，它们包括HEK93、BHK21、和CHO细胞系，其中CHO细胞系为优选细胞系，例如来自Lonza的CHO K1。用于这些细胞的载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子(例如较优选的CMV启动子、HSV tk启动子、EF1α启动子、SV40的早期或晚期启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen,et al.,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪切位点、多聚腺苷酸化位点(例如SV40的large T Ag多聚加A位点)和转录终止序列。还有一些其它的可用于生产本发明蛋白的动物细胞，例见American Type Culture Collection Catalogueof Cell Lines and Hybridomas(7th,1992)。优选的宿主细胞包括CHO细胞，如CHO-K1，优选的载体包括GS载体，它们均可得自LonzaBiologics PLC(Slough,Bershire,England,UK)。
用于在昆虫细胞中表达FSH和FSH变体α和β亚基的合适载体通常来自SF9杆状病毒。合适的细胞系包括蚊幼虫、蚕、粘虫、蛾和果蝇细胞系，例如Schneider细胞系(见Schneider,J.Embryol.Exp.Morphol.27:353-365(1987))。
同酵母一样，使用高等动物或植物宿主细胞时载体也应加入多聚腺苷酸化或转录终止序列。终止序列的一个例子是来自牛生长激素的多聚腺苷酸化序列。用于转录本的精确剪切的序列也应包含在内。剪切序列的一个例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague,et al.,J.Virol.45:773-781(1983))。另外，控制其在宿主中的复制的基因序列也可融入载体，如牛乳突淋瘤病毒type-载体那样。M.Saveria-Campo,Bovine Papilloma Virus DNA,a Eucaryotic Cloning Vectorin DNA Cloning Vol.II,a Practical Approach,D.M.Glover,Ed.,IRL Press,Arlington,VA,pp.213-238(1985)。蛋白纯化经表达而得的FSH或FSH变体可通过标准蛋白分离技术从细胞中分离成溶解物。纯化过程的监测可利用Western印迹技术或其它标准免疫分析技术的放免分析。
含一个α和β亚基的FSH或FSH变体的获得和纯化可通过广为人知的方法来完成，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、分子量排阻层析、凝集素层析。较优选的纯化方法有高压液相色谱(“HPLC”)、阳离子交换层析、亲和层析、分子量排阻层析或以上方法的综合使用。含一个α和β亚基的FSH或FSH变体包括天然纯化产品、化学合成产品以及通过重组技术从真核细胞产生的产品，这些真核细胞包括酵母、高等植物、昆虫和哺乳细胞。本发明的多肽可以是糖基化和非糖基化的蛋白，这取决于重组生产过程中使用的宿主细胞。另外，本发明的多肽还可含一个修饰过的起始甲硫氨酸残基，这在在某些情况下是由宿主控制的加工造成的。这些方法在许多标准实验室手册中均有描述，如Sambrook的上述文献第17.37-17.42章；Ausubel的上述文献第10,12,13,16,18和20章。全文引入作为参考。FSH或FSH变体和多肽本领已知的FSH或FSH变体包括以下标识号的说明中序列标识部分所列的蛋白序列，但不限于这些SEQ ID NO:1；牛α亚基-96氨基酸SEQ ID NO:2；牛β亚基-111氨基酸SEQ ID NO:3；马α亚基-96氨基酸SEQ ID NO:4；马β亚基-111氨基酸SEQ ID NO:5；人α亚基-96氨基酸SEQ ID NO:6；人β亚基-111氨基酸SEQ ID NO:7；猪α亚基-96氨基酸SEQ ID NO:8；猪β亚基-111氨基酸
SEQ ID NO:9；绵羊α亚基-96氨基酸SEQ ID NO:10；绵羊β亚基-111氨基酸SEQ ID NO:11；人β亚基-108氨基酸SEQ ID NO:12；人β亚基-109氨基酸SEQ ID NO:13；人β亚基-110氨基酸FSH或FSH变体核酸序列FSH或FSH变体核酸序列包括以下标识号的说明中序列标识部分所列的编码一α或一β亚基的核酸序列，但不限于这些SEQ ID NO:14；人类α亚基cDNA-276核苷酸(编码92个氨基酸)SEQ ID NO:15；h.β亚基变体cDNA -324核苷酸(编码108个氨基酸)SEQ ID NO:16；h.β亚基变体cDNA -327核苷酸(编码109个氨基酸)SEQ ID NO:17；h.β亚基cDNA -330核苷酸(编码110个氨基酸)SEQ ID NO:18；h.β亚基cDNA -333核苷酸(编码111个氨基酸)SEQ ID NO:19；人类α亚基cDNA-276核苷酸(编码92个氨基酸)SEQ ID NO:20；h.β亚基变体cDNA -324核苷酸(编码108个氨基酸)SEQ ID NO:19和20是设计而出并由寡聚核苷酸连接而构建的。SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19之间的差异不会改变其所编码的α亚基蛋白的氨基酸序列。与此类似，SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:15之间的差异不会改变其所编码的β变体亚基蛋白的氨基酸序列。氨基酸编码本发明中组成蛋白质和多肽的氨基酸通常以缩写表示。氨基酸通常以它的单字母编码、三字母编码、名称、或三核苷密码子表示，这在本领域是众所周知的(见Alberts,B.,et al.,Molecular Biologyof the Cell,Third Ed.,Garland Publishing,Inc.,New York,1994)
制剂如上所述，本发明提供含药学上可接受的FSH或FSH变体的稳定制剂以及含防腐剂的防腐制剂和溶液和适于医疗和兽医使用的多用途防腐制剂，其中稳定制剂优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液。防腐制剂至少含有一防腐剂，该防腐剂选自酚、间甲苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸酯(甲，乙，丙，丁酯及其类似物)、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞的至少一种或其混合物，的水性稀释液。
如上所述，本发明提供了包括包装材料和药瓶在内的制成品，瓶中含有FSH或FSH变体的溶液，该溶液含所限定的缓冲液和/或防腐剂，可视情况溶于水稀释液中，此处所述的包装材料包括一个表明该溶液可使用超过24小时或更长时间的标签。本发明还提供包括包装材料和药瓶的制成品，第一个药瓶含有冻干的FSH或FSH变体，第二个瓶中含有溶于水稀释液中的规定的缓冲液或防腐剂，此处所述的包装材料包括一个标签用以指导患者用水性稀释剂再配FSH或FSH变体以形成可在所述条件下使用超过24小时或更长时间的溶液。
本发明所使用的FSH或FSH变体可通过重组手段产自哺乳细胞或转基因制取或从其它生物来源，如尿源纯化产生。可接受的方法包括在Hakola,K.Molecular and Cellular Endocrinology,127:59-69,1997；Keene,et al.,J.Biol.Chem.,J.Biol.Chem.,264:4769-4775,1989；Cerpa Poljak,et al.,Endocrinology,132:351-356,1993；Dias,et al.,J.Biol.Chem.,269:25289-25294,1994；Flack,et al.,J.Biol.Chem.269:14015-14020,1994；Valove,et al.,Endocrinology,135:2657-2661,1994和美国专利号3,119,740中所描述的方法，在此列为参考。
用于向本发明的制剂提供蛋白质的方法无关紧要，较优选的FSH为包括一个α亚基和一个β亚基的异二聚体，SEQ ID NOS 5和6分别给出了二者的序列，还可以是包括一个α亚基和一个β亚基的FSH变体异二聚体，SEQ ID NOS:5和11；5和12；5和13分别给出了二者的序列。本发明内的合适的FSH或FSH变体α包括至少一个已知的α亚基和至少一个已知的β亚基(见列出的已知α和β亚基序列以及其他本领域的已知序列)。
FSH或FSH变体的非限制性例子包括以下内容，但并不限于这些(a):α-亚基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亚基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亚基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亚基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS
