生物学组合物及其成分和用途的制作方法

专利名称：生物学组合物及其成分和用途的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及一种分离的乙型肝炎病毒(HBV)，其表面成分相对于参照乙型肝炎病毒(HBV)显示改变的免疫学特性(profile)。此处认为参照HBV包含HBV基因型A-F的复合的或共有的核苷酸或氨基酸序列。此处认为本发明的分离的HBV是相对于参照HBV的HBV变体。改变的免疫学特性使得本发明的HBV变体对针对表面成分的疫苗较不敏感。本发明的HBV变体通常来自抗HBV化疗(特别是针对破坏HBV聚合酶活性或功能的化疗)中的选择压力，和/或在针对表面成分的免疫压力之后产生。免疫压力可能由HBV的天然暴露或者接种无毒或减毒HBV或HBV成分之后引起。本发明还提供了对应于HBV变体表面成分的重组多肽及其衍生物和化学等同物。本发明的HBV变体和重组多肽及其衍生物和化学等同物可用于能够诱导针对HBV变体的中和免疫应答的生物学组合物。
背景技术：
此说明书中涉及的大量出版物的文献索引列于说明书的结尾。
重组DNA技术的快速发展大大促进了医学和保健领域的进步。重组疫苗和治疗性组合物的产生尤其如此。重组技术提供了产生疫苗的重组成分的方法，并提供了筛选或鉴定可用于治疗性组合物的成分的遗传基础。
乙型肝炎病毒(HBV)能够引起由亚临床感染至慢性活跃性的和爆发性肝炎，而且能够导致急性肝坏死。
HBV基因组一条是环状双链DNA分子(1)[还可参阅

图1]，包含一系列重叠基因。例如，编码DNA聚合酶的基因与病毒包膜基因Pre-S1、Pre-S2、和S重叠，并与X和核心基因部分重叠。HBV包膜包含小的、中等、和大的HBV表面蛋白质。大的蛋白质成分通常称为HBV表面抗原(HBsAg)，由S基因序列编码。Pre-S1和Pre-S2基因序列编码其它包膜成分(2)。
HBsAg包含称为“a”决定簇的抗原性区域(3)。“a”决定簇是复杂的，构象性的，且依赖高度保守的半胱氨酸残基间的二硫键。在“逃脱”针对传统疫苗产生的免疫应答的HBV变体中已经涉及了导致“a”决定簇中变化的基因变异(4-8)。特别常见的一种突变是位于HBsAg的第145位氨基酸的替换G145R，即以精氨酸(R)替换甘氨酸(G)。此突变影响“a”表位区域。
对治疗或预防HBV感染中化学和免疫学干涉渐增的依赖导致出现对干预治疗有抗性的HBV变体的更大选择压力。这种变体称为“逃脱”突变体。
需要预示HBV的潜在疫苗逃脱变体，使得能够快速制备生物学组合物，作为针对经修饰病毒或其改变的抗原性成分的疫苗。
发明概述氨基酸序列中的特定突变此处表述为“Xaa1nXaa2”，其中Xaa1是突变前的氨基酸残基，n是残基编号，是Xaa2突变后的氨基酸残基。缩写“Xaa”可以是三字母或单字母的氨基酸代码。单字母代码的变体表述为“X1nX2”，其中X1和X2分别与Xaa1和Xaa2相同。以基序Tyr Met Asp Asp(YMDD)中的甲硫氨酸残基为第550位残基，对乙型肝炎病毒DNA聚合酶的氨基酸残基进行编号。
此处认为参照HBV包含HBV基因型A-F的复合的或共有的核苷酸或氨基酸序列。
本发明的一个方面提供了相对于参照HBV而言其表面成分显示改变的免疫学特性的变体HBV。
本发明的另一个方面针对一种HBV变体，其包含一种表面抗原，该抗原的氨基酸序列相比于参照HBV的表面抗原而言包含单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短，其中针对参照表面抗原产生的抗体中和所述HBV变体的能力降低。
本发明的另一个方面提供了其表面抗原具有的氨基酸序列相比于式I中所示氨基酸序列而言带有单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短的HBV变体，其中HBV变体的表面抗原相对于式I定义的表面抗原而言显示改变的免疫学特性，且其中HBV变体通过HBV DNA聚合酶的核苷类似物选择。
本发明的另一个方面涉及一种HBV变体，其包含的表面抗原具有的氨基酸序列相比于式I中所示氨基酸序列而言包含单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短，其中HBV变体的表面抗原相比于式I定义的表面抗原而言显示改变的免疫学特性，且其中选择HBV变体用于随后的针对式I定义的表面抗原的免疫学治疗。
本发明的另一个方面提供了一种HBV变体，其包含的核苷酸序列带有对式III中所示核苷酸序列的单个或多个核苷酸替换、添加、和成删除，其中HBV变体具有的表面抗原相对于式I定义的表面抗原而言显示改变的免疫学特性。
本发明的另一个方面提供了分离的HBsAg、或其重组体或衍生物、或其化学等同物。
本发明的另一个方面涉及分离的HBsAg、或其重组体或衍生物、或其化学等同物，其中所述HBsAg、或其重组体或衍生物、或其化学等同物相比于参照HBV的HbsAg而言显示改变的免疫学特性。
本发明的另一个方面提供了一种分离的HbsAg，或其重组体或衍生物或其化学等同物，其中所述HbsAg或其重组体、或其化学等同物包含的一种氨基酸序列相对于参照HBV的HbsAg而言包含单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短，其中针对参照HBV的中和抗体中和携带所述HBsAg变体的HBV的中和活性降低或消失。
本发明的另一个方面构思了一种包含HBV变体或来自所述HBV变体的HBsAg、或其重组体或衍生物、或其化学等同物的生物学组合物。
附图简述图1是显示HBV的重叠基因组的示意图。
图2是包含RNA聚合酶蛋白质保守区的HBV DNA聚合酶蛋白质的氨基酸共有序列的示意图。这些区域表示为结构域A-E并标了下划线。在共有序列中，YMDD基序中的M指定为氨基酸编号550。在3TC和/或FCV处理中经历突变的氨基酸以粗体表示。星号(*)指示共有序列中的该位置有超过3种氨基酸的可能性。HBsAg的主要亲水区包含中和结构域，由双线表示。改变HBsAg的聚合酶突变体以斜体表示。
图3是来自多种HBV毒株、编码表面抗原的核苷酸序列的示意图。在核苷酸序列的上面显示了由第108位氨基酸起始的表面抗原的氨基酸序列。
图4是显示野生型(即参照HBV)和多种突变体(1，模拟物；2，野生型；3，F512L；4，V519L；5，M550I；6，S565P；7，双重突变体L256M＋M550V；8，三重突变体V519L＋L526M＋M550V；9，W499Q)的HBsAg结合实验的示意图。
优选实施方案的详细描述本发明部分涉及相对于参照标准而言表面成分显示改变的免疫学特性的HBV变体的鉴定。术语“变体”指其最宽广的含义，包括例如相对于参照HBV而言的疫苗逃脱突变体、衍生物、经修饰形式、和经改变形式的HBV等突变体。变体通常在病毒基因组中包含单个或多个核苷酸替换、添加、和/或删除或者截短，并在病毒肽、多肽、或蛋白质中包含相应的单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短。
具有改变的免疫学特性的本发明优选变体基本上不受针对传统HBV疫苗(诸如包含参照HBV或其表面成分的疫苗)的中和免疫应答的影响。表达“基本上不受影响”包括对通过疫苗产生的免疫应答的敏感性降低。也可以通过对诸如靶向HBV DNA聚合酶的核苷酸类似物等化学试剂之敏感性的降低方便地测定敏感性的降低。由于DNA聚合酶和某些病毒表面成分的读码框的重叠性，表面成分的改变可能在DNA聚合酶中产生相应的改变。
本发明的HBV的优选表面成分是HBV表面抗原(HBsAg)。本发明提出HBV变体的HBsAg相对于参照HBV的HbsAg而言显示改变的免疫特性。为了本发明的目的，参照HBV一般包含这样的HbsAg，其具有的氨基酸序列基本上如Norder等人(9)提出的、包含所有已知的HBV基因型(目前A-F)的氨基酸序列所示。下面的式I列出了被认为定义参照HBV的HBsAg的氨基酸序列。
