专利名称：组织的固定方法
技术领域：
本发明的技术背景1.发明领域本发明一般性地涉及组织的固定，具体涉及一种环氧化物及用于组织固定的方法。
2.先有技术描述自体固有的心包和同源性的主动脉瓣膜等生物学组织，由于其具有良好的机械性能和生物相容性，已经被用于各种外科手术。生物学组织衍生的、以化学方法修饰的异源性组织已被用作外周或冠状血管的再造导管、修补物、韧带代替物和修复的心脏瓣膜。为人熟知的是以胶原纤维构造生物学组织的基本结构骨架。
胶原基质的生理化学性能和生物力学性能与胶原原纤维的结构直接相关，胶原分子通过共价的分子间交叉联接，稳定在原纤维中，这种交叉联接形成了具有足够强度的张力和生物稳定性的原纤维。
在异源性组织被植入生存主体环境的修复手术后，生物学组织会受到主体应答，包括细胞的和酶的攻击。先前的研究表明，植入的异源性胶原组织会刺激细胞的应答，导致植入假体受到晶状体细胞(phacocytes)(多形核白细胞、巨噬细胞)的物理侵害，已知巨噬细胞能够分泌胶原酶和其他的蛋白酶和氧自由基。异源性生物学组织很容易被这些蛋白水解酶，和/或通过氧化作用而降解，明显减少胶原原纤维的强度和寿命。为了达到长期的稳定性，异源性组织衍生的生物假体(bioprostheses)在植入人体进行长期使用之前，必须经过化学修饰，以增强它们对酶降解作用的抵抗力。这些化学修饰包括(1)通过交联来稳定胶原基质，例如增强胶原原纤维、弹性硬蛋白和其它蛋白质之间的分子交互作用，提高应激状态下的组织耐疲劳极限，和维护组织的整体性和防止炎症细胞的浸润；(2)将胶原组织改性，使其免疫原性减至最小异源性组织需要进行改性，以减小免疫原性，这样全身性的和局部的负面效应(如慢性炎症或排斥作用)会减至最小；(3)使酶攻击作用最小化的改性处理以化学方法修饰的组织可以减少被蛋白水解酶识别的可能性；并且优选交联和修饰是稳定性的，以期达到长期的最佳效果。
纤维性胶原的酶催化裂解程度受两个因素的影响可识别裂解部位对酶的可利用性，和胶原的螺旋状完整性程度。先期的研究工作提出，受到固定的具有较大交联度的组织，其抗降解性越大。
固定意味着通过与化学物质反应，胶原的氨基酸失活，使得异源性生物材料的抗原性以及被胶原酶和其它酶降解的可能性减至最小。
固定处理可以分为两种类型，第一个类型是交联，其中，具有多功能基的固定剂分子与两个或多个胶原基团反应，交联后，组织的机械性能发生变化。第二类型的固定处理可称为支化，其中，固定剂仅仅与一个基团反应，得到一个由起反应的氨基酸生成的分支。通过支化作用，组织的机械性能(如柔韧性)通常几乎不会发生改变。
如果被修饰的氨基酸足够多，以及如果接枝结构(即，支化)足够大以至改变局部的分子构象(即，序列和构象抗原决定部位/表位)，那么交联和支化都会改变胶原组织的抗原性。一般情况下，生物固定材料(组织)的固定程度越高，所导致的抗原性越低。
由于宿主细胞的活性和酶的活性是与炎症高度相关的，并且残留固定剂的毒性会引起局部的慢性炎症，因此人们希望假体的残留毒性最小。
接触血液的应用性胶原组织，例如用作心脏瓣膜和导管的胶原组织，还应当具有良好的血液相容性。当被用于这方面的用途时，亲水性、电荷性、表面纹理以及与血液接触表面的其它特性也能够显著影响组织的性能和耐用性。根据表面张力和血液相容性/生物粘合性的关系，可以观察到某些倾向。R.R.Baier和V.A.Depalma，在＂移植物表面与血栓形成的关系(The Relation ofthe Internal Surface of Grafts toThrombosis)＂，动脉咬合疾病的治疗Management of Arterial OcclusiveDisease)，Year Book Medical Publisher，Chicago，IL，147-163(1971)一文中，基于多年的观察，以材料的生物反应性趋势作为它们的相对临界表面张力的函数，积累了大量的数据。根据他们的工作得到的经验性图形被分为三个区(1)第一区，所对应的生物相互作用最小，为“生物相容性理想区”，其表面张力范围是20-30达因/cm(疏水表面)。该区是正常动脉所最常有的表面张力范围并且描述的是相对非凝血酶原的表面。(2)第二区，其范围是33-38达因/cm，并且包括了最常用聚合物的表面张力，出人意料的是，该区将血管移植最常用的聚合物(即，ePTFE和Dacron)排除在外。(3)第三区，其范围是40-72达因/cm，并且被称为“良好生物粘合区”，这一“良好生物粘合区”适于那些需要良好向内生长的修复手术，如整形术和牙齿植入。
