专利名称：自生物学样品中分离rna和dna的制作方法
技术领域：
本发明一般性涉及分子生物学领域。在某些特定的实施方式中，本 发明提供了与核酸分离相关的装置、试剂盒和方法。
背景技术：
分离核酸常常是大多数分子生物学研究的第一个步骤，所述研究包 括PCR、基因克隆、测序、Southern印迹、Northern印迹、核酸酶保护 分析、RT-PCR、 RNA图谱、体外翻译、体外转录、包括转录/扩增反应 和cDNA文库构建。获得适合于分析的高质量的完整核酸因此常常是后 续分析的有用的和所需的起点。虽然已经描述了各种用于从样品中分离 出核酸的技术(见例如美国专利No.5,075，430、 5，234，809、 5,155,018、 6,277,648、 6,958,392、 6,953,686、 6,310,199、 6,992,182、 6,475,388、 5,075,430、 7,074,916;美国专利申请No. 20060024701;欧洲专利No. EP0765335; Boometal. 1990， C7/wca/M croWo/ogy28:495)。多个这些 先前所述的方法都依靠氯化铯密度梯度离心或苯酚提取，两种技术都有 着明显的缺点，包括费时、暴露于危险化学物以及外源核酸或非所需蛋 白污染样品的高度危险性。其他方法依靠基于硅酸盐的固相支持物，但 是没有提供既分离DNA又分离RNA的方法。因此，提供一种快速的、
容易实施的、经济的和高产量的从样品中分离出核酸的方法是有益的。
如果方法能使得对样品的所需操作最简化、容许使用主要是液体的操作 步骤以及可以利用单一装置例如过滤装置实施所述方法，那么该方法也 是有用的。能够利用单一装置例如包含两个膜的装置和单一方法既分离
DNA又分离RNA是有益的，其中所述单一方法比先前所述的核酸纯化 方案包括更少的步骤。在此所述的本发明的各种实施方式符合这些和其 他的需要。
发明内容
在某些实施方式中，本发明提供了一种从生物学样品中分离出第一 种核酸和第二种核酸的方法，包括将生物学样品与第一个多孔材料例如 膜以及第二个多孔材料例如膜相接触，使得第一种核酸与第一个多孔材 料结合，而第二种核酸与第二个多孔材料结合。在每个接触步骤之后， 可以用一种或多种合适的缓冲液洗涤第一个和第二个多孔材料。通过将 各个多孔材料和合适洗脱缓冲液相接触可以分别从第一个和第二个多孔 材料中洗脱下第一种和第二种核酸。
在其他实施方式中，本发明提供了从细胞样品中分离出DNA和 RNA的方法，包括a)用裂解缓冲液裂解细胞样品，以获得细胞裂解物； b)任选地例如通过离心澄清细胞裂解物；c)将裂解物与第一个多孔材料 接触，使得RNA与第一个多孔材料结合；以及将裂解物或第一个多孔 材料的过滤液与第二个多孔材料接触，使得DNA与第二个多孔材料结 合，据此从细胞样品中分离出DNA和RNA。第一个多孔材料可以具有 比第二个多孔材料的标定孔径更小的标定孔径。方法可以包括用一种或 多种合适的缓冲液洗涤第一个和第二个多孔材料。通过将各个多孔材料 与合适洗脱缓冲液相接触可以分别从第一个和第二个多孔材料中洗脱下 RNA和DNA。
仍在其他实施方式中，本发明提供了从细胞样品中分离出基因组 DNA和细胞RNA的方法，包括a)用裂解缓冲液裂解细胞样品，以获得
细胞裂解物；b)任选地例如通过离心澄清细胞裂解物，以获得澄清的上 清液；c)将裂解物与第一个膜例如多糖膜接触，使得RNA与第一个膜结 合；以及d)将裂解物或第一个膜的过滤液与第二个膜例如硅酸盐膜接 触，使得DNA与第二个膜结合，据此从细胞样品中分离出DNA和 RNA。方法可以包括用一种或多种合适的缓冲液洗涤第一个和第二个多 孔材料。通过将各个多孔材料与合适的洗脱缓冲液相接触可以分别从第 一个和第二个多孔材料中洗脱下RNA和DNA。