β-亚基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亚基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQLTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK本发明的蛋白质激素产品的含量范围，包括再配时形成的量，如果在一干/湿系统中，浓度从约1.0μg/ml到约50mg/ml不等，此范围以外的含量也是可行的，这取决于所需的送递方式，溶液制剂不同于透皮贴剂、肺、跨粘膜或渗透泵、微型泵这样不同的方式而变化。较优选的激素含量为5.0μg/ml到2mg/ml，最佳含量为5.0或10或50μg/ml到约200μg/ml。
水性稀释剂最好还包括一药学上可接受的防腐剂。优选的该防腐剂选自酚、间甲苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、氯甲酚、苄醇烷基对羟基苯甲酸酯(甲，乙，丙，丁酯及其类似物)、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞的至少一种或其混合物。其中较好的防腐剂为间甲苯酚、苯酚、氯甲酚或它们的混合物，间甲苯酚为最佳。用于本制剂的防腐剂的含量应足以产生抗微生物效果。该含量取决于所选用的防腐剂，熟练的技术人员可较容易地决定该含量。例如，间甲苯酚或苯酚(单独或混用)的含量一般在约23mM到约35mM。令人吃惊的是，用于本发明权利要求制剂的防腐剂对FSH或FSH变体的生物活性无负面影响并可以多用途给药。
其它赋形剂，例如等渗试剂、缓冲液、抗氧化剂、防腐增强剂，它们可视需要或在优选方案中加入稀释剂。等渗试剂，如甘油，通常在已知含量下使用。甘油含量一般约16mg/ml。可加入生理耐受的缓冲液以更好地控制pH。制剂的pH值范围可以很广，如从约pH4到约pH10，从约pH5到约pH9则更好，最好为从约pH6.0到约pH8.0。本发明中制剂较优选的pH在约pH6.8到约pH7.8。较好的缓冲液包括磷酸缓冲液，最好是磷酸钠，尤其是磷酸缓冲液盐水(PBS)。
其它添加剂，如药学上可接受的增溶剂吐温20(聚环氧乙烷(20)山梨聚糖单月桂酸)，吐温40(聚环氧乙烷(20)山梨聚糖单棕榈酸)，吐温80(聚环氧乙烷(20)山梨聚糖单油酸)，多聚醇F68(聚环氧乙烷聚环氧丙烷嵌段共聚物)和PEG(聚乙烯乙二醇)，非离子表面活性剂如聚山梨酸酯20或80、poloxamer 184或188、Pluronic_polyls、或其它嵌段共聚物，以及诸如EDTA和EGTA这样的螯合剂均可视需要加入至制剂或组合物中以减少聚集。当使用泵或塑料容器进行给药时这些添加剂尤为有用。本发明权利要求的制剂令人惊奇地稳定。在本发明之前，不稳定性使得FSH的防腐制剂和多用途制剂被认为不可能实现。申请人发现权利要求的制剂可在从2到40℃的温度下安全保存并在长时期内保持蛋白的活力超过2个月。
本发明制剂通过包括将FSH或FSH变体同防腐剂相混合的制备过程制得，该防腐剂选自酚、间甲苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、氯甲酚、苄醇烷基对羟基苯甲酸酯(甲，乙，丙，丁酯及其类似物)、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞的至少一种或其混合物，的水稀释剂。FSH或FSH变体同溶于水稀释剂的防腐剂的混合通过传统的溶解和混合过程来完成。为制备合适的制剂，将缓冲溶液中的标准量的FSH或FSH变体同缓冲溶液中所需防腐剂相混合，溶液的量应足以使蛋白质和防腐剂的含量适合需要。该过程的一些变化为具备本领域的一般技术的人员所公认。例如，各组分的加入次序、是否使用额外的添加剂、制剂制备的温度和pH值，这些因素均可以进行优化以适应含量和所用给药方式。
提供给患者的权利要求的制剂可以是澄清的溶液或盛于双药瓶中的药剂，一瓶盛有冻干的FSH或FSH变体，它可以用第二瓶中防腐剂或赋形剂再配，优选的赋形剂优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液。单溶液药瓶和需再配的双药瓶均可多次重复使用并可满足患者的单疗程或多疗程需要，这样便提供了一种比现行方法更方便的治疗服法。
本权利要求的制成品对于24小时以上或更长时间的给药非常有用。本发明之前这样的产品只适于迅速使用。患者被要求抛弃未用的药品，这造成浪费和费用的昂贵。申请人发现权利要求的制剂可在从2到40℃的温度下安全保存并在长时期内保持蛋白的活力超过2个月；这样便可以使用一个表明该溶液可保存和/或使用超过24、36、48、72或96小时或更长时间的标签。如果使用了防腐稀释剂，标签可以包括最高至1年、一年半到两年。
本发明FSH或FSH变体溶液的制备过程包括将FSH或FSH变体混溶于水稀释剂。混合通过传统的溶解和混合过程来完成。为制备合适的稀释剂，将水或缓冲液中的标准量的FSH或FSH变体混合，溶液的量应足以使蛋白质和视情况加入的防腐剂或缓冲液的含量适合需要。该过程的一些变化为具备本领域的一般技术的人员所公认。例如，各组分的加入次序、是否使用额外的添加剂、制剂制备的温度和pH值，这些因素均可以进行优化以适应含量和所用给药方式。
权利要求的制剂可以以澄清的溶液或盛于双药瓶中的药剂提供给患者，双药瓶中一瓶盛有冻干的FSH或FSH变体，它可以用第二瓶中的水稀释剂再配。单溶液药瓶和需再配的双药瓶均可多次重复使用并可满足患者的单疗程或多疗程需要，这样便提供了一种比现行方法更方便的治疗服法。
通过将权利要求的制剂提供给药房、诊所或其它类似机构设施，可以将其直接供给患者，制剂以澄清的溶液或盛于双药瓶中的药剂提供，双药瓶中一瓶盛有冻干的FSH或FSH变体，它可以用第二瓶中的水性稀释剂再配。这种情况下，澄清溶液可以1升或更大体积提供，它储存于大的容器中，药房或诊所可从中一次或多次取出少量的FSH或FSH变体以转入较小的药瓶中提供给它们的消费者和/或患者。这种情况下的双药瓶药剂可以1升或更大体积提供，它储存于大的容器中，药房或诊所可从中一次或多次取出少量的稀释剂以再配冻干的FSH或FSH变体。药房或诊所提供给消费者和患者的澄清溶液或再配的FSH或FSH变体可满足患者的单疗程或多疗程需要，这样便提供了一种比现行方法更方便的治疗服法。
包括单药瓶在内的公认的设备包括用于溶剂递送的pen-注射器，如Humaject_、Novopen_、B-D_Pen、AutoPen_和OptiPen_。包括双药瓶在内的公认的设备包括pen-注射器系统，该系统用于在药筒中再配药剂，而该药筒用于递送再配的药剂，该系统的例子是HumatroPen_。
本权利要求中的产品包括包装材料。除管理机构所要求的信息之外，包装材料还说明了使用产品所需的条件。对于双药瓶干/湿产品，本发明的包装材料提供说明用以指导患者用水稀释剂再配FSH或FSH变体以形成一溶液并进行超过24小时或更长时间的使用。对于单药瓶溶液产品，标签表明该溶液可使用超过24小时或更长时间。本权利要求的产品可用于人类医疗。
本发明FSH或FSH变体制剂的制备过程包括将FSH或FSH变体混溶于一选定缓冲液，优选为含有盐水或选定盐类的磷酸缓冲液。FSH或FSH变体同缓冲液在水稀释剂中的混合通过传统的溶解和混合过程来完成。为制备合适的制剂，将水或缓冲液中的测定量的FSH或FSH变体同所需的缓冲试剂混合，溶液的量应足以使蛋白质和缓冲液的含量适合需要。该过程的一些变化为具备本领域的一般技术的人员所公认。例如，各组分的加入次序、是否使用额外的添加剂、制剂制备的温度和pH值，这些因素均可以进行优化以适应含量和所用给药方式权利要求的稳定或防腐制剂可以以澄清的溶液或盛于双药瓶中的药剂提供给患者，双药瓶中一瓶盛有冻干的FSH或FSH变体，它可以用第二瓶水稀释剂中的防腐剂或缓冲液和赋形剂再配。单药瓶溶液和需再配的双药瓶药剂均可多次重复使用并可满足患者的单疗程或多疗程需要，这样便提供了一种比现行方法更方便的治疗服法。
本文所述的稳定或防腐制剂中的FSH或FSH或变体可根据本发明通过多种递送方法向患者给药，这些方法在本领域众所周知，包括SC或IM注射；透皮、植入、渗透泵、微型泵、药筒、肺、口腔送递系统及其它为熟练的技术人员所认可的方法。
以下的实施例仅供进一步阐明本发明的制剂和组合物的制备。本发明绝不仅只由下列实施例组成核酸/多肽实施例实施例1FSH或FSH变体在哺乳细胞中的克隆和表达典型的哺乳动物表达载体含至少一个调控转录起始启动子元件、多肽编码序列、转录终止和转录本多聚腺苷酸化所需的信号。但是，由于有功能的FSH或FSH变体必须同时含有α亚基和β亚基，因此需要同时表达两个亚基的方法，可以在一个单载体上表达两个亚基，每个亚基在该载体上均有一个启动子，或使用两个载体第一个载体含一个启动子以表达第一个亚基，第二个载体含一个启动子以表达第二个亚基。
另外，每一哺乳动物表达载体还具备包括增强子、Kozak序列、以及用于RNA剪切的供体和受体位点两侧的间隔序列在内的元件，这些元件可在一个或多个载体中存在。
使用SV40的早期和晚期启动子、来自反转录病毒，如RSV,HTLVI,HIVI的长末端重复序列和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。然而也可以使用细胞元件(如人类肌动蛋白启动子)。用于生产FSH或FSH变体亚基的合适载体包括pIRES1neo、pRetro-off、pRetro-on、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs,Palo Alto,CA),pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可使用的哺乳动物细胞包括人类Hela 293、H9和Jurkat细胞，鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1、Cos7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