式IMX1X2X3X4SGX5LX6PLX7VLQAX8X9FX10LTX11IX12X13IPX14SLX15SWWTSLNFLGX16X17X18X19CX20GX21NX22QSX23X24SX25HX26PX27X28CPPX29CX30GYRWMCLX31RFIIFLX32ILLLCLIFLLVLLDX33QGMLXZ34VCPLX35PX36X37X38TTSX39X40X41CX42TCX43X44X45X46QGX47SX48X49PX50X51CCX52KPX53X54GNCTCIPIPSX55WAX56X57X58X59LWEX60X61SX62RX63SWLX64LLX65X66FVQX67X68X69X70LX71PX72VWX73X74X75IWX76X77WX78WX79PX80X81X82X83IX84X85PFX86PLLPIFX87X88LX89X90X91I其中X1是E或G或D；X2是N或S或K；X3是I或T；X4是T或A；X5是F或L；X6是G或R；X7是L或R；X8是G或V；X9是F或C；X10是L或S或W；X11是R或K；X12是L或R；X13是T或K；X14是Q或K；X15是D或H；X16是G或E或A；X17是S或A或V或T或L；X18是P或T；X19是V或R或T或K或G；X20是L或P；X21是Q或L或K；X22是S或L；X23是P或Q；X24是T或I；X25是N或S；X26是S或L；X27是T或I；X28是S或C；X29是I或T；X30是P或A；X31是R或Q；X32是F或C；X33是Y或C；X34是P或H或S；X35是I或L；X36是G或R；X37是S或T；X38是T或S；X39是T或V或A；X40是G或E或Q；X41是P或A或S；X42是K或R；X43是T或M；X44是T或I或S或A；X45是P或T或A或I或L；X46是A或V；X47是N或T；X48是M或K或L；X49是F或Y或I；X50是S或Y；X51是C或S；X52是T或I或S；X53是T或S；X54是D或A；X55是S或T；X56是F或L；X57是A或G或V；X58是K或R或T；X59是Y或F；X60是W或G；X61是A或G；X62是V或A；X63是F或L；X64是S或N；X65是V或A；X66是P或Q；X67是W或C或S；X68是F或C；X69是V或D或A；X70是G或E；X71是S或F；X72是T或I；X73是L或P；X74是S或L；X75是A或V；X76是M或I；X77是M或I；X78是Y或F；X79是G或E；X80是S或N或K；X81是L或Q；X82是Y或F或H或C；X83是S或G或N或D或T；X84是V或L；X85是S或N；X86是I或M或L；X87是F或C；X88是C或Y；X89是W或R；X90是V或A；且X91是Y或I或S。
相应的，本发明的一个方面提供了其表面成分相对于参照HBV而言显示改变的免疫学特性的HBV变体。
更具体的说，本发明涉及其表面抗原具有的氨基酸序列带有对参照HBV的表面抗原的单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短的HBV变体，其中针对参照表面抗原产生的抗体中和所述HBV变体的能力降低。
上面的式I列出了参照HBV的HBsAg的氨基酸序列。
由于本发明的HBV变体基本上不受针对HBV聚合酶的化学治疗或针对表面抗原的疫苗治疗的不利影响，因此它在此处也称为“逃脱”突变体。术语“逃脱”突变体还包括对针对参照HBV的化学或疫苗治疗的敏感性降低。
本发明的HBV变体还优选以分离的形式存在。分离的HBV包括病毒的生物学纯形式。术语“分离的”指病毒经历了至少一个脱离非病毒成分的纯化或分离步骤。病毒制备物相对于非病毒成分而言优选包含至少大约10％，更优选至少大约20％，仍更优选至少大约30％，甚至更优选至少大约40％，仍然更优选至少大约50％，或更高纯度的HBV变体，如通过病毒感染性、免疫学相互作用、DNA聚合酶活性、分子量、碳水化合物含量、或其它合适方法所测量。
本发明的优选变体由下列选择压力获得。优选的选择压力是针对HBVDNA聚合酶的化学压力(如通过核苷类似物)，其选择编码HBV DNA聚合酶的基因中的突变和编码HBsAg的基因中的相应突变。这是因为HBVDNA聚合酶和HBsAg的开放读码框重叠。编码HBV DNA聚合酶的一个或多个核苷酸的突变可能对编码HBsAg的核苷酸序列有影响。本发明还延伸到免疫学选择后HBsAg中的变化，所述选择是基于包含HBsAg或其衍生物的疫苗或者包含相同成分的HBV的，其中HBsAg的氨基酸序列与式I所示基本相同。
相应的，本发明的另一个方面提供了其表面抗原具有的氨基酸序列相比于式I所示氨基酸序列而言包含单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短的HBV变体，其中HBV变体的表面抗原相比于式I定义的表面抗原而言显示改变的免疫学特性，且其中HBV变体通过HBV DNA聚合酶的核苷类似物选择。
本发明的一个相关实施方案涉及其表面抗原具有的氨基酸序列相比于式I所示氨基酸序列而言包含单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短的HBV变体，其中HBV变体的表面抗原相比于式I定义的表面抗原而言显示改变的免疫学特性，且其中HBV变体经选择用于随后的针对式I定义的表面抗原的免疫学治疗。
本发明中与表面抗原的改变相关的免疫学特性包括改变的体液或T细胞应答。改变的免疫学特性的范例包括抗体特异性的改变、表位或“a”决定簇中的氨基酸序列的改变、诱导针对参照HBV的HbsAg之T细胞增殖的能力的改变。改变的免疫学特性优选地是指能够基本上中和或降低参照HBV的血清或血液水平的中和抗体其中和和/或清除HBV变体的能力基本上消失或降低。
在本发明的优选方面中，病毒变体可能只在DNA聚合酶或表面抗原中携带突变，或者可能在两种分子中都携带突变。术语“突变”指其最宽广的含义，包括基本上不影响DNA聚合酶或表面抗原的正常功能的沉默突变，或者可以是具有核苷类似物抗性的选择效果或疫苗逃脱突变体表型的活泼突变。当本发明中发生多重突变或由单个突变产生多种表型时，至少一种突变必须是活泼的，或者病毒必须显示至少一种改变的表型，诸如核苷类似物抗性或与参照HBV的表面抗原的免疫学相互作用性降低。
本发明延伸到HBsAg突变体的任一新型变体或新用途，所述突变体在HBsAg的氨基酸序列中相对于式I所示氨基酸序列而言携带单个或多个替换、添加、和/或删除或者截短。