在进一步的实施方式中，本发明提供了从真核细胞样品中分离出基 因组DNA和细胞RNA的方法，包括a)用裂解缓冲液裂解细胞样品，以 获得细胞裂解物；b)将裂解物与第一个膜例如多糖膜接触，使得RNA 与第一个膜结合；以及c)将裂解物或第一个膜的过滤液与第二个膜例如 硅酸盐膜接触，使得DNA与第二个膜结合，据此从细胞样品中分离出 基因组DNA和RNA。方法可以包括用一种或多种合适的缓冲液洗涤第 一个和第二个多孔材料。通过将各个多孔材料与合适洗脱缓冲液相接触 可以分别从第一个和第二个多孔材料中洗脱下RNA和DNA。
仍在进一步的实施方式中，本发明提供了从原核细胞样品中分离出 基因组DNA和细胞RNA的方法，包括a)用裂解缓冲液裂解细胞样品， 以获得细胞裂解物；b)任选地例如通过离心澄清细胞裂解物，以获得澄 清的上清液；c)将裂解物与第一个膜例如多糖膜接触，使得RNA与第一 个膜结合；以及d)将裂解物或第一个膜的过滤液与第二个膜例如硅酸盐 膜接触，使得DNA与第二个膜结合，据此从细胞样品中分离出基因组 DNA和RNA。方法可以包括用一种或多种合适的缓冲液洗涤第一个和 第二个多孔材料。通过将各个多孔材料与合适的洗脱缓冲液相接触可以 分别从第一个和第二个多孔材料中洗脱下RNA和DNA。
在特定的其他实施方式中，本发明提供了包含硅酸盐膜和多糖膜例 如混合纤维素酯(MCE)膜的过滤装置，其适合于从生物学样品中分离出 第一种核酸和第二种核酸。第一种核酸种类可以是与多糖膜例如纤维素
膜结合的RNA，以及第二种种类可以是DNA例如基因组DNA,其与 硅酸盐膜例如玻璃纤维膜结合。
仍在其它的实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中分离出核 酸的试剂盒，包括a)第一个多孔材料例如包含多糖的膜、b)第二个多孔 材料例如包含硅酸盐的膜、c)任选地一种或多种洗涤缓冲液和d)至少一 个容器。
仍在其他实施方式中，本发明提供了用于从细胞样品中分离出 RNA的试剂盒，包括a)混合纤维素酯膜；b)—种或多种非酸性洗涤缓冲 液、和c)一个或多个容器。
图la和lb显示了本发明的过滤装置的一个实例，它由微分隔装置 组成。
图2显示了本发明的过滤装置的一个实例。
图3a和3b显示了本发明的适合于接收多个样品或大体积样品的多 孔格式的过滤装置的实例。
图4显示了本发明的适合于接收多个样品或大体积样品的多孔格式 的过滤装置的另一个实例。
图5显示了本发明的单样品形式的过滤装置。
图6a显示了本发明的封闭形式的过滤装置有通气口的和没有通 气口的。
图6b显示了本发明的叠放形式的过滤装置。
图7显示了具有本发明的封闭的、有通气口的形式的过滤装置的可 控的、自动化的系统。
图8是描述本发明的一个用于分离RNA和基因组DNA的实施方式 的流程图。
图9a和9b是显示从原核细胞样品中分离出基因组DNA和16S和 23S RNA的琼脂糖凝胶的照片。
图10a和10b是显示利用两个叠放的包含混合纤维素酯膜或玻璃纤 维膜的96孔板从真核细胞样品中分离出基因组DNA和16S和23S RNA 的琼脂糖凝胶的照片。
图lla和llb是显示从真核细胞样品中分离出基因组DNA和18S和 28S RNA的琼脂糖凝胶的照片。
图12a和12b是显示利用根据本发明的一个实施方式从真核细胞(12a) 和原核细胞(12b)中获得的RNA的rtPCR产物的琼脂糖凝胶的照片。
图13是显示与商业上可得到的RNA纯化柱相比较，根据本发明的 实施方式所分离到的RNA的纯度的琼脂糖凝胶的照片。