另外，α和β亚基的DNA序列一旦整合入细胞染色体便可在这些含用以表达各亚基的DNA序列的稳定细胞系中表达。正如本领域已知的那样，同选择标记进行共转染可识别被转染的细胞并将其分离，选择标记的例子有dhfr,gpt，新霉素或潮霉素。
转染用的亚基DNA序列可进行扩增以大量表达编码的多肽。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记有助于于获得携带数百或甚至数千个目标DNA拷贝的细胞系。另一由该作用的选择标记是谷氨酸合成酶(GS)(Murphy,et al.,Biochem.J.227:277-279(1991)；Bebbington,et al.,Bio/Technology 10:169-175(1992))。利用这些标记，令哺乳细胞在选择培养基上生长可选出最高抗性的细胞。这些细胞系含整合入染色体的扩增基因。中国仓鼠细胞(CHO)和NSO细胞通常用于生产蛋白质和多肽。
表达载体pC1和pC4含有来自劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen,et al.,Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))及一个CMV-增强子片段(Boshart,et al.,Cell 41:521-530(1985))。多克隆位点，例如限制酶切点BamHⅠ,XbaⅠ和Asp718，它们可辅助所需的α亚基和β亚基的DNA序列的克隆。载体还具备大鼠前胰岛素原的3’内含子、多聚腺苷酸化和终止信号。
实施例2在COS或CHO细胞中的克隆和表达将编码FSH或FSH变体的cDNA克隆入表达载体pcDNAⅠ/Amp或pcDNAⅢ(可从Invitrogen,Inc.获得)可构成一FSH或FSH变体的表达质粒。如上文提及，为产生有功能的异二聚体需要表达每一个亚基，通过向细胞独立地引入分开的载体或构建一个单独的载体使之表达α和β亚基均可。
表达载体pcDNAⅠ/Amp包括；(1)一大肠杆菌复制起点，用于在大肠杆菌或其它原核细胞中复制；(2)一氨苄青霉素抗性基因，用于选择含质粒的细胞；(3)一个SV40复制起点，用于在真核细胞中的复制；(4)一个CMV启动子、一多连接头、一SV40内含子；(5)几个编码红血球凝集素片段(例如，辅助纯化的“HA”标签)或HIS标签(例见上文中Ausubel的文献)的密码子，其后是一个终止密码子和多聚腺苷酸化信号，如此排列可经多连接头的限制性切点将cDNA方便地置于CMV启动子的表达控制之下，并使之与可对其作用的SV40内含子和多聚腺苷酸化信号相连。HA标签相关于来自流感红血球凝集素多肽的一个抗原决定基，其在Wilson,et a1.,Cell 37:767-778(1984)中有所描述。无论是α或β亚基，将HA标记与之融合便可利用一识别HA抗原决定基的抗体很容易地对重组多肽进行检测和回收。pcDNAⅢ还含有新霉素选择标记。
将一个编码FSH或FSH变体的α亚基和β亚基的DNA片段克隆入载体的多连接头区域，使CMV启动子控制重组多肽的表达。可视情况决定是否插入HA抗原决定基。质粒的构建策略如下面所述。使用含方便的限制性切点的引物对用于FSH或FSH变体各亚基克隆的cDNA进行扩增。
用适当的限制性酶消化PCR扩增出的各亚基DNA片段和载体pcDNA/Amp，然后将各亚基与酶解的载体连接。用连接混合物转化大肠杆菌SURE(Stratagene Cloning Systems,11099 North TorreyPines Road,La Jolla,CA 92037)，转化培养物涂于氨苄青霉素平板上培养以令氨苄青霉素抗性菌落生长。从抗性菌落中分离各亚基的质粒DNA并通过酶切分析或其他手段以检验编码FSH或FSH变体的片段。
如上所述，为表达重组的FSH或FSH变体，用分别含各亚基的载体对COS细胞进行共转染，转染可使用DEAE-葡聚糖，可参考Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEditon,Cold Spring Harbor,NY(1989)。在可使各载体表达FSH或FSH变体的条件下培养细胞。
预计FSH或FSH变体HA融合多肽可通过放射标记和免疫沉淀而检测，所用方法在Harlow and Lane,Antibodies,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,NY(1989)中有所描述。为此目的，细胞在转染后两天在含35S-半胱氨酸的培养基中培养8小时。收集细胞和培养基，用含去污剂的RIPA缓冲液洗涤和裂解细胞，RIPA缓冲液；150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,0.5％DOC,50mMTRIS,pH7.5,该缓冲液在上文引用的Wilson et a1.文献中有所描述。用HA特异性单克隆抗体将蛋白从裂解物和培养基中分离出来。然后通过SDS-PAGE电泳和放射自显影技术分析沉淀的蛋白。细胞裂解物可见到预计大小的的表达产物而阴性对照中则无。
载体pC4被用于FSH或FSH变体各亚基的分别表达。本领域中的技术人员还可加工pC4以使α和β亚基同时表达由一个载体表达。pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC登记号No.37146)的衍生质粒该质粒含鼠DHFR基因，其在SV40的早期启动子的控制之下。缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢或其它细胞经α和β亚基质粒转染后可用选择培养基(αminus MEM,Life Technologies)对其进行选择，该培养基含化疗药物氨甲喋呤，已经证明DFHR基因的扩增导致了药物靶酶DHFR的过量产生从而产生抗性(例见F.W.Alt,et al.,J.Biol.Chem.253:1357-1370(1978)；J.L.Hamlin and C.Ma,Biochem.etBiophys.Acta 1097:107-143(1990)；M.J.Page and M.A.Sydenham,Biotechnology 9:64-68(1991))。如果DNA序列与DHFR相连，它通常会共扩增和过表达。本领域中已知该方法可产生携带超过1000个扩增基因拷贝的细胞系。随后，当停止使用氨甲喋呤时，可获得在一个或多个染色体上整合入扩增DNA序列的细胞系。
pC4质粒在劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)强启动子(Cullen,et al.,Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))之后连有用于表达α和β亚基的DNA序列，LTR该启动子还具有分离自人类巨细胞病毒(CMV)瞬时早期基因增强子的片段(Boshart,et al.,Cell41:521-530(1985))。启动子的下游具有BamHⅠ、XbaⅠ和Asp718限制性酶切位点用于DNA序列的整合。这些克隆位点之后是大鼠前胰岛素原的3’内含子和多聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可用于表达，例如，人类b-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或来自其它反转录病毒的长末端重复序列，如HIV和HTLVI。Clontech的Tet-off和Tet-on基因表达系统及类似系统可以合乎法规的方式在哺乳细胞中表达FSH或FSH变体(M.Gossen,and H.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992))。其它信号也可用于mRNA的多聚腺苷酸化，例如来自人类生长激素或球蛋白基因的信号。染色体整合入了α和β亚基DNA序列稳定细胞系可通过用选择标记进行共转染来选出，例如gpt、G418或潮霉素。使用一个以上的选择标记有利于实验，如G418加氨甲喋呤抗性。
通过本领域已知的程序对质粒进行酶解并用牛小肠磷酸酶进行去磷酸化。然后通过1％的琼脂糖凝胶分离载体。
利用与基因3’和5’端相关的PCR多聚核苷酸引物对编码完整的FSH或FSH变体各亚基的DNA序列进行扩增。根据本领域的专业常识非限制性的例子包括与FSH或FSH变体部分编码序列互补或相应的3’和5’引物。
用适当的内切酶对质粒进行酶解，然后再通过1％的琼脂糖凝胶进行纯化。然后用T4DNA连接酶分别将分离而得的编码各亚基的片段同去磷酸化的载体进行连接。分别用它们转化大肠杆菌HB101或XL-1 Blue细胞，利用诸如限制性酶切这样的方法确认出含有插入pC4质粒的DNA片段(对于同时表达两亚基的载体则是两个片段)的细菌。
通常使用缺乏DHFR活性基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来进行转染。5μg表达载体可利用脂质转染剂同0.5μg pSV-neo质粒进行共转染。pSV-neo质粒具有来自Tn5的显性选择标记neo基因，该基因编码的酶可产生对一类的抗生素抗性，包括G418在内。用补充G418至1μg/ml的αplus MEM培养细胞。两天之后，用胰蛋白酶处理细胞并在杂交瘤克隆板(Greiner,Germany)上进行培养，培养基使用补充氨甲喋呤至10、25或50ng/ml及G418至1μg/ml的αplus MEM。10-14天后用胰蛋白酶处理单克隆然后在6孔培养皿或10ml瓶中在不同氨甲喋呤浓度下(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)进行培养。将可在最高浓度的氨甲喋呤中生长的克隆转至新的6孔培养皿，皿中含更高浓度的的氨甲喋呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)。重复该过程直至获得可在浓度为100-200mM下生长的克隆。利用诸如SDS-PAGE和Western印迹或反相HPLC分析这样的方法分析所需产物的表达。