在另一个相关实施方案中，本发明延伸到HBsAg的氨基酸序列中相对于式I所示氨基酸序列而言的任何单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短，由下面的式II所示HBV DNA聚合酶的催化区的单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除定义式IISZ1LSWLSLDVSAAFYHZ2PLHPAAMPHLLZ3GSSGLZ4RYVARLSSZ5SZ6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZ11LHZ12Z13CSRZ14LYVSLZ15LLYZ16TZ17GZ18KLHLZ19Z20HPIZ21LGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z31FZ32YM*DDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37HZ38EZ39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46LLZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLNFMGYZ50IG其中X是任何氨基酸；Z1是N或D；Z2是I或P；Z3是I或V；Z4是S或D；Z5是T或N；Z6是R或N；Z7是N或I；Z8是N或Y或H；Z9是H或Y；Z10是G或R；Z11是D或N；Z12是D或N；Z13是S或Y；Z14是N或Q；Z15是L或M；Z16是K或Q；Z17是Y或F；Z18是R或W；Z19是Y或L；Z20是S或A；Z21是I或V；Z22是I或L；Z23是V或G；Z24是C或L；Z25是A或S；Z26是V或M；Z27是V或T；Z28是R或C；Z29是F或P；Z30是L或V；Z31是A或V；Z32是S或A；Z33是V或L或M；Z34是K或R；Z35是S或T；Z36是V或G；Z37是Q或E；Z38是L或S或R；Z39是S或F；Z40是F或Y；Z41是T或A；Z42是A或S；Z43是V或I；Z44是T或C；Z45是N或S；Z46是F或V；Z47是S或D；Z48是L或V；Z49是N或Q；Z50是V或I；且M*是第550位氨基酸。
HBsAg的氨基酸序列中的优选突变是HBsAg的氨基酸1-10、5-15、10-20、15-25、20-30、25-35、30-40、35-45、40-50、45-55、50-60、55-65、60-70、65-75、70-80、75-85、80-90、85-95、90-100、95-105、100-110、105-115、110-120、115-125、120-130、125-135、130-140、135-145、140-150、145-155、150-160、155-165、160-170、165-175、170-180、175-185、180-190、185-195、190-200、195-205、200-210、205-215、210-220、215-225、220-226(指式I中的编号)中的氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短。特别有用的突变是G112R、T123P、Y/F134S、D144E、G145R、A157D、E164D、F170L、M195I、W196L、S196W、W196STOP、M198I、W199S、S204T、和S210R。术语“stop”指终止密码子。
更优选的突变是D144E、G145R、A157D、E164D、M195I、W196L、S196W、W196STOP、M198I、W199S、和S210R。
本发明的HBsAg突变还可以以HBV DNA聚合酶中的相应突变定义。HBV DNA聚合酶中的突变可以在氨基酸421-431、426-436、431-441、436-446、441-451、446-456、451-461、456-466、461-471、466-476、471-481、476-486、481-491、486-496、491-501、496-506、501-511、506-516、511-521、516-526、521-531、526-536、531-541、536-546、541-551、546-556、551-561、556-566、561-571、566-576、571-581、576-586、581-591、586-596、591-601、596-601中(指式II中的编号)。
优选的HBV DNA聚合酶突变包括Q476、N480G、N485K、K495R、R499O、G499E、W499Q、F512L、1515L、V519L、L526M、M550V、M550I、V553I、S565P。有用的多重突变体包括L526M/M550I、L526M/M550V、V519L/L526M/M550V、和V519L/L526M/M550I。
本发明HBV变体的改变的HBsAg分子还可以以核苷酸水平定义。下面的式III列出了编码参照HBV的HBsAg的核苷酸序列式IIIACN1AAACCTN2N3GGAN4GGAAAN5TGCACN6TGTATTCCCATCCCATCN7TCN8TGGGCTTTCGN9AAN10ATN11CCTATGGGAGN12GGGCCTCAGN13CCGTTTCTCN14TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGN15AGGGCTTTCCCCCACTGTN16TGGCTTTCAGN17TATATGGATGATGTGGTN18TTGGGGGCCAAGTCTGTACAN19CATCN20TGAGTCCCTTTN21TN22CCN23CTN24TTACCAATTTCTTN25TGTCTN26TGGGN27ATACATT其中N1是A或C；N2是T或A；N3是C或T；N4是C或T；N5是C或T；N6是C或T；N7是A或G；N8是T或C；N9是C或G；N10是G或A；N11是T或A；N12是T或G；N13是T或C；N14是C或T；N15是T或C；N16是T或C；N17是T或C；N18是A或T；N19是A或G；N20是T或G；N21是A或T；N22是A或G；N23是T或G；N24是A或G；N25是T或C；N26是T或C；且N27是T或C。
本发明延伸到显示与式III有至少大约60％同一性的核苷酸序列，或能够在低严谨条件下于42℃与其杂交且编码HBsAg的免疫学特性相对于参照HBV的HbsAg而言改变的序列。
相应的，本发明的另一个方面提供了其核苷酸序列包含对式III所示核苷酸序列的单个或多个核苷酸替换、添加、和/或删除的HBV变体，其中HBV变体的表面抗原相对于式I定义的表面抗原而言显示改变的免疫学特性。
HBV变体优选包含与式III所示核苷酸序列具有至少大约80％同一性或能够在中等严谨条件下于42℃与其杂交的核苷酸序列。相对于式III所示核苷酸序列的同一性百分数优选至少大约85％，至少大约90％，至少大约95％，但是低于100％。
术语“相似性”，如此处所用，包括所比较序列之间在核苷酸或氨基酸水平的确切的同一性。当在核苷酸水平没有同一性时，“相似性”包括产生不同的然而相互之间在结构、功能、生化、和/或构象水平彼此相关的氨基酸序列的序列间差异。当在氨基酸水平没有同一性时，“相似性”包括相互之间在结构、功能、生化、和/或构象水平彼此相关的氨基酸。在特别优选的实施方案中，在同一性而非相似性水平进行了核苷酸和氨基酸比较。可以获得多种程序来比较核苷酸和氨基酸序列。优选的程序采用恰当的排列。Gap就是这样的一种程序，它考虑所有可能排列和缺口位置并产生最大数目匹配碱基和最小数目缺口的排列。Gap使用Needleman和Wunsch(10)的排列方法。Gap阅读的评分矩阵包含每种可能的GCC符号匹配的值。Gap可以由ANGIS(澳大利亚国家基因组信息服务中心，Australian National Genomic Information Service)的网络站点http//mel1.angis.org.au获得。
此处所指于42℃的低严谨度包括用于杂交的至少大约0％(v/v)到至少大约15％(v/v)甲酰胺和至少大约1M到至少大约2M盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M盐。如果需要，也可以应用其它严谨度条件，诸如中等严谨度，包括用于杂交的至少大约16％(v/v)到至少大约30％(v/v)甲酰胺和至少大约0.5M到至少大约0.9M盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M盐；或高严谨度，包括用于杂交的至少大约31％(v/v)到至少大约50％(v/v)甲酰胺和至少大约0.01M到至少大约0.15M盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M盐。通常，洗涤于Tm＝69.3＋0.41(G＋C)％(11)进行。然而，双链DNA的Tm随着错配碱基对数目每升高1％而降低1℃(12)。