具体实施例方式
分离核酸的方法
在一些实施方式中，本发明提供了从样品中分离出一种或多种核酸 的方法，这是一种快速的、容易实施的并且只需要最小的样品处理次数 的方法。本发明所提供的优点是可以接收细胞裂解物形式的细胞例如原 核或真核细胞的输入物，并排出多个作为产物的靶分子。可以在裂解物 与本发明的多孔材料接触之前制备出细胞裂解物。因此，本发明提供了 从细胞提取物中既分离DNA也分离RNA的单一方法。
本发明是容易实施的，其中它需要很少的步骤和很少的试剂。所述 试剂比先前所述方法中所用的试剂有着更小的毒性，且所述方法产生基 本上纯化的产物，包括DNA例如基因组DNA和RNA例如细胞RNA， 包括mRNA、 rRNA和tRNA。"基本上纯化的"在此表示产物基本上不 含有其他的生物化学物质，例如至少是60%纯化的、至少是70%纯化的、 至少是80%纯化的、至少是90%纯化的、至少是95%纯化的。可通过例如琼脂糖电泳分离的核酸例如分离的DNA或分离的RNA的一部分 可以确定出基本纯度。利用已知的方法例如利用包含分光光度仪的读胶 仪可以确定出条带的强度。
所述容易实施的方法可以包括裂解细胞样品。利用本领域已知的任 何裂解缓冲液都可以实施细胞的裂解。合适的裂解缓冲液可以包含离液 剂例如胍盐，如硫氰酸胍。裂解缓冲液可以包含螯合剂例如EDTA和缓 冲盐例如Tris-HCl。在具体实施方式
中，裂解缓冲液具有非酸性的pH 值，例如中性或碱性。
在裂解之后，可以澄清样品，例如通过离心去除细胞碎片和沉淀 物，以便得到细胞的澄清的裂解物。方法可以包括将多个多孔材料例如 多个膜与上清液接触。在具体实施方式
中，细胞裂解物首先与多糖膜例 如混合纤维素酯膜或硝酸纤维素膜接触，随后与硅酸盐膜例如玻璃纤维 素膜接触。膜可以彼此上下叠放。例如，多糖膜可以被叠放于硅酸盐膜 的上方，使得裂解物首先与多糖膜接触。方法因此容许技术人员在将细 胞RNA与细胞DNA进行分离的过程中只实施一个步骤，例如将纤维素 膜与上清液接触，并施加重力或外部施加的力，使其随后接触硅酸盐 膜。当膜是叠放的时，需要从相应的膜中洗脱下DNA和RNA产物，在 洗脱产物之前可以便利地分开膜。或者，膜可以顺序设置，使得细胞裂 解物首先被施加于多糖膜，且所述膜的过滤液紧接着被施加于硅酸盐 膜。 一旦多个膜都已经与细胞裂解物接触，可以对膜进行一次或多次洗 涤。在需要高产量的特定实施方式中， 一个或多个相应的膜的过滤液可 以在第一个和第二个膜上重复循环一次或多次。
在本发明的方法中所用的合适的洗漆缓冲液可以包括非酸性的缓冲 液例如具有中性或碱性pH值的缓冲液。在具体实施方式
中，可以使用 两种不同的洗涤缓冲液，例如第一种和第二种洗涤缓冲液。可以在第二 种洗涤缓冲液之前给膜施加第一种洗涤缓冲液，所述第一种洗涤缓冲液 可以包含离液剂例如胍盐例如硫氰酸胍。第一种洗涤缓冲液可以在其已
经与第一个膜接触之后接触样品(细胞裂解物)。第一个洗涤缓冲液还可
以包括螯合剂例如EDTA和缓冲盐例如Tris-HCl以及醇例如乙醇。第二 种洗涤缓冲液可以包含醇例如乙醇和缓冲盐例如Tris-HCl。
在洗涤膜之后，用任何合适的洗脱缓冲液例如水、Tris-EDTA缓冲 液(TE)洗脱出终产物。用于洗脱RNA产物的合适的缓冲液可以包含无 RNA酶的缓冲液例如无RNA酶水。
分离的产物可以适用于进一步的处理，例如PCR包括RT-PCR、转 录介导的扩增、转染、测序等。靶核酸的分离可以被用于多个下游的分 析应用，包括例如鉴定出相关的致病性或非致病性的生物体例如细菌。 当靶核酸是RNA时，本发明提供了分离RNA的方法，所述方法不需要 使用DNA酶，或者，需要使用比先前的方法例如Qiagen柱(Qiagen, Inc., Valencia, CA)所需的DNA酶更少的DNA酶，因此节约了时间和试剂费 用。