在20-30达因/cm范围内的临界表面张力，它对应于甲基(CH3)基团占优势的表面，表示植入样品固有的血栓形成阻力。生物组织可以用甲醛(FA)或戊二醛(GA)进行化学修饰或固定。在过去的30年中，异源性和同源性的组织被作为假体进行固定和植入。临床上，GA是最常用的固定剂，GA修饰最多的是赖氨酰ε-氨基，在邻近结构间形成交叉联结，并且它通过Schiff碱作用聚合而获得稳定化作用。GA产生的修饰作用足以使假体的抗原性最小化，并且使假体表面具有疏水性和负电荷性能，有利于良好的血液交互作用。但是，GA显著改变组织僵硬程度和促进组织钙化的倾向是这种固定剂众所周知的缺点。基于这些原因，GA已造成不少修复术的失败。
为了降低GA固定的假体的钙化趋势，业已作了尝试。例如Imamura等人的美国专利US 5,080,670公开了许多聚缩水甘油醚(商标名为DENACOL，生产商Nagasi Chemicals，Osaka，Japan)用于心脏瓣膜交联组织。Imamura等人认为，固定剂骨架中醚键(C-O)的存在，会使氧臂(oxygen arm)在交联桥接处成为柔韧的接合点，这样交联组织会具有柔韧性和疏水性。和GA用于固定心脏瓣膜交联组织相比较，用聚缩水甘油醚交联的生物组织显示出大的柔韧性(易弯性)和抗钙化性能。此外，环氧化合物比GA溶液的细胞毒性更小。
不幸的是，亲水材料对水具有附着倾向。另外，在这类亲水性表面已经观察到较大的蛋白和细胞的活化作用。这些作用会影响或降低生物组织的血液相容性。
Imamura等人所提出的策略的另一个可能的缺点是，醚键非常容易受到氧化作用的影响，并因此在植入体内后会一天天失去交联，特别是在应激反应下。参见M.A.Schubert、M.J.Wiggins、M.P.Schaefer、A.Hiltner和J.M.Anderson，＂双轴向应变聚(醚尿烷脲)弹性体的氧化性生物降机制(Oxidative Biodegradation Mechanisms of BiaxiallyStrained Poly(etherurethane urea.)Elastomers)＂，J.Biomed.Mater.Res.，Vol.29，337-347(1995)(“Schubert等人”)。
外来生物组织植入人宿主之后，巨噬细胞附着在植入物或外来物表面，变为激活状态，并能形成异种巨细胞。这些噬细胞释放过氧化物阴离子、过氧化氢、次氯酸盐和水解酶，这些副产物的局部浓度可能非常高。此外，界面环境(即，植入物周围)变为酸性(即低pH)范围。还会观察到，α2-巨球蛋白的吸收作用在生物降解中的重要作用，致使发生氧化和交联的破坏。
可以清楚地观察到醚键的裂解。对这种裂解可能的解释，现在可以假设为这种观察到的降解作用(即裂解)。对所移植的疏水性聚醚组织样品的红外光谱中出现的新谱带，可以用类似于Wu等人所提出的一种机制(含有聚(THF)不稳固片断(soft segment)的聚(醚脲烷)在体内的降解机制)和/或聚醚的自氧化机制进行解释。Y.Wu、C.Sellitti、J.M.Anderson、A.Hilmer、G.A.Lodoen和C.R.Payet，“聚(醚脲烷)在体内降解的FTIR-ATR研究”(An FTIR-ATRInvestigation of In VivoPoly(ether urethane)Degradation)J.Appl.Polym.Sci.，Vol.46，201-211(1992)。Wu报道了过氧化物阴离子基团与质子快速结合，形成过氧化氢基HOO°，后者攻击聚合物骨架，形成氢过氧化物基团POOH。氢过氧化物随后脱水形成酯，该酯然后因酯酶而水解，导致链的分裂，结果生成羧酸和醇基团。这一点在附
图1中链的左侧得到了阐明。
Schubert等人提出，自由基P°可能是含硫游离基(thiyl radica1)从聚醚的不稳固片断(soft segment)上的夺氢反应而形成的，所述含硫游离基是在羟基与(被吸收的)α2-巨球蛋白的游离巯基反应后形成的，这一点在附图1中链的右侧得到了阐明。