本发明还延伸到此处所述HBV变体的分离的表面成分。更具体的说，本发明提供了分离的HBsAg、或其重组体或衍生物、或其化学等同物。分离的表面成分，更具体的说，分离的HBsAg、或其重组体、衍生物、和化学等同物可用于开发生物学组合物，诸如疫苗制剂。
相应的，本发明的另一个方面涉及分离的HBsAg变体、或其重组体和衍生物、或其化学等同物，其中所述HBsAg、或其重组体和衍生物、或其化学等同物相对于参照HBV的HbsAg而言显示改变的免疫学特性。
更具体的说，本发明提供了分离的HBsAg变体、或其重组体或衍生物、或其化学等同物，其中所述HBsAg、或其重组体或衍生物、或其化学等同物而言的氨基酸序列带有对参照HBV的HbsAg的单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短，且其中针对参照HBV的中和抗体其中和携带所述HBsAg变体的HBV的活性消失或降低。
术语“分离的”与分离的HBV变体中的含义相同。
参照HBV此处方便的定义为包含具有式I所示氨基酸序列的HBsAg，或间接的由式II所示HBV DNA聚合酶的氨基酸序列或式III所示编码HBsAg的核苷酸序列定义。
如上所述，本发明延伸到HBV表面成分(特别是HBsAg)的衍生物和化学等同物(即类似物)。衍生物包括对HbsAg分子的单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除。对氨基酸序列的“添加”包括与其它肽、多肽、或蛋白质的融合，或与核苷酸序列的融合，包括与其它病毒成分的融合。
此处构思的HBsAg变体的类似物包括(但不限于)对侧链的修饰、和/或在肽、多肽、或蛋白质的合成过程中非天然氨基酸的掺入和在使用交联剂和对蛋白质分子或其类似物增加构象限制的其它方法中产生的其它衍生物。这些类型的修饰可用于稳定在诊断性试验或治疗性方案中使用的免疫相互作用活性分子。
本发明构思的侧链修饰的范例包括氨基的修饰，诸如通过与醛反应随后被NaBH4还原的还原性烷基化；与乙酰亚氨酸甲酯的脒化；与乙酸酐的酰化；与氰酸盐的甲氨酰化；氨基与2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的三硝基苄化；氨基与琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的酰化；和赖氨酸与吡哆醛-5磷酸反应随后被NaBH4还原的吡哆酸化。
精氨酸残基的胍基可以通过与诸如2，3-丁二酮、苯乙二醛、和乙二醛等试剂形成杂环缩合产物而进行修饰。
羧基可以进行修饰，通过碳二亚胺活化经由形成O-酰基异脲，随后衍生成例如相应的酰胺。
巯基可以通过诸如与碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；过酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫化合物形成混和二硫化物；与马来亚胺、马来酸酐、或其它取代的马来亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基苯酚、和其它汞形成汞衍生物；与氰酸盐在碱性pH甲氨酰化等方法而进行修饰。
色氨酸残基可以通过例如与N-溴琥珀酰亚胺的氧化、或吲哚环与2-羟基-5-硝基苯溴化物或磺酰卤的烷化而进行修饰。
另一方面，酪氨酸残基可以通过与四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而改变。
组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过与碘乙酸衍生物的烷化或与焦碳酸二乙基酯的N-乙酯基化而实现。
在肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的范例包括(但不限于)使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、叔丁基氨酸、正缬氨酸、苯甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩丙氨酸、和/或氨基酸的D型异构体。表1列出了此处构思的非天然氨基酸。此处描述的这些非天然氨基酸和其它衍生物可能有助于稳定疫苗组合物中的分子。
表1非常见氨基酸 代码 非常见氨基酸代码α-氨基丁酸 Abu L-N-甲基丙氨酸 Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸酯 Mgabu L-N-甲基精氨酸 Nmarg氨基环丙羧酸 Cpro L-N-甲基天冬酰胺 Nmasn氨基异丁酸Aib L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp氨基降冰片基羧酸 Norb L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys环己基丙氨酸 Chexa L-N-甲基谷氨酰胺 Nmgln环戊基丙氨酸 Cpen L-N-甲基谷氨酸 NmgluD-丙氨酸 Dal L-N-甲基组氨酸 NmhisD-精氨酸 Darg L-N-甲基异亮氨酸 NmileD-天冬氨酸Dasp L-N-甲基亮氨酸 NmleuD-半胱氨酸Dcys L-N-甲基赖氨酸 NmlysD-谷氨酰胺Dgln L-N-甲基甲硫氨酸 NmmetD-谷氨酸 Dglu L-N-甲基正亮氨酸 NmnleD-组氨酸 Dhis L-N-甲基正缬氨酸 NmnvaD-异亮氨酸Dile L-N-甲基鸟氨酸 NmornD-亮氨酸 Dleu L-N-甲基苯丙氨酸 NmpheD-赖氨酸 Dlys L-N-甲基脯氨酸 NmproD-甲硫氨酸Dmet L-N-甲基色氨酸 NmserD-鸟氨酸 Dorn L-N-甲基苏氨酸 NmthrD-苯丙氨酸Dphe L-N-甲基色氨酸 NmtrpD-脯氨酸 Dpro L-N-甲基酪氨酸 NmtyrD-丝氨酸 Dser L-N-甲基缬氨酸 NmvalD-苏氨酸 Dthr L-N-甲基乙基甘氨酸 NmetgD-色氨酸 Dtrp L-N-甲基-叔丁基甘氨酸 NmtbugD-酪氨酸 Dtyr L-正亮氨酸 NleD-缬氨酸 Dval L-正缬氨酸 NvaD-α-甲基丙氨酸 Dmala α-甲基-氨基异丁酸酯 MaibD-α-甲基精氨酸 Dmarg α-甲基-γ-氨基丁酸酯 MgabuD-α-甲基天冬酰胺 Dmasn α-甲基环己基丙氨酸 MchexaD-α-甲基天冬氨酸 Dmasp α-甲基环戊基丙氨酸 McpenD-α-甲基半胱氨酸 Dmcys α-甲基-α-萘基丙氨酸 ManapD-α-甲基谷氨酰胺 Dmgln α-甲基青霉胺 MpenD-α-甲基组氨酸 Dmhis N-(4-氨基丁基)甘氨酸NgluD-α-甲基异亮氨酸 Dmile N-(2-氨基乙基)甘氨酸NaegD-α-甲基亮氨酸 Dmleu N-(3-氨基丙基)甘氨酸NornD-α-甲基赖氨酸 Dmlys N-氨基-α-甲基丁酸酯NmaabuD-α-甲基甲硫氨酸 Dmmet α-萘基丙氨酸 AnapD-α-甲基鸟氨酸 Dmorn N-苄基甘氨酸NpheD-α-甲基苯丙氨酸 Dmphe N-(2-氨甲酰乙基)甘氨酸 NglnD-α-甲基脯氨酸 Dmpro N-(氨甲酰甲基)甘氨酸NasnD-α-甲基丝氨酸 Dmser N-(2-羟乙基)甘氨酸 NgluD-α-甲基苏氨酸 Dmthr N-(羧甲基)甘氨酸NaspD-α-甲基色氨酸 Dmtrp