在本发明的实施方式中，其中当样品被施加于一个或多个膜时，可 以在样品已经与膜接触之后给膜施加外力，以促进细胞裂解物流经膜并 在膜上分离出靶核酸。在一些实施方式中，可以通过重力或者通过例如 经设备底部的出口而连接于过滤装置的真空装置提供力。当外力是真空 时，真空可以提供20-800毫巴的压力差。在其它实施方式中，可以通过 提高来自过滤装置顶部的正压提供力，例如当设备具有圆筒(cylinder)或 注射器时，所述正压是通过活塞或组件的运动而提供的。仍在其它实施 方式中，力可以是通过将装置放置于离心机中所被施加的离心力。可以 使用范围从lxg到15，000xg的离心力。
在特定的实施方式中，可以将核酸从第一个或第二个膜中洗脱到第 三个膜上。第三个膜可以包含捕获探针，例如靶核酸的特异的结合伴 侣，作为靶核酸和靶探针之间的特异的化学相互作用，靶核酸被优先地 滞留于第三个膜上。捕获探针可以与靶核酸共价地或非共价地相互作 用。相互作用可以包含电荷-电荷相互作用、氢键、疏水性相互作用、范
德华力和偶极-偶极相互作用。捕获探针的实例包括与相关的具体核酸序 列互补的寡核苷酸、以及肽、蛋白和结合核酸的小分子。例如，能特异
地结合16s RNA的抗生素例如伊短菌素可以与膜结合。捕获探针的另一 个实例可以包括适合于捕获polyA RNA例如mRNA的寡dT探针。用已 知的配体例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素或中性抗生物素蛋白 (neutravidin)可以对膜进行衍生化。可以给膜添加生物素化的捕获探针， 以便赋予其对靶核酸序列的特异性。
在特定实施方式中，本发明提供了用于从样品中分离出核酸的自动 化系统。因此，任一步骤或者所有步骤都可以被自动化，包括给过滤装 置加样、裂解样品、洗涤样品、洗脱样品。自动化系统可以包含被设计 程序以实施在此所述方法的每个步骤的计算机例如个人计算机。本发明 也包括以多联模式(multiplex format)处理多个样品。
图7显示了自动化设备的一个实例。在特定的实施方式中，本发明 提供了用于从样品中分离出核酸的自动化系统，包括a)适合于从样品中 分离出核酸的过滤装置(74); b)泵(75); c)程序逻辑控制器(PLC)(76); d) 至少一个适合于容纳样品的容器(71); e)任选地， 一个或多个适合于容 纳一种或多种试剂或缓冲液的容器(71); f)任选地， 一个或多个适合于接 收来自过滤装置的过滤液、来自过滤装置的洗脱液和/或来自过滤装置的 废液的接收器(77); g)多个夹闭阀(72); h)管路(73)和i)任选地，位于注 射器桶容器中的注射器筒(79)，其被用于将来自管路的一种或多种液体 添加给过滤装置(74)。提供止回阀(78)，以便容许给过滤装置施加和/或 去除液体。
因此，可以设置本发明的自动化系统，使得包括试剂缓冲液、样品 等的液体从不与任何活动部分例如泵的活动部分接触。通过使用夹闭阀 可以实现这一点，其不需要与流经系统的液体接触。本系统所用的管路 和过滤装置可以适合于一步式使用，因此可以是一次性的。 一次性管路 和夹闭阀的组合提供了几乎不需要维护的系统，例如运行期间不需进行
清洗。此外，因为管路和过滤装置只用一次，因此消除了或最小化了样 品污染的危险。当样品包含核酸以及对核酸的下游检测依赖于扩增方案