除以上的实施例和说明中所描述的之外，本发明将表明还可通过其它方法来实施。
本领域中已知许多本蛋白表达方法的修改和变化，包括KeeneJ.L.,et al.,J.Biol.Chem.,264:4769-4752,1989；Loumaye E.,et al.,Human Reprod.Update,1:188-199,1995；Olijve W.,etal.,Mol.Hum.Reprod.,2:361-369,1996，以及其它已知并用于其它促性腺激素的重组技术。
实施例3AV12细胞中的表达表达盒载体pGTH被用于α亚基在AV12细胞的表达。有相当数量的发表文献描述了AV12-664和/或AV12-RGT细胞的使用(见Grinnell,B.W.et al.,Blood 76(12):2546-54,1990；Burck,P.J.et al.,J.Biol.Chem.265(9):5170-7,1990；Parkinson,J.F.et al.,J.of Biol.Chem.265(21):12602-10,1990；Grinnell,B.W.et al.,J.Biol.Chem.266(15):9778-85,1991；Wery,J.P.et al.,Nature 352(6330):79-82,1991；Berg,D.T.et al.,Biotechniques 14:972-9,1993；Gerlitz,B.et al.BiochemicalJournal 295(1):131-40,1993；Kursar,J.D.et al.MolecularPharmacology 46(2):227-34,1994；Desai,M.A.et al.,Molecular Pharmacology 48(4):648-57,1995；Obesity Research3 Suppl 4:4441S-4447S,1995；Desai,M.A.et al.,BritishJournal of Pharmacology 118(6):1558-64,1996；Kumar,A.et al.,Cancer Research 56(23):5397-402,1996；Boggs,L.N.et al.,J.of Neurochemistry 57(3):1324-7,1996；Schoepp,D.D.et al.,Neuropharmacology 35(12):1661-72,1996；Kumar,A.et al.,Cancer Research 57(15):3111-4,1997；Urology 49(3):497-93,1997；Wainscott,D.B.et al.Naunyn-Schmiedebergs Archivesof Pharmacology 357(1):17-24,1998；Wu,S.et al.BrainResearch-Molecular Brain Research 53(1-2):88-97,1998。同样有发表的文献描述了质粒pGTH(见Grinnell,B.W.et al.,J.Biol.Chem.266(15):9778-85,1991)和pGTD(见Biochemical Journal295(Pt1):131-40,1993)。
简言之，pGTH含有几个连续的元件SV40早期启动子.ori、大肠杆菌潮霉素抗性、SV40小“t”抗原剪切位点/poly-A位最、pBR322克隆残迹、BK病毒(P2株)克隆残迹、polyCA20/GT20元件(合成的寡聚核苷)、BK病毒(P2株)增强子、AD2主要晚期启动子/剪切过的三联前导序列、用于FSHα亚基编码序列(含终止密码子)的Bcll插入位点、SV40小“t”抗原剪切位点/poly-A位点；以及pBR322的氨苄青霉素抗性基因/ori。
通过将一个362bp的FSH cDNA BclⅠ片段(见序列-SEQ ID:19或14)克隆入载体的单一BclⅠ位点产生了用于表达人类α亚基编码序列(SEQ ID:5)的质粒pGTH-α。FSH片段利用穿梭质粒pLGD637作为模板的PCR扩增而产生(pLGD637含有合成/寡聚核苷组装的FSHαcDNA序列)。通过测序并同GenPept数据库(登记号31869)进行比较对BclⅠ插入组件的完整性进行确认。
表达盒载体pGTD被用于FSH变体β亚基(SEQ ID:11)在AV12细胞中的表达。pGTD含有几个用于在AV12细胞中表达的元件。pGTD具备连续的BK病毒(P2株)克隆残迹、polyCA20/GT20元件(合成的寡聚核苷)、BK病毒(P2株)增强子、AD2主要晚期启动子/剪切过的三联前导序列、用于FSH变体β亚基编码序列(含终止密码子)的Bcll插入位点、SV40小“t”抗原剪切位点/poly-A位点；SV40早期启动子。ori、鼠类二氢叶酸还原酶cDNA、SV40小“t”抗原剪切位点/poly-A位点以及pBR322的氨苄青霉素抗性基因/ori。
通过将一个393bp的FSHβbCD-3 cDNA BclⅠ片段(见序列-SEQID:20或15)克隆入载体的单一BclⅠ位点产生了质粒pGTD-bCD3。FSHβ-CD3片段利用穿梭质粒pLGD638作为模板的PCR扩增而产生(pLGD638含有合成/寡聚核苷组装的FSHβcDNA序列)。通过测序并同GenPept数据库(登记号476441)进行比较对BclⅠ插入元件的完整性进行确认。
简言之，pGTD-α和pGTD-bCD3质粒被线性化、重新纯化，然后共转染贴壁的AV23-RGT18细胞。用含0.25μM的氨甲喋呤和100μg/ml的潮霉素，以及用于维持V23-RGT18细胞谷氨酸转运体表型的200μg/ml G418的培养基进行选择，然后手工或用流式细胞筛选分离出单个稳定克隆。用商业化的FSH ELISA试剂盒进行条件培养基分析以确认产量最高的克隆。将几个克隆转入无血清悬浮培养进一步扩增以获得可分离量的的FSH变体异二聚体。
实施例4CHO-K1细胞中的表达已开发出一个CHO-K1细胞系(LONZA Biologics plc.)以生产一种含SEQ ID NO:5的α亚基和SEQ ID NO:11的β亚基的FSH变体异二聚体。
表达载体框包括编码α亚基，SEQ ID NO:5的DNA和编码β亚基，SEQ ID NO:11的DNA，它们由两个不同的启动子控制CMV控制β亚基，EF1α控制α亚基。α和β亚基均使用牛生长激素多聚腺苷酸尾。该质粒还含有谷氨酸合成酶基因，它由SV40晚期启动子控制并含有SV40多聚腺苷酸尾，该基因用作选择标记。这一质粒被用来转染CHO-K1细胞。
本细胞系在GibcoBRL的CD CHO培养基上生长，处于L-甲硫氨酸磺基肟的选择压力之下。用ELISA来确认表达FSH变体的主要培养孔。对几个主要培养孔进行克隆和扩增。这些实验可形成滴度适合的克隆细胞系2B6.1B3.25。在小摇瓶中进行的表达研究表明这一细胞系可在7至8天后表达30mg/L的FSH变体。
实施例5从CHO或AV-12细胞中纯化FSH变体含一个SEQ ID NO:5的α亚基和一个SEQ ID N0:11的β亚基的FSH变体可通过许多在本领域中已知并有描述的方法从CHO或AV-12细胞或其他合适的细胞系的单层或悬浮培养物中纯化。从含培养基的细胞培养物分离已公布的FSH变体的方法之一是对培养基进行阳离子交换层析、染料亲和层析和凝胶过滤层析以纯化蛋白。对于可能含有去污剂的悬浮培养物，可能需要一些额外的纯化步骤，如Q-Sepharose。可进一步加入层析步骤或对其pH、导电性、缓冲液组成以及层析条件(柱的大小、流过速度等等)。纯度和产量可通过SDS-PAGE凝胶(考马斯染色和Western印迹)、ELISA分析、排阻层析进行分析，蛋白含量可通过277nm下的紫外吸光或其它已知技术进行分析。
以下给出了各分离步骤的进一步细节，可通过它们进行纯化和层析分离。对于单细胞层培养物，在使用阳离子交换柱之前须对条件培养基进行浓缩和渗滤。Q-Sepharose批量提纯步骤可用于悬浮培养物以除去可能存在的去污剂。
1．浓缩一般如果对AV12悬浮培养物使用0.02-0.04％的Pluronic F68,那么对CHO悬浮培养物则使用0.1-0.18％。利用离心和纱布过滤使条件培养基澄清，再使用S3YM10转头(Amicon#540633)通过切向流过滤系统ProFlux(来自Millipore的ProFlux M12)将其浓缩。根据使用的Pluronic F68的量将培养基浓缩4-10倍以使浓缩后的Pluronic F68浓度为0.2-0.4％。8升的CHO-K1或24升AV12的培养物浓缩后的终体积通常为2-3升。
2．Q-Sepharose批量处理往浓缩后的初始条件培养基中加入Fast Flow Q-Sepharose树脂(Pharmacia 17-0510-01，用20mM Tris,pH7.4进行预平衡)，加入的量为每升浓缩前的培养基加入50ml，并加入足量的NaCl以使其终电导率为200mM(~20mS/cm)，在4℃下温和搅拌过夜。
3．渗滤浓缩培养基和Q-sepharose树脂过夜批量处理后使树脂沉淀，倒去上清并用Zeta Plus 30-SP滤膜(#B0406-30SP，购自Sun SourceFauver)和Masterflex泵以170ml/min的流速通过CUNO系统过滤。然后进一步将培养基浓缩至800ml并在Proflux系统中用5-6倍体积的20mM Tris,pH7.4进行渗滤。此时的电导为～2mS/cm。用1N HCl将pH调到5.0，用CUNO系统和新的Zeta Plus 30-SP滤膜重新过滤并立即上样到阳离子交换柱上。