N-环丁基甘氨酸 NcbutD-α-甲基酪氨酸 Dmtyr N-环庚基甘氨酸 NchepD-α-甲基缬氨酸 Dmval N-环己基甘氨酸 NchexD-N-甲基丙氨酸 DnmalaN-环癸基甘氨酸 NcdecD-N-甲基精氨酸 DnmargN-环十二烷基甘氨酸 NcdodD-N-甲基天冬酰胺DnmasnN-环辛基甘氨酸 NcoctD-N-甲基天冬氨酸DnmaspN-环丙基甘氨酸 NcproD-N-甲基半胱氨酸DnmcysN-环十一烷基甘氨酸 NcundD-N-甲基谷氨酰胺DnmglnN-(2，2-二苯乙基)甘氨酸 NbhmD-N-甲基谷氨酸 DnmgluN-(3，3-二苯丙基)甘氨酸 NbheD-N-甲基组氨酸 DnmhisN-(3-胍丙基)甘氨酸 NargD-N-甲基异亮氨酸DnmileN-(1-羟乙基)甘氨酸 NthrD-N-甲基亮氨酸 DnmleuN-(羟乙基)甘氨酸NserD-N-甲基赖氨酸 DnmlysN-(咪唑乙基)甘氨酸 NhisN-甲基环己基丙氨酸Nmchexa N-(3-吲哚乙基)甘氨酸 NhtrpD-N-甲基鸟氨酸Dnmorn N-甲基-γ-氨基丁酸酯 NmgabuN-甲基甘氨酸 NalaD-N-甲基甲硫氨酸 DnmmetN-甲基氨基异丁酸酯Nmaib N-甲基环戊基苯丙氨酸 NmcpenN-(1-甲基丙基)甘氨酸 NileD-N-甲基苯丙氨酸 DnmpheN-(2-甲基丙基)甘氨酸 NleuD-N-甲基脯氨酸 DnmproD-N-甲基色氨酸Dnmtrp D-N-甲基丝氨酸 DnmserD-N-甲基酪氨酸Dnmtyr D-N-甲基苏氨酸 DnmthrD-N-甲基缬氨酸Dnmval N-(1-甲基乙基)甘氨酸 Nvalγ-氨基丁酸 GabuN-甲基-萘基丙氨酸 NmanapL-叔丁基甘氨酸TbugN-甲基青霉胺 NmpenL-乙基甘氨酸 Etg N-(p-羟基苯基)甘氨酸 NhtyrL-同型苯丙氨酸HpheN-(硫甲基)甘氨酸 NcysL-α-甲基精氨酸 Marg青霉胺 PenL-α-甲基天冬氨酸 MaspL-α-甲基丙氨酸MalaL-α-甲基半胱氨酸 McysL-α-甲基天冬酰胺 MasnL-α-甲基谷氨酰胺 MglnL-α-甲基-叔丁基甘氨酸 MtbugL-α-甲基组氨酸 MhisL-甲基乙基甘氨酸 MetgL-α-甲基异亮氨酸 MileL-α-甲基谷氨酸MgluL-α-甲基亮氨酸 MleuL-α-甲基同型苯丙氨酸 MhpheL-α-甲基甲硫氨酸 MmetN-(2-甲基硫乙基)甘氨酸 NmetL-α-甲基正缬氨酸 MnvaL-α-甲基赖氨酸MlysL-α-甲基苯丙氨酸 MpheL-α-甲基正亮氨酸 MnleL-α-甲基丝氨酸 MserL-α-甲基鸟氨酸MornL-α-甲基色氨酸 MtrpL-α-甲基脯氨酸MproL-α-甲基缬氨酸 MvalL-α-甲基苏氨酸MthrN-(N-(2，2-二苯基乙基)Nnbhm L-α-甲基酪氨酸Mtyr氨甲酰甲基)甘氨酸 L-N-甲基同型苯丙氨酸 Mnhphe1-羧基-1-(2，2-二苯基 NmbcN-(N-(3，3-二苯丙基) Nnbhe乙基氨基)环丙烷 氨甲酰甲基)甘氨酸可以使用交联剂以稳定3D构象，使用诸如具有(CH2)n(n＝1-6)间隔基团的双功能亚氨酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯等同型双功能交联剂，其通常包含氨基反应活性部分(诸如N-羟基琥珀酰亚胺)和其它基团特异的反应活性部分(诸如马来酰亚胺基或二硫部分(SH)或碳二亚胺(COOH))的异型双功能试剂。另外，通过例如掺入Cα和Nα-甲基氨基酸、在氨基酸的Cα和Cβ原子间导入双键、和通过导入共价键(诸如在N和C末端之间、在两条侧链之间、或者在侧链与N或C末端之间形成酰胺键)形成环肽或类似物，可以对肽产生构象限制。
如上所述，如果对个体施用HBsAg变体分子，或作为诊断性试剂使用，这些类型的修饰可能对稳定HBsAg变体分子是重要的。
本发明构思的其它衍生物包括由完全未糖基化的分子到经修饰的糖基化分子的糖基化变体的全部范围。改变的糖基化模式可能由重组分子在不同宿主细胞中的表达产生。
本发明的另一个方面延伸到HBsAg变体分子或其重组体、衍生物、或化学形式，或者包含所述HBsAg的HBV的组合物。这种组合物作为治疗性组合物特别有用，此处可以互换的称为生物学疫苗或药学组合物。生物学组合物在诱导针对HBV变体(诸如HBV逃脱突变体)感染的免疫学记忆中特别有用，通过施用HBsAg变体或其重组体、衍生物、或化学形式，或者同样能够诱导免疫应答的HBV(包括免疫学记忆试剂)来控制。
相应的，本发明构思包含HBV变体或其HBsAg、或其重组体或衍生物、或其化学等同物的生物学组合物。
通常，如果使用HBV，首先将其减毒。本发明这一方面的生物学组合物通常还包含一种或多种制药学可接受的载体和/或稀释剂。
生物学组合物可以包含HBV变体的HBsAg或类似分子，或者组合物可以是包括参照HBV在内的HBV变体范围内的HBsAg或类似分子的混和物。相似的内容适用于包含HBV的组合物。
适合于注射使用的生物学组合物包括无菌水溶液(当为水溶性时)或用于临时配制无菌注射液的无菌粉剂。它在制造和储存条件下必须是稳定的，而且必须避免微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇、等等)、或其合适混和物、和植物油的溶剂或稀释剂。对微生物作用的预防可以由多种抗细菌和抗真菌剂获得，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在许多情况中，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。注射组合物的延迟吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂获得，例如单硬脂酸铝和明胶。
通过向适当溶剂或稀释剂中掺入需要量的HBsAg或类似分子、或者HBV变体或参照毒株，随后通过诸如过滤除菌进行灭菌，以配制了无菌注射液。对于用于配制无菌注射液的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，可以由先前的过滤除菌液产生免疫相互作用活性分子和任何添加的期望成分的粉剂。本发明构思的施用途径包括静脉内、腹膜内、intrathelial、皮下、和脑内注射。
本发明的生物学组合物还可以以口、颊、鼻喷雾、吸入、贴剂、滴液、或栓剂形式给药。
制药学可接受的载体和/或稀释剂包括任一和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、等等。将这些介质和试剂用于药学活性物质在本领域是众所周知的。除非任何传统介质或试剂与免疫相互作用活性分子不相容，本发明构思将它们用于治疗性组合物。还可以向组合物中掺入添加性活性成分。
以有效诱导针对相同分子或携带相同的或免疫学类似分子的HBV的交互免疫应答的浓度加入HBsAg或类似分子、或者HBV变体或参照毒株。例如，HBsAg的有效量的范围是大约10mg-大约2000ng，或50ng-大约1000mg，或100ng-大约500mg，或其它合适的有效量。有时以相对于体重的剂量表述更方便。相应的，有效量可以是例如大约0.5ng/kg体重-大约500mg/kg体重，或其之间的量。
本发明将由下列非限制性实施例进一步描述。实施例实施例1 HBV的重叠基因组图1中显示了HBV的重叠基因组。编码DNA聚合酶(P)的基因与病毒包膜基因Pre-S1和Pre-S2重叠，并与X和核心(C)基因部分重叠。HBV包膜包含小的、中等、和大的HBV表面抗原。大的蛋白质成分称为HBV表面抗原(HBsAg)，并被S基因序列包含。Pre-S1和Pre-S2基因序列编码其它包膜成分。