另一种形式的降解(自氧化)可以通过各种不同的反应途径发生，它们均涉及自由基机制。简而言之，这种自氧化链反应包括聚合物骨架上的氢过氧化物基团的形成和分解。氢过氧化物的均裂导致形成了羟基和烃氧基自由基(PO°)，后者可以通过氢裂解而形成酯，或者导致链的分裂，结果形成醛和酯基团。这些反应的发生并没有损失自由基的活性，剩余的自由基继续脱水作用。酯键的水解会导致醇和酸基团的形成。
由聚缩水甘油醚形成的交联一旦发生醚键的裂解，无论是单环氧化物或多环氧化物，也不管是哪个类型的聚缩水甘油醚，对组织的改变都将是相同的。改变部位的结构总是 或 根据先期的研究观察，单官能的缩水甘油醚不能够阻断酶的识别和潜在的抗原性。正如从新鲜组织所观察到的那样，缩水甘油甲醚(DENACOL EX-131)固定的组织在试管中振荡，被细菌胶原酶分解为碎片。参见R.Tu、S.H.Shen、D.Lin、C.Hata、K.Thyagarajan、Y.Noishiki和R.J.Quijano，“用单官能的和多官能的聚环氧化合物固定生物假体组织(Fixation of Bioprosthetie Tissues With Monofunctional andMultifunctional Polyepoxy Compounds)”，J.Biomed.Mater.Res.，Vol.28，677-684(1994)。此外，由于肽键的裂解而导致的游离氨基量的增加，与从新鲜组织中所看到的相当。换言之，缩水甘油醚的交联作用不是有效的。
上述内容有力地表明，缩水甘油醚的醚键非常容易受到氧化作用的影响。分裂的键无法阻止胶原酶的识别，因而。缩水甘油醚不能获得所期望的效果。因此，仍然需求更好的组织固定方法和处理方法，使得钙化作用减到最少，同时避免上述已知方法和处理方法所存在的问题。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种具有碳氢骨架的环氧化合物，它是水溶性的且其骨架中不含有醚键和酯键。适当的环氧化物试剂的例子包括具有下面基本结构式的单或双环氧化合物单环氧化合物 双环氧化合物 其中n＝1-10。
附图2是阐明按照本发明生产生物假体的方法的程序框图。
发明详述以下的详细描述是目前本发明的最佳实施方式。这些描述不具有限定的意义，而仅仅是用于对本发明实施方案的一般原则性的阐明。附加的权利要求很好地定义了本发明的范围。在某些情况下，对已知的设备、组成、组分、机理和方法省略了不必要的详述，但并不使本出于本发明的目的，术语“胶原组织”是指来自于动物，如哺乳动物的材料，具体例子包括，但不限于猪心脏瓣膜，牛心包，结缔组织衍生的材料如硬脑膜、腱鞘、韧带、皮肤、动脉、静脉等等。
本发明提供了用于胶原材料组织固定的交联剂。该交联剂为一种具有碳氢骨架的环氧化合物，它是水溶性的且其骨架上不含有醚键和酯键。适当的环氧化物试剂的例子包括具有下面基本结构式的单或双环氧化物单环氧化合物 双环氧化合物 其中n＝1-10。例如，n等于3的单环氧化合物如下所示 本发明的单环氧化物一般用于对那些柔韧性更为重要的组织进行的改性，这些组织的例子包括静脉瓣膜、食管和输尿管。本发明的多环氧化物(即双环氧化合物和具有两个或更多个活性环氧基团的环氧化物)，一般适于对那些植入后经受明显应力和负荷的组织进行改性，这些组织的例子包括动脉系统的心脏瓣膜、韧带和腱鞘。本发明的交联剂可广泛用于固定和改性各种不同的生物假体组织，包括牛心包和猪动脉瓣膜。制备和处理生物假体组织的方法如附图2的程序框图所示，并简述如下。
在步骤10，获取胶原组织并进行加工。从哺乳动物割取适宜的胶原组织，如动脉或静脉，按照已知方法修剪多余的肌肉、脂肪和结缔组织，按照已知方法对胶原组织进行清洗和制备，血管的内外用冷的生理盐水洗涤，除去所有的余血。
在步骤20，用70％的乙醇浸泡各个组织约1小时，以降低生物负荷水平(bioburden levels)，然后将组织存储在30％的乙醇中，直到需要时。
在步骤30，将细胞成分膨胀，要做到这一点，可以将新鲜的过滤水注射到各组织脉管的腔内，然后将其转移到盛有新鲜过滤水的容器中，然后，在进行超声处理之前，将过滤水中的组织保持冷冻至少一个小时。
在步骤40，将过滤水中的组织进行超声处理足够的时间，以除去细胞成分，之所以希望除去细胞成分，是因为它具有较强的抗原性，然后将组织用水充分洗涤。