4．阳离子交换层析层析柱每～100-200mg FSH(~500-600mg总蛋白)用PharmaciaSP-Sepharaose Fast Flow(17-0729-01)装50ml的层析柱。缓冲液为A:20mM磷酸钠，pH5.0；B20mM磷酸钠，pH5.0,1M NaCl。
将样品的pH调到5.0，过滤使之澄清并立即上样到层析柱上，并在15个柱体积的0％到50％的梯度开始之前先以5ml/min的流速跑4个柱体积。搜集3min的级分(15ml)。级分被收集到400ml 1M Tris,pH8.0。
用考马斯亮蓝染色的SDS PAGE凝胶选择含FSH的级分(通常50ml层析柱收集的级分体积为200到250ml)。将收集物对20mM Tris,pH7.4在4℃透析过夜以使电导下降到＜3mS/cm.
5．染料亲和层析(DAC)层析柱每～40mg FSH用购自Prometic Bioscience Inc.的Mimetic Blue Dye 1 A6XL,0090-0500,0090-0500装50ml的层析柱。缓冲液为A:25mM磷酸钠，pH6.5(电导为4.5-5mS/cm)；B:25mM磷酸钠，150mM KCl,pH6.5；C:25mM磷酸钠，1MKCl,pH8.0。
CEX收集产物透析后将pH值跳到6.5并以3ml/min的流速上样到DAC层析柱。进行4个体积100％A到50％A:50％B的梯度，然后用5个体积的缓冲液C洗脱，收集3min的级分(9ml)。
用考马斯亮蓝染色的SDS PAGE凝胶选择含FSH的级分。通常50ml层析柱收集的级分体积为90到100ml。用Millipore Ultrafree离心装置将收集物浓缩到4ml(UFV2BCC40,5000MWCO,2000rpm离心)并上样到凝胶过滤层析柱上。
6．凝胶过滤层析柱50到100mg的FSH用BioPilot Superdex 75 Prep Grade35/600层析柱。缓冲液为1×PBS(从GIBCO 10×PBS,#70011制备得到)加上100mM NaCl。缓冲液的最终组分为1mM单碱磷酸钾，3mM双碱磷酸钠，253mM氯化钠，pH7.4。
将来自DAC步骤的溶于以上所描述的1×PBS的4ml FSH上样于上述层析柱，流速为3ml/min，收集1min(3ml)的级分。
根据考马斯和银染色的凝胶，此步的FSH的纯度为＞95％。
制剂/制成品实施例实施例6防腐剂对FSH物理稳定性的影响由于防腐剂倾向于使蛋白变性、破坏其稳定或使其聚集(Brange,J.and Lankjar,L.,Acta Phram.Nord,4,149-158,1992；MaaYF and Hsu C,International Journal of Pharmaceutics,140,155-168,1996)，因此使用动态光散色技术对uFSH(uFSH-体外诊断学-人类尿源促卵泡素)在不同防腐剂存在的情况下的物理稳定性进行检验。通过包括一台Lexel 95 Argon激光仪(488nm)，一台Brookhaven Instruments model BI-200SM的测向器和一台BI9000AT自动校正器在内的系统以获得测量数据。数据参数包括初始光子计数调至100,000计数/秒，持续时间30秒，dust截断值31，以及散射角90°。
向1.5ml含1mg/ml尿源卵泡刺激激素(uFSH-体外诊断学-人类尿源促卵泡素)的溶液加入防腐剂，在此之前尿源卵泡刺激激素以1×PBS在pH7.4下透析过夜。选择防腐剂的浓度达到通常已知的可提供充分抗微生物活性的浓度。在层流罩中将样品通过一0.1μmAnotop-Plus滤纸(10mm)过滤入一12mmDLS测试管。将样品置于37℃下平衡过的DLS固定器中。在24小时内每15分钟确定自动校正器函数并对其分析以产生流体动力学参数。测量数据表明99％以上的蛋白分子的平均直径约为5.7nm。少部分的直径约为200nm。在37℃下经过24小时，防腐剂的存在并不明显地改变该分子大小的分布。然后使用NNLS(非负线性平方)程序分析24小时的代表性数据，程序见表Ⅰ.。99％以上的蛋白成平均直径约5.7nm的颗粒。使用一晶体学上相关的经验方程可据其分子量确定疏水半径(Squire,P.G.andHimmel,M.E.,in Arch.BioI.Biophys.,196,pp.165-177,1979)，该DLS颗粒平均大小相对的分子量约36,000，这与uFSH异二聚体的分子量相一致。剩余的少量颗粒(＜1％)平均直径约200nm。表Ⅵ中的数据表明所测试的防腐剂在本测试条件下不会明显地造成uFSH的聚集。
表Ⅵ．uFSH在含不同防腐剂的制剂中的大小分布。
实施例7uFSH制剂的热变性研究在溶剂条件影响下的uFSH的热解折叠过渡通过差示量热扫描法(DSC)来检测。实验通过一个VP-DCS微量热计(MicroCal inc.,Northampton,MA；Plotnilk,V.V.et al.,Anal.Biochem.,250:237-244,1997)来进行，使用VPViewer软件来收集数据，使用Origin DSC软件来分析数据。适配的样品槽和参照槽由钽进行棒形化(lollipop-shaped)而制得，其工作体积为0.5ml。用适当的缓冲液透析约1mg/ml的uFSH样品，以紫外光谱法测定蛋白浓度。然后将蛋白稀释至0.4-0.5mg/ml以用于DSC实验。透析溶液被用作参照溶液。样品和参照溶液在加样之前需脱气5分钟，上样使用2.5ml的针头通过填充道完成。以压力帽保持压力在30psi。为本实验的测量，在处理样品之前向样品槽和参照槽内加入缓冲液并开动仪器过夜以建立热力学历程。以Origin DSC软件使用双态模型分析数据(Sturtevant,J.M.,Annu.Rev.Phys.Chem.,38:463-488,1987)。蛋白质在不同溶液条件中的过渡温度的中点(Tm)总结于表Ⅶ。蛋白质在pH7.4的PBS缓冲液中进行非常协同地过渡，其Tm为77.3℃。紧接着第一次扫描后的第二次扫描缺少过渡，这显示在该测量的时间范围内蛋白质的热变性不可恢复。但是，解聚的亚基在溶液中保持为单体，这些单体可在几天后重新聚合成具生物活性的二聚体(数据未显示)。如表Ⅶ所示，添加所示浓度的防腐剂间甲苯酚、苯酚、苯乙醇、甲基对羟基苯甲酸酯和氯甲酚对Tm的影响表现为空白。
表Ⅶ．DSC所检测到的pH、盐和防腐剂对uFSH Tm值的影响
实施例8uFSH在pH影响下的的稳定性uFSH(uFSH-体外诊断学-人类尿源促卵泡素)在PBS中的稳定性受不同pH值的影响。在pH影响下的异二聚体百分比通过分子量排阻层析来检测，见表Ⅷ
表Ⅷ．通过分子量排阻层析检测的在pH影响下的异二聚体百分比
实施例9uFSH防腐和非防腐制剂的稳定性在PBS(Dulbecco’s,GIBCO)中制备uFSH(uFSH-体外诊断学-人类尿源促卵泡素)的溶液并用PBS进一步稀释至浓度为50μg/ml。用一台Hewlett Packard Model 8452A二极管分析分光光度计测定蛋白质含量。
向盛有预称量过的间甲苯酚样品的烧杯中加入部分uFSH溶液，使间甲苯酚最终浓度约为3.16mg/ml。将每份1ml的防腐和非防腐溶液置于塑料离心管中在约22℃、37℃和45℃下温育至238天。在不同的时间段，将小份样品注入平衡过的Superdex-75HR 10/30柱(Pharmacia)室温下以0.5ml/min PBS过柱。在214nm下检测洗脱液。以二聚体峰的面积除以二聚体峰和单体峰的总面积计算二聚体的百分比，如表Ⅲ所示。64天后，37℃下的含间甲苯酚的溶液中约79％的uFSH分子为完整的异二聚体，45℃下则有多于52％的完整异二聚体。令人惊奇的是，室温下63天以后uFSH在防腐和非防腐溶液中均有最小量的解聚。很明显在22℃、37℃和45℃下4、8、16、21、28、29、43、63、64、126、127、237和238天uFSH在防腐和非防腐溶液中的解聚一般均相对较低。
表Ⅸ．防腐或非防腐溶液中的二聚体百分比
实施例10uFSH样品的生物活性测量用编码一潮霉素选择标记的人类FSH受体表达载体转染已稳定转染了cAMP敏感的b-乳糖酶(BLAM)报告载体(Zlokarnik,et al.,1998,Science 279:84-88)的HEK 293细胞，在潮霉素中培养三周。用10μg/ml的FSH(Sigma)处理存活的细胞5小时，检测出受FSH激活而显出最高强度的蓝色荧光的细胞群落并通过FACS将其分离。扩展多克隆群落，用10μg/ml的FSH(Sigma)处理5小时，以FACS检测出单细胞克隆。以微量滴定板法分析两个克隆细胞系，结果表明其蓝/绿比例提高了6至8倍。将BLAM表达增加倍数最大的FSH-R细胞系选出用于随后的FSH分析。
在100μl生长培养基(DMEM目录号11965-092,10％PBS,500μg/ml庆大霉素)中培养携带cAMP敏感的b-乳糖酶(BLAM)报告载体的FSH受体细胞，培养使用聚D-赖氨酸表面处理过的96孔黑壁组织培养板，每孔20,000个细胞，在37℃,5％CO2下培养过夜。用100μl分析培养基(DMEM目录号11965-092,0.5％PBS,500μg/ml庆大霉素)替换生长培养基，平板在37℃,5％CO2下培养过夜。除去分析培养基，向每个孔加入100μl含指示浓度FSH的分析培养基，平板在37℃,5％CO2下培养5个小时。向每个孔加入20μl BLAM上样底物，它的组成包括6μl含1mM CCF2-AM的DMS0,6μl Pluronic Acid(100μg/ml,溶于0.1％的乙酸DMSO)，将它们溶于1ml 2％PEG-400和10％ESS(Aurora Biosciences)。在室温下温育1小时后，使用细胞荧光计(Perseptives Biosystem,Series 4000多孔酶标仪)测定蓝色(激发波长395nm/发射波长460nm)和绿色(激发波长395nm/发射波长530nm)荧光强度的比值。用所测得的各比值除以参照组的蓝/绿比值即可算出由于FSH的存在所造成的蓝/绿比值的增加倍数。