实施例2 HBV DNA聚合酶的氨基酸序列图2中显示了来自基因型A-F的HBV DNA聚合酶蛋白质的氨基酸序列。
实施例3 HBsAg的共有序列图3中显示了来自多种HBV毒株、编码表面抗原的核苷酸序列。在核苷酸序列的上面显示了由第108位氨基酸起始的表面抗原的氨基酸序列。
实施例4 HBsAg结合实验使用RIA结合试验评定了Pre-S/S基因逃脱突变对抗HBs抗体结合的影响。结果显示于图4。简而言之，通过蔗糖浓度梯度纯化了由经转染细胞培养物表达的HBsAg突变体。在RIA格式(AUSAB，Abbott)中评定了亚病毒和病毒颗粒阻断野生型HBsAg结合不识别S基因逃脱突变体的抗HBs抗体的能力。此分析涉及合并疫苗血清中抗HBs的结合以增加野生型和突变型S蛋白质的浓度，使用限制血清浓度并通过AUSAB RIA检测未结合的抗HBs。
分析的突变型S蛋白质与模拟物和野生型HBV一起显示于图4的右边。随着HBsAg浓度的下降，未结合抗HBs的量上升，使得AUSAB实验检测到较高的抗HBs浓度。甚至在高浓度的W499Q突变体HBsAg，检测到的残余抗HBs的量与模拟物转染样品(这些结果由图顶部的两条曲线表示)的相似。相反，抗体结合其它突变型HBsAg蛋白质后的残余抗HBs的量与野生型HBsAg相似，说明这些变型vHBsAg蛋白质识别抗HBs的功效与野生型蛋白质相似。
两种突变型S蛋白质(图4V519L和相对于重叠读码框中的聚合酶蛋白质包含V519L＋L526M＋M550V突变的三重突变体)部分结合抗HBsAg。突变型S蛋白质结合HBsAg的功效相对于野生型HbsAg而言已改变。这说明使用抗HBsAg检测携带这些突变的病毒不如野生型病毒那么有效，由此可能逃脱免疫检测。包含这些和/或其它HBsAg突变、部分结合抗HBsAg的乙型肝炎病毒可能也逃脱免疫检测和防护。
图4中的双重突变表示L526M/M550V，三重突变体表示V519L/L526M/M550V。
实施例5通过定点诱变产生的HBV变体表2提供了通过定点诱变产生的一些HBV变体的概述。
实施例6 FCV突变表3提供了通过泛昔洛韦(FCV)诱导的突变的概述。
本领域技术人员将领会，此处描述的发明可以容易的进行所述之外的变化和修饰。应当这样理解，本发明包括所有这些变化和修饰。本发明还个别的或全体的包括此说明书中提及的所有步骤、特征、组合物、和成分，和任何两种或多种所述步骤或特征的任何和所有组合。
表2通过定点诱变产生的HBV变体选择的核苷酸类似物聚合酶突变 相应的表面S突变1.G449E(B结构域) D144E2.W499Q(B结构域) G145R3.F512L(B结构域) A157D4.V519L(B结构域) E164D5.L526M(B结构域) 没有变化6.M550V(C结构域) M195I7.M550V(C结构域) W196L8.M550I(C结构域) S196W9.V553I(C结构域) M198I10.V553I(C结构域)W199S11.S565P S210R双重聚合酶突变 相应的表面S突变12.L526M/M550V M195I13.L526M/M550I S196W三重聚合酶突变 相应的表面S突变14.V519L/L526M/M550V E164D，M195I，W196L15.VS19L/L526M/M550I E164D，S196WHBsAg逃脱突变体相应的HBV聚合酶变化16.K122R(环1“a”决定簇) Q476P17.T126S(环1“a”决定簇) N480G18.T131N(环1“a”决定簇) N485K19.K141E(环2“a”决定簇) K495R20.G145K(环2“a”决定簇) R499Q21.R160N I515L
表3
*仅在BMT患者中对FCV检测。
参照文献1.Tiollais等人，自然(Nature)317489-495，1985。2.Gerlich等人，病毒性肝炎和肝病(Viral Hepatitis and Liver Disease)，F.B.Hollinger等人编，Williams-WiIkens，BaItimore，MD，121-134，1991。3.Carman等人，肠胃病学(Gastroenterology)102711-719，1992。4.Carman等人，柳叶刀(Lancet)336325-329，1990。5.Okamoto等人，小儿科研究(Paediatric Research)32264-268，1992。6.McMahon等人，肝病学(Hepatology)15757-766，1992。7.Fujii等人，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1841152-1157，1992。8.Harrison等人，肝病学杂志(J.Hepatol.)135105-5107，1991.9.Norder等人，普通病毒学杂志(J Gen.Virol.)741341-1348，1993。10.Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443-453，1970。11.Marmur和Doty，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)5109，1962。12.Bonner和Laskey，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)4683，1974。
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒(HBV)变体，其包含一种显示相对于参照HBV而言改变的免疫学特性的表面成分。
2.权利要求1的HBV变体，其中变体上的表面成分是一种表面抗原，其相对于所述参照HBV的表面抗原而言包含单个或多个氨基酸替换、添加和/或删除或者截短，其中针对参照HBV的参照表面抗原产生的抗体显示出中和所述HBV变体的能力降低。
3.权利要求2的HBV变体，其中变体上的表面抗原相对于下面的氨基酸序列而言包含氨基酸替换、添加和/或删除或者截短MX1X2X3X4SGX5LX6PLX7VLQAX8X9FX10LTX11IX12X13IPX14SLX15SWWTSLNFLGX16X17X18X19CX20GX21NX22QSX23X24SX25HX26PX27X28CPPX29CX30GYRWMCLX31RFIIFLX32lLLLCLIFLLVLLDX33QGMLX34VCPLX35PX36X37X38TTSX39X40X41CX42TCX43X44X45X46QGX47SX48X49PX50X51CCX52KPX53X54GNCTCIPIPSX55WAX56X57X58X59LWEX60X61SX62RX63SWLX64LLX65X66FVQX67X68X69X70LX71PX72VWX73X74X75IWX76X77WX78WX79PX80X81X82X83IX84X85PFX86PLLPIFX87X88LX89X90X91I[式I]；其中X1是E或G或D；X2是N或S或K；X3是I或T；X4是T或A；X5是F或L；X6是G或R；X7是L或R；X8是G或V；X9是F或C；X10是L或S或W；X11是R或K；X12是L或RX13是T或K；X14是Q或K；X15是D或H；X16是G或E或A；X17是S或A或V或T或L；X18是P或T；X19是V或R或T或K或G；X20是L或P；X21是Q或L或K；X22是S或L；X23是P或Q；X24是T或I；X25是N或S；X26是S或L；X27是T或I；X28是S或C；X29是I或T；X30是P或A；X31是R或Q；X32是F或C；X33是Y或C；X34是P或H或S；X35是I或L；X36是G或R；X37是S或T；X38是T或S；X39是T或V或A；X40是G或E或Q；X41是P或A或S；X42是K或R；X43是T或M；X44是T或I或S或A；X45是P或T或A或I或L；X46是A或V；X47是N或T；X48是M或K或L；X49是F或Y或I；X50是S或Y；X51是C或S；X52是T或I或S；X53是T或S；X54是D或A；X55是S或T；X56是F或L；X57是A或G或V；X58是K或R或T；X59是Y或F；X60是W或G；X61是A或G；X62是V或A；X63是F或L；X64是S或N；X65是V或A；X66是P或Q；X67是W或C或S；X68是F或C；X69是V或D或A；X70是G或E；X71是S或F；X72是T或I；X73是L或P；X74是S或L；X75是A或V；X76是M或I；X77是M或I；X78是Y或F；X79是G或E；X80是S或N或K；X81是L或Q；X82是Y或F或H或C；X83是S或G或N或D或T；X84是V或L；X85是S或N；X86是I或M或L；X87是F或C；X88是C或Y；X89是W或R；X90是V或A；且X91是Y或I或S；且其中选择HBV变体是通过HBV DNA聚合酶的核苷酸类似物。