在步骤50，实施固定。在pH 8.5-10.5，将先期准备好的胶原组织浸入本发明的水溶性环氧化物交联剂的水溶液中，浸泡一段时间(例如1-30天)，使之发生不可逆的交联。环氧化物交联剂的浓度优选范围是0.01M-1.0M，更优选在0.05M-0.5M之间。固定液每2-3天更换一次。
在步骤60，将胶原组织移出固定液，用适当的漂洗液进行漂洗，例如使用含有或不含有氨基酸的磷酸盐缓冲生理盐水。该漂洗除去了残余的固定剂反应活性。
在步骤70，进行最后的修剪和分支结扎。在不破坏脉管分支的情况下，将多余的结缔组织小心地修剪掉；有漏洞的组织脉管、撕脱的分支、血污或其它看得到的结构缺损均不采用。所有分支用4-0或5-0 Prolene缝合线进行缝合结扎。
在步骤80，进行最后的消毒。将胶原组织用非醛类消毒剂进行消毒，如0.1％碘溶液，然后储存在30％的乙醇溶液中，直到将组织移植。
第一个实施例用双环氧化物交联动脉移植物将新鲜的生物假体组织，如牛动脉，在水溶性多环氧化物交联剂的水溶液中进行培养，更具体讲，将0.2M的1，2，7，8-双环氧辛烷用含5％乙醇的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲剂缓冲至pH 9.5，在室温下(例如，25℃)将动脉置于该溶液中14天，使之发生不可逆交联，每2-3天更换固定液一次。第二个实施例带有瓣膜的静脉导管的改性将带有静脉瓣膜的静脉导管，在水溶性多环氧化物交联剂的水溶液中进行培养，更具体讲，将0.2M的1，2-环氧辛烷用含10％乙醇的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲剂缓冲至pH9.5，在25℃将静脉置于该溶液中14天，使之完全改性。
权利要求
1.一种用于生物假体组织交联的试剂，所述试剂含有具碳氢骨架的环氧基团，所述环氧化合物是水溶性的，且其骨架不含有醚键或酯键。
2.权利要求1的试剂，其中的环氧基团是具有下面基本结构式的单环氧化物 其中n＝1-10。
3.权利要求1的试剂，其中的环氧基团是具有下面基本结构式的多环氧化物 其中n＝1-10。
4.权利要求1的试剂，其中的环氧基团是1，2，7，8-双环氧辛烷。
5.权利要求1的试剂，其中的环氧基团是1，2-环氧辛烷。
6.一种用于生物假体组织交联的试剂，所述试剂含有具有下面基本结构式的水溶性的环氧化合物 其中n＝1-10。
7.权利要求6的试剂，其中的环氧化合物是1，2，7，8-双环氧辛烷。
8.权利要求6的试剂，其中的环氧化合物是1，2-环氧辛烷。
9.含有交联的具碳氢骨架的环氧化合物的生物假体组织，所述环氧化合物是水溶性的，且其骨架不含有醚键或酯键。
10.权利要求9的生物假体组织，其中的环氧化合物是具有下面基本结构式的单环氧化物 其中n＝1-10。
11.权利要求9的生物假体组织，其中的环氧化合物是具有下面基本结构式的多环氧化物 其中n＝1-10。
12.权利要求9的生物假体组织，其中的环氧化合物是1，2，7，8-双环氧辛烷。
13.权利要求9的生物假体组织，其中的环氧化合物是1，2-环氧辛烷。
14.权利要求9的生物假体组织，其中的生物假体组织选自猪主动脉瓣膜、牛心包、硬脑膜、腱鞘、韧带、皮肤、动脉和静脉。
15.一种交联生物假体组织的方法，包括a.制备具有碳氢骨架的环氧化合物的溶液，所述环氧化合物是水溶性的，且其骨架不含有醚键或酯键；和b.将生物假体组织浸入所述溶液。
16.权利要求15的方法，其中将生物假体组织在所述溶液中浸泡1-30天。
17.权利要求16的方法，其中溶液中环氧化合物的浓度范围是0.01M-1.0M。
18.权利要求17的方法，其中溶液中环氧化合物的浓度范围是0.05M-0.5M。
19.权利要求15的方法，其中将生物假体组织在25℃浸泡于所述溶液中。
全文摘要
本发明提供了环氧化物,它具有碳氢骨架,溶于水且其骨架中不含有醚或酯键。环氧化合物适当的例子包括单环氧化合物或双环氧化合物,具有各自的基本结构式:单环氧化合物:(a);双环氧化合物:(b);其中n=1至10。
文档编号A61L27/36GK1330528SQ99814433
公开日2002年1月9日 申请日期1999年12月14日 优先权日1998年12月15日
发明者杨军 申请人:Av康复股份有限公司