含50μg/ml的尿源FSH(uFSH-体外诊断学-人类尿源促卵泡素)的PBS溶液(样品A)可依照实施例9来制备。在90℃下加热部分溶液10分钟，将二聚体解聚成两单体(如SEC分析所示)，以作为本分析的阴性对照(样品B)。调整另取的部分FSH溶液使之含3.15mg/ml间甲苯酚(样品C)。用FSH-R 293-Cre-BLAM assay在两个分开的平板上测算这三个测试样品的生物活性。表Ⅹ所示的是各平板上三组分析的平均值。数据表明该分析的进行是可重复的。数据还表明解离的异二聚体失去了生物活性(样品B)而在含间甲苯酚的制剂中的FSH(样品C)保持了全部活性。
表Ⅹ．FSH受体生物活性分析中蓝/绿比例增加的倍数。
实施例11防腐和非防腐的uFSH样品的生物活性测量尿源FSH(uFSH-体外诊断学-人类尿源促卵泡素)样品的生物活性在实施例10所述的体外生物活性分析中测定。在表Ⅺ中，对两样品体外生物活性分析的结果同一个参照组作了比较，样品于23℃下的PBS中存放11个月后进行分析，其PBS分别含有和不含间甲苯酚。数据表明本分析中防腐和非防腐的uFSH样品在11个月后均保持了全部的生物活性。
表Ⅺ．在23℃下11个月后uFSH的防腐和非防腐溶液的体外生物活性
实施例12防腐和非防腐的rFSH变体样品的药筒相容性为测试制剂化的rFSH变体(α亚基SEQ ID NO:5；β亚基SEQ IDNO:11)溶液同药筒的相容性，由下所列的储存液制备4ml表12中的样品溶液含1.85mg/ml rFSH变体的PBS含1.73mg/ml rFSH变体的PB含20mg/ml间甲苯酚的PBS含20mg/ml间甲苯酚的PB含20％甘油的PB1×PBS混合后，将各溶液各取1.7ml加入独立的药筒，留下最小的上部空间。每样品装两个药筒。封好药筒帽。将药筒在30℃下温育20天。各样品装完药筒所剩下的部分在40℃下温育以作参照。在30℃下温育20天后，使用实施例11所述的方法测量这些样品的体外活力。在零时间点将这些样品的活性同相关参照组进行比较。如表Ⅻ所示，在PBS中浓度为50μg/ml的rFSH样品和在含3.15mg/ml的间甲苯酚的PBS中浓度为200μg/ml的rFSH样品在药筒中(药筒1和药筒4)稳定。这些样品在30℃下温育20天后保持了全部活力。但是，在这些条件下不含NaCl的磷酸缓冲液中的样品活力较低。在含1.6％的甘油的磷酸缓冲液中的rFSH样品活力与其参照组相比较有所降低(药筒2和药筒3)。
表Ⅻ．在药筒中30℃下温育20天后的防腐和非防腐样品的体外活力
如这些例子所表明，遵循所述的方法和技术可产生FSH或FSH变体的高度稳定的组合物和制剂。这些组合物和制剂导致了本权利要求中的制成品的开发。从大约1970年以来，法律一直认为一个制成品中的印刷信息不能消除该产品被申请专利的可能性，只要条款和发明作为一个整体满足法律的其他要求，如新颖性和非显而易见性。由于先前工艺所认识到的FSH或FSH变体明显地认为该溶液仅适于立即使用且开始使用后其产品必须抛弃，而不是本权利要求中的产品那样适于24小时或更长时间的使用，亦有别于本权利要求中的制成品，它包括有新的非显而易见的发明，该发明是独特的且不同于先前工艺的发明。
本发明中主要的，优选的具体内容和操作模式已在先前说明中描述。但是，本发明所期望的保护不仅限于只针对已公开的具体形式，因为它们是阐明性的而非限制性的说明。本领域中的技术人员可不偏离本发明精神而进行改动和变化。
实施例9uFSH防腐和非防腐制剂的稳定性将约含1mg/ml重组FSH变体(α亚基SEQ ID N0:5；β亚基SEQID NO:11)的磷酸氯化钠缓冲液(PBS,Dulbecco’s,GIBCO)储存溶液以PBS和含间甲苯酚的PBS分别稀释至50μg/ml或20μg/ml，使间甲苯酚在后者中的终浓度为3.15mg/ml。按类似方法制备另一套以10mg/ml的苯乙醇为防腐剂的溶液。在塑料eppendorf管中于4、22、37℃下温育1ml每份的防腐和非防腐溶液至3个月。在不同的时间段，将小份样品注入以PBS平衡过的Superdex-75凝胶过滤柱(Pharmacia)室温下以0.07ml/min速率过柱，过柱时间为35分钟。以214nm的紫外吸收下进行全时检测。积分计算出峰面积，以二聚体峰的面积除以二聚体峰和单体峰的总面积计算二聚体的百分比。如表Ⅲ所示，室温或更低温度下温育3个月后，不同溶液条件下的异二聚体有最小的解聚。多于50％的异二聚体在37℃下温育3个月后保持完整。异二聚体在较高浓度的溶液中的稳定性较高。
表ⅨSE-HPLC检测出的rFSH变体的异二聚体稳定性
序列表<110>Eli Lilly and Company<120>FSH和FSH变体制剂，产品和方法<130>X12383M Sequence Listing<140><141><150>60/093906<151>1998-07-23<150>60/094611<151>1998-07-30<150>60/094767<151>1990-07-31<150>60/098711<151>1998-09-01<150>60/100696<151>1998-09-17<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>96<212>PRT<213>哺乳动物<400>1Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu15 10 15Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys20 25 30Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val65 70 75 80Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90 95<210>2<211>111<212>PRT<213>哺乳动物<400>2Arg Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Gly Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Arg Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Glu Cys His Cys Ser Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Arg Glu Ile Lys Glu100 105 110<210>3<211>96<212>PRT<213>哺乳动物<400>3Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr Gln Asp Cys Pro Glu Cys Lys Leu1 5 10 15Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys Leu Gly Val Pro Ile Tyr Gln Cys
20 25 30Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg ser Arg35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Ile Arg Val Thr Val Met Gly Asn Ile Lys Leu65 70 75 80Glu Asn His Thr Gln Cys Tyr Cys Ser Thr Cys Tyr His His Lys Ile85 90 95<210>4<211>111<212>PRT<213>哺乳动物<400>4Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Val Glu Lys Glu Gly1 5 10 15Cys Gly Phe Cys Ile Thr Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ger Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Ala Cys His Cys Gly Lys Cys Asn Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Asp Met Lys Glu100 105 110<210>5<211>92<212>PRT<213>人类<400>5Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys 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Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Ala Arg Val65 70 75 80Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90 95<210>8<211>111<212>PRT<213>哺乳动物<400>8Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Asn Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Glu Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys Glu100 105 110<210>9<211>96<212>PRT<213>哺乳动物<400>9Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu1 5 10 15Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys20 25 30Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val65 70 75 80Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90 95<210>10<211>111<212>PRT<213>哺乳动物<400>10Arg Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Ser Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Ala Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Glu Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Arg Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Asp Ile Arg Glu100 105 110<210>11<211>108<212>PRT<213>人类<400>11Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu100 105<210>12<211>l09<212>PRT<213>人类<400>12Asn ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met100 105<210>13<211>110<212>PRT<213>人类<400>13Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys100 105 110<210>14<211>276<212>DNA<213>人类<400>14gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc acgctacagg aaaacccatt cttctcccag 60ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc tgctgcttct ctagagcata tcccactcca 120ctaaggtcca agaagacgat gttggtccaa aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt 280gtagctaaat catataacag ggtcacagta atggggggtt tcaaagtgga gaaccacacg 240gcgtgccact gcagtacttg ttattatcac aaatct 276<210>15<211>324<212>DNA<213>人类<400>15aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaa324<210>16<211>327<212>DNA<213>人类<400>16aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaaatg 327<210>17<211>330<212>DNA<213>人类<400>17aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaaatgaaa 330<210>18<211>333<212>DNA<213>人类<400>18aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaaatgaaa gaa 333<210>19<211>276<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述经修饰以便于克隆<400>19gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc acgctacagg aaaacccatt cttctcccag 60ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc tgctgcttct caagagcata tcccactcca 120ctaaggtcca agaagacgat gttggtccaa aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt 180gtagctaaat catataacag ggtcacagta atggggggtt tcaaagtgga gaaccacacg 240gcgtgccact gcagtacttg ttattatcac aaatct 276<210>20<211>324<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述经修饰以便于克隆<400>20aacagctgtg agctcaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60atatcgatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccggccc gtcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtacgcgtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaa32权利要求
1．含有包括一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体以及防腐剂的制剂，该防腐剂选自酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其类似物、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，的水性稀释剂中。
2．权利要求1的制剂，其防腐剂为苯酚、间甲苯酚、氯甲酚或其混合物。
3．权利要求2的制剂，其FSH或FSH变体浓度约为1.0μg/ml至50mg/ml。
4．权利要求3的制剂，它进一步含有一种等渗试剂。
5．权利要求4的制剂，它进一步含有一种生理可耐受的缓冲液。
6．包括两个药瓶的制剂，第一个药瓶含有冻干的FSH或FSH变体，第二个药瓶含一种防腐剂，该防腐剂选自酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其类似物、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，的水性稀释剂中。
7．权利要求1的制剂，其所述的FSH或FSH变体和防腐剂存在于溶液中。
8．权利要求1的制剂，其所述的FSH或FSH变体是选自如下所列群体的至少一种化合物(a)α-亚基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亚基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亚基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亚基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亚基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNNTSESTCCVAKSYNKVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK
9．一种用于治疗不育症的方法，它包括以权利要求1的制剂向有需要的患者进行给药。
10．权利要求9的方法，其所述的患者选自人类、绵羊、牛、马或兔。
11．用于制备含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的防腐溶液制剂的方法，它包括将所述的FSH或FSH变体同一种防腐剂混合，该防腐剂选自酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其类似物、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，的水性稀释剂。
12．一种用于人类医疗的制成品，它包括包装材料和一个包含含有一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体溶液以及一种防腐剂溶液的药瓶，所述的包装材料包括一个表明所述溶液可保存超过24小时或更长时间的标签。
13．权利要求12的制成品，其所述的药品为玻璃容器，它具有一个用于多用途给药的塞子。
14．权利要求12的制成品，其所述的药瓶为一包装泡，它可以被穿刺并用于肺部给药。
15．权利要求12的制成品，其所述的药瓶为一pen-注射器设备。