4.权利要求2的HBV变体，其中变体上的表面抗原相对于下面的氨基酸序列而言包含氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短MX1X2X3X4SGX5LX6PLX7VLQAX8X9FX10LTX11IX12X13IPX14SLX15SWWTSLNFLGX16X17X18X19CX20GX21NX22QSX23X24SX25HX26PX27X28CPPX29CX30GYRWMCLX31RFIIFLX32ILLLCLIFLLVLLDX33QGMLX34VCPLX35PX36X37X38TTSX39X40X41CX42TCX43X44X45X46QGX47SX48X49PX50X51CCX52KPX53X54GNCTCIPIPSX55WAX56X57X58X59LWEX60X61SX62RX63SWLX64LLX65X66FVQX67X68X69X70LX71PX72VWX73X74X75IWX76X77WX78WX79PX80X81X82X83IX84X85PFX86PLLPIFX87X88LX89X90X91I[式I]；其中X1是E或G或D；X2是N或S或K；X3是I或T；X4是T或A；X5是F或L；X6是G或R；X7是L或R；X8是G或V；X9是F或C；X10是L或S或W；X11是R或K；X12是L或R；Xl3是T或K；X14是Q或K；X15是D或H；X16是G或E或A；X17是S或A或V或T或L；X18是P或T；X19是V或R或T或K或G；X20是L或P；X21是Q或L或K；X22是S或L；X23是P或Q；X24是T或I；X25是N或S；X26是S或L；X27是T或I；X28是S或C；X29是I或T；X30是P或A；X31是R或Q；X32是F或C；X33是Y或C；X34是P或H或S；X35是I或L；X36是G或R；X37是S或T；X38是T或S；X39是T或V或A；X40是G或E或Q；X41是P或A或S；X42是K或R；X43是T或M；X44是T或I或S或A；X45是P或T或A或I或L；X46是A或V；X47是N或T；X48是M或K或L；X49是F或Y或I；X50是S或Y；X51是C或S；X52是T或I或S；X53是T或S；X54是D或A；X55是S或T；X56是F或L；X57是A或G或V；X58是K或R或T；X59是Y或F；X60是W或G；X61是A或G；X62是V或A；X63是F或L；X64是S或N；X65是V或A；X66是P或Q；X67是W或C或S；X68是F或C；X69是V或D或A；X70是G或E；X71是S或F；X72是T或I；X73是L或P；X74是S或L；X75是A或V；X76是M或I；X77是M或I；X78是Y或F；X79是G或E；X80是S或N或K；X81是L或Q；X82是Y或F或H或C；X83是S或G或N或D或T；X84是V或L；X85是S或N；X86是I或M或L；X87是F或C；X88是C或Y；X89是W或R；X90是V或A；且X91是Y或I或S；且其中选择HBV变体用于其后的针对式I定义的表面抗原的免疫学治疗。
5.权利要求1的HBV变体，其包含具有下面式III所示核苷酸序列的单个或多个核苷酸替换、添加、和/或删除或者截短的核苷酸序列ACN1AAACCTN2N3GGAN4GGAAAN5TGCACN6TGTATTCCCATCCCATCN7TCN8TGGGCTTTCGN9AAN10ATN11CCTATGGGAGN12GGGCCTCAGN13CCGTTTCTCN14TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGN15AGGGCTTTCCCCCACTGTN16TGGCTTTCAGN17TATATGGATGATGTGGTN18TTGGGGGCCAAGTCTGTACAN19CATCN20TGAGTCCCTTTN21TN22CCN23CTN24TTACCAATTTTCTTN25TGTCTN26TGGGN27ATACATT[式III]；其中N1是A或C；N2是T或A；N3是C或T；N4是C或T；N5是C或T；N6是C或T；N7是A或G；N8是T或C；N9是C或G；N10是G或A；N11是T或A；N12是T或G；N13是T或C；N14是C或T；N15是T或C；N16是T或C；N17是T或C；N18是A或T；N19是A或G；N20是T或G；N21是A或T；N22是A或G；N23是T或G；N24是A或G；N25是T或C；N26是T或C；且N27是T或C；且其中HBV变体具有的一种表面抗原相对于式I定义的表面抗原而言显示改变的免疫学特性。
6.一种分离的乙型肝炎病毒表面抗原变体(HBsAg)或其重组体或衍生物、或其化学等同物，其中所述HBsAg或其重组体或衍生物、或其化学等同物相对于参照HBV的HBsAg而言显示改变的免疫学特性。
7.权利要求6的分离的HBsAg变体、或其重组体或衍生物、或其化学等同物，其中HBsAg变体包含具有下面所示氨基酸序列的单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短的氨基酸序列MX1X2X3X4SGX5LX6PLX7VLQAX8X9FX10LTX11IX12X13IPX14SLX15SWWTSLNFLGX16X17X18X19CX20GX21NX22QSX23X24SX25HX26PX27X28CPPX29CX30GYRWMCLX31RFIIFLX32ILLLCLIFLLVLLDX33QGMLX34VCPLX35PX36X37X38TTSX39X40X41CX42TCX43X44X45X46QGX47SX48X49PX50X51CCX52KPX53X54GNCTCIPIPSX55WAX56X57X58X59LWEX60X61SX62RX63SWLX64LLX65X66FVQX67X68X69X70LX71PX72VWX73X74X75IWX76X77WX78WX79PX80X81X82X83IX84X85PFX86PLLPIFX87X88LX89X90X91I[式I]；其中X1是E或G或D；X2是N或S或K；X3是I或T；X4是T或A；X5是F或L；X6是G或R；X7是L或R；X8是G或V；X9是F或C；X10是L或S或W；X11是R或K；X12是L或R；X13是T或K；X14是Q或K；X15是D或H；X16是G或E或A；X17是S或A或V或T或L；X18是P或T；X19是V或R或T或K或G；X20是L或P；X21是Q或L或K；X22是S或L；X23是P或Q；X24是T或I；X25是N或S；X26是S或L；X27是T或I；X28是S或C；X29是I或T；X30是P或A；X31是R或Q；X32是F或C；X33是Y或C；X34是P或H或S；X35是I或L；X36是G或R；X37是S或T；X38是T或S；X39是T或V或A；X40是G或E或Q；X41是P或A或S；X42是K或R；X43是T或M；X44是T或I或S或A；X45是P或T或A或I或L；X46是A或V；X47是N或T；X48是M或K或L；X49是F或Y或I；X50是S或Y；X51是C或S；X52是T或I或S；X53是T或S；X54是D或A；X55是S或T；X56是F或L；X57是A或G或V；X58是K或R或T；X59是Y或F；X60是W或G；X61是A或G；X62是V或A；X63是F或L；X64是S或N；X65是V或A；X66是P或Q；X67是W或C或S；X68是F或C；X69是V或D或A；X70是G或E；X71是S或F；X72是T或I；X73是L或P；X74是S或L；X75是A或V；X76是M或I；X77是M或I；X78是Y或F；X79是G或E；X80是S或N或K；X81是L或Q；X82是Y或F或H或C；X83是S或G或N或D或T；X84是V或L；X85是S或N；X86是I或M或L；X87是F或C；X88是C或Y；X89是W或R；X90是V或A；且X91是Y或I或S；其中针对参照HBV的中和抗体显示中和携带所述HbsAg变体的HBV的活性降低或消失。
8.权利要求7的分离的HBsAg变体，其由相对于下面的核苷酸序列具有单个或多个核苷酸替换、添加、和/或删除或者截短的核苷酸序列编码ACN1AAACCTN2N3GGAN4GGAAAN5TGCACN6TGTATTCCCATCCCATCN7TCN8TGGGCTTTCGN9AAN10ATN11CCTATGGGAGN12GGGCCTCAGN13CCGTTTCTCN14TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGN15AGGGCTTTCCCCCACTGTN16TGGCTTTCAGN17TATATGGATGATGTGGTN18TTGGGGGCCAAGTCTGTACAN19CATCN20TGAGTCCCTTTN21TN22CCN23CTN24TTACCAATTTTCTTN25TGTCTN26TGGGN27ATACATT[式III]；其中N1是A或C；N2是T或A；N3是C或T；N4是C或T；N5是C或T；N6是C或T；N7是A或G；N8是T或C；N9是C或G；N10是G或A；N11是T或A；N12是T或G；N13是T或C；N14是C或T；N15是T或C；N16是T或C；N17是T或C；N18是A或T；N19是A或G；N20是T或G；N21是A或T；N22是A或G；N23是T或G；N24是A或G；N25是T或C；N26是T或C；且N27是T或C。
9.一种HBV变体或所述HBV变体的分离的BsAg，其中所述BV变体包含一种HBsAg，所述HBsAg相对于参照HBV上的HbsAg而言包含单个或多个氨基酸替换、添加、和/或删除或者截短，且其中BsAg变体定义为对下面定义的HBV DNA聚合酶的催化区之单个或多个氨基酸替换、添加、和/或截短SZ1LSWLSLDVSAAFYHZ2PLHPAAMPHLLZ3GSSGLZ4RYVARLSSZ5SZ6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZ11LHZ12Z13CSRZ14LYVSLZ15LLYZ16TZ17GZ18KLHLZ19Z20HPIZ21LGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z31FZ32YMDDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37HZ38EZ39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46LLZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLNFMGYZ50IG[式II]；其中X是任何氨基酸；Z1是N或D；Z2是I或P；Z3是I或V；Z4是S或D；Z5是T或N；Z6是R或N；Z7是N或I；Z8是N或Y或H；Z9是H或Y；Z10是G或R；Z11是D或N；Z12是D或N；Z13是S或Y；Z14是N或Q；Z15是L或M；Z16是K或Q；Z17是Y或F；Z18是R或W；Z19是Y或L；Z20是S或A；Z21是I或V；Z22是I或L；Z23是V或G；Z24是C或L；Z25是A或S；Z26是V或M；Z27是V或T；Z28是R或C；Z29是F或P；Z30是L或V；Z31是A或V；Z32是S或A；Z33是V或L或M；Z34是K或R；Z35是S或T；Z36是V或G；Z37是Q或E；Z38是L或S或R；Z39是S或F；Z40是F或Y；Z41是T或A；Z42是A或S；Z43是V或I；Z44是T或C；Z45是N或S；Z46是F或V；Z47是S或D；Z48是L或V；Z49是N或Q；Z50是V或I；且M*是第550位氨基酸。
10.一种包含选自下述突变的HBV变体或来自所述HBV变体的HBsAg变体G112R、T123P、Y/F134S、D144E、G145R、A157D、E164D、F170L、M195I、W196L、S196W、W196STOP、M198I、W199S、S204T、和S210R，其中STOP表示终止密码子。
11.一种包含选自下述突变的HBV变体或来自所述HBV变体的HBsAg变体D144E、G145R、A157D、E164D、M195I、W196L、S196W、W196STOP、M198I、W199S、和S210R，其中STOP表示终止密码子。
12.一种包含选自下述突变的HBV变体或来自所述HBV变体的HBsAg变体Q476、N480G、N485K、K495R、R499O、G499E、W499Q、F512L、I515L、V519L、L526M、M550V、M550I、V553I、和S565P。
13.一种包含权利要求1-12任一项的HBV变体或HBsAg变体、或其重组体或衍生物、或其化学等同物的组合物。
14.权利要求13的组合物，还包含一种或多种制药学可接受的载体和/或稀释剂。
15.一种治疗或预防HBV感染的方法，该方法包括对受试者施用一定量的权利要求1-12任一项的HBV变体或HBsAg变体，或者权利要求13或14的组合物，所述量能够有效诱导针对所述HBV变体的免疫应答。
16.HBV变体或来自所述HBV变体的HBsAg在制备用于治疗或预防所述HBV变体感染的药物中的用途。
17.HBV变体或来自所述HBV变体的HBsAg在筛选可用于治疗或预防所述HBV变体感染的药剂中的用途。
全文摘要
本发明主要涉及带有一种表面成分的分离HBV,所述表面成分显示相对于参照乙型肝炎病毒(HBV)改变的免疫学特性。此处认为参照HBV包含来自HBV基因型A－F的合成的或共有的核苷酸或氨基酸序列。此处认为本发明的分离HBV是相对于参照HBV的HBV变体。改变的免疫学特性使得本发明的HBV变体对针对表面成分的疫苗较不敏感。本发明的HBV变体通常来自抗HBV化疗(特别是针对破坏HBV聚合酶活性或功能的化疗)中的选择压力,和/或针对表面成分的免疫压力。免疫压力可能由HBV的天然暴露或者接种无毒或减毒HBV或HBV成分引起。本发明还提供了对应于HBV变体表面成分的重组多肽及其衍生物和化学等同物。本发明的HBV变体和重组多肽及其衍生物和化学等同物可用于能够诱导针对HBV变体的中和免疫应答的生物学组合物。
文档编号A61K39/00GK1330712SQ99814393
公开日2002年1月9日 申请日期1999年11月10日 优先权日1998年11月11日
发明者S·A·罗卡倪尼, J·托瑞斯, L·厄厄斯特－斯尔维拉, A·I·巴斯罗米兹 申请人:墨尔本保健公司