16．一种制成品，它包括包装材料、盛有冻干的含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的第一个药瓶和含一种防腐溶液的第二个药瓶，此处所述的包装材料包括一个标签用以指导患者用防腐溶液再配所述的FSH或FSH变体以使用超过24小时或更长时间。
17．权利要求16的制成品，其所述的第一个和第二个药瓶包含于一pen-注射器设备。
18．一种用于治疗患者的不育症的方法，它包括以溶于防腐溶液的包含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的防腐溶液向有需要的患者进行给药，所述的溶液适于超过24小时或更长时间的给药。
19．一种使用含一个α亚基和一个β亚基并用于治疗患者的不育症的FSH或FSH变体的稳定溶液的方法，它包括以FSH或FSH变体的稳定溶液向有需要的患者进行给药，所述的溶液适于超过24小时或更长时间的给药。
20．FSH或FSH变体的至少一个α多肽或β多肽在制备防腐溶液中的使用，该防腐溶液适于超过24小时或更长时间的给药。
21．一种包括至少一种含有一个α亚基和一个β亚基FSH或FSH变体以及含盐水或一种盐的磷酸缓冲液的稳定制剂，此处所述的FSH或FSH变体在23℃下60天后至少含90％的FSH或FSH变体二聚体。
22．权利要求21的制剂，其所述的FSH或FSH变体浓度约为1.0μg/ml至50mg/ml。
23．权利要求21的制剂，进一步包括一种等渗试剂。
24．权利要求21的制剂，其所述的缓冲液为磷酸盐水缓冲液。
25．一种制剂，它包括盛有含一个α亚基和一个β亚基的冻干的FSH或FSH变体的第一个药瓶和盛有含盐水或一种盐的磷酸缓冲液的第二个药瓶。
26．权利要求21的制剂，其所述的FSH或FSH变体和所述的磷酸缓冲液处于溶液中。
27．权利要求21的制剂，其所述的FSH或FSH变体是选自如下所列群体的至少一种化合物(a):α-亚基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亚基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亚基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亚基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亚基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVEVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK
28．一种用于治疗不育症的方法，它包括以权利要求21的制剂向有需要的患者进行给药。
29．权利要求28的方法，其所述的患者选自人类、绵羊、牛、马或兔。
30．用于制备含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的稳定溶液制剂的过程，它包括FSH或FSH变体混溶于含盐水或一种盐的磷酸缓冲液。
31．一种用于医疗的制成品，它包括包装材料和一个含溶于水性稀释剂的一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体稳定溶液的药瓶，所述的包装材料包括一个表明该溶液适于超过24小时或更长时间使用的标签。
32．权利要求31的制成品，其所述的药品为玻璃容器，它具有一个用于多用途给药的塞子。
33．权利要求31的制成品，其所述的药瓶为一包装泡，它可以被穿刺并用于肺部给药。
34．权利要求31的制成品，其所述的药瓶为一pen-注射器设备。
35．一种制成品，它包括包装材料、盛有冻干的含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的第一个药瓶和含一种稳定的水性稀释剂的第二个药瓶，此处所述的包装材料包括一个标签用以指导患者在水稀释剂中再配所述的FSH或FSH变体以形成可使用超过24小时或更长时间的溶液。
36．权利要求35的制成品，其所述的第一个和第二个药瓶包含于一pen-注射器设备。
37．一种用于治疗患者的不育症的方法，它包括以溶于磷酸缓冲水性稀释剂的含一个α亚基和一个β亚基FSH或FSH变体的稳定溶液向有需要的患者进行给药，所述的溶液适于超过24小时或更长时间的给药。
38．一种使用含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体溶液治疗患者的不育症的方法，它包括以溶于水性稀释剂中的FSH或FSH变体的稳定溶液向有需要的患者进行给药，该溶液适于超过24小时或更长时间的给药。
39．FSH或FSH变体的至少一个多肽在制备稳定溶液中的使用，该稳定溶液适于超过24小时或更长时间的给药。
40．一种如此处所描述的制剂。
41．一种如此处所描述的制成品。
42．一种如此处所描述的制备方法。
43．一种如此处所描述的用途。
44．一种如此处所描述的方法。
45．权利要求1的制剂在治疗有需要的患者的不育症中的使用。
46．权利要求1的制剂的使用，此处所述的患者选自人类、绵羊、牛、马或兔。
47．含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的防腐溶液在治疗有需要的患者的不育症中的使用，所述的溶液适于超过24小时或更长时间的给药。
48．含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的稳定溶液在治疗有需要的患者的不育症中的使用，它包括以在含盐水或一种盐的磷酸缓冲液中的所述的FSH或FSH变体的溶液向有需要的患者进行超过24小时或更长时间的给药。
49．权利要求21的制剂在治疗有需要的患者的不育症中的应用。
50．权利要求49的制剂的使用，此处所述的患者选自人类、绵羊、牛、马或兔。
51．纯化的FSH或FSH变体的稳定溶液在治疗有需要的患者的不育症中的使用，FSH或FSH变体含一个α亚基和一个β亚基，它们溶于含盐水或一种盐的磷酸缓冲液中，用于超过24小时或更长时间的给药。
52．含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体的稳定溶液在治疗有需要的患者的不育症中的使用，其所述的溶于含盐水或一种盐的磷酸缓冲液中的FSH或FSH变体适于超过24小时或更长时间的使用。
53．一种生产制剂的制备方法，它包括将含一个α亚基和一个β亚基的FSH或FSH变体同一种防腐剂混合，该防腐剂选自酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其类似物、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，的水性稀释剂中。
54．一种生产稳定制剂的过程，它包括将含一个α亚基和一个β亚基的至少一种FSH或FSH变体同含盐水或一种盐的磷酸缓冲液混合，此处所述的FSH或FSH变体在23℃下60天后至少含90％的FSH或FSH变体二聚体。
55．权利要求53的过程，其防腐剂为苯酚、间甲苯酚、氯甲酚或其混合物。
56．权利要求53-54的任一过程，其FSH或FSH变体浓度约为1.0μg/ml至50mg/ml。
57．权利要求53-54的任一过程，它进一步含有一种等渗试剂。
58．权利要求53-54的过程，它进一步含有一种生理可耐受的缓冲液。
59．包括制备两个药瓶的制备方法，第一个药瓶含有冻干的FSH或FSH变体，第二个药瓶含一种防腐剂，该防腐剂选自酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、苄醇、烷基对羟基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其类似物、洁尔灭、氯化苄乙铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞及其各种衍生物的至少一种或混合物，的水性稀释剂中。
60．权利要求59的制备方法，其所述的FSH或FSH变体和防腐剂进一步被置于溶液中。
61．权利要求53-54的任一制备方法，其所述的FSH或FSH变体是选自如下所列群体的至少一种化合物(a):α-亚基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亚基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亚基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亚基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亚基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亚基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亚基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK
全文摘要
本发明涉及包含于制剂和制成品中的含有α亚基和β亚基的FSH和FSH变体。本发明提供了优越的新的蛋白和核酸,蛋白和核酸的多用途的药用溶剂,制剂,现有的商售制品没有被证明有如此长期的用途的性能。该产品特别适用于一段时间的治疗后,提高FSH和FSH变体的血液浓度。因此本发明满足了FSH和FSH变体的便利产品的需求。
文档编号A61P15/00GK1309567SQ99808813
公开日2001年8月22日 申请日期1999年7月15日 优先权日1998年7月23日
发明者J·A·霍夫曼, 吕继蓉 申请人:伊莱利利公司