例如PCR或TMA时，这是特别有用的。虽然扩增方案提供了出众的敏 感性，但是这也显著地增加了扩增污染核酸而不是靶核酸的危险。当与 更为传统的由可重复使用的(通常是金属的)部分组成的色谱系统(其中流 经系统的液体与泵的活动部分相接触)相比较时，在此所述的自动化系统 最小化或消除了这种危险，并提供了用于进行核酸分离的廉价系统。
利用一种或多种扩增技术例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合 酶链反应(rtPCR)、实时PCR和转录介导扩增(TMA)可以实现对来自过 滤液的分离核酸的检测。利用凝胶电泳和合适的染料例如化学发光剂、 荧光试剂可以实现对核酸的检测。
过滤装置
本发明可使用各种形式的过滤装置。滤器可以是单个手动装置或者 它可以是自动化系统的一部分。根据样品和靶分析物的性质可以决定出 滤器的大小和数目。在一些实施方式中，过滤装置可以由孤立单位例如 滤筒组成。滤筒可以包括滤筒壳，例如含有多个膜的中空体以及一个或 多个入口和一个或多个出口 。入口和出口的大小可以被设计成与标准注 射器相适合，或者可以被设计成适应于真空源或正压源。滤筒大小可以 被设计成适合于离心机。过滤装置可以由柱组成，其包括在其内依次设 置的多个滤器，使得施加于柱顶部的样品可以按特定的次序与柱内的多 个多孔膜接触。例如，第一个接触的膜的标定孔径可以大于随后接触的 膜的标定孔径。另一个实例是，过滤装置可以包括一个或多个注射器 筒，其被用于给装置施加压力或真空。滤筒还可以包括用于收集流出的 滤液的滤液杯。
过滤装置可以是多联的，例如由多孔板组成，其中至少一个孔是由 过滤装置组成，所述过滤装置包括依次设置的多个膜，使得施加于滤器
的样品可以先接触第一个膜，随后再接触一个或多个后继的膜，其中第 一个膜的标定孔径小于随后的膜的标定孔径。用在此所述的过滤装置设 置多孔板中的所有孔也是可以的。合适的多孔板包含由多个孔组成的
板，例如6孔、12孔、48孔、96孔、384孔或更多孔。多孔板可以彼此 上下叠放或者可以被次序或分开地使用。当在叠放构型中使用时，叠放 的构型可以被去组装，使得可以从每个相应的膜中洗脱下耙DNA和耙 RNA。另外，由单孔板组成的本发明的过滤装置也是可以的。
在一些实施方式中，可以提供用于接收流出物和废物的板，例如引 流板。引流板可以包含单个孔或多个孔，取决于具体的分析物和样品来 源以及是否有必要对流出物进行后续分析。至少其中一个板可以包含一 个或多个适合于向过滤装置中递送样品或缓冲液的入口。至少其中一个 板可以包含促进排出流出物和废物的出口 。出口大小可以被设计成适合 于与真空源连接。多孔板的大小可以被设计成适合于离心机。
在一个具体的实施方式中，过滤装置可以包含混合纤维素酯(MCE) 膜，例如它的标定孔径为0.45微米，所述膜覆盖于标定孔径为0.7微米 的APFF玻璃纤维膜(Millipore Corp， Billerica， MA)上。在MCE禾卩APFF 膜之间可以存在有间隙，因此促进了 DNA和RNA的分离。或者，每个 膜都可以有它们自己的外壳或滤筒，使得混合纤维素酯膜被叠放到 APFF玻璃纤维膜的上方。在其他实施方式中，本发明提供了覆盖在设 置于合适外壳上的硅酸盐膜上方的多糖膜。例如，覆盖于或叠放于玻璃 纤维素膜上的硝酸纤维素膜是可以的。
当过滤装置被设置成滤筒时，膜的直径可以是13mm。在其他实施 方式中，膜直径的范围可以从lmm到最大为30cm，从lmm到最大为 20cm，从O.lmm到最大为10cm。仍在其他实施方式中，膜直径小于 lmm。仍在其他实施方式中，膜直径大于lmm。在进一步的实施方式 中，膜可以被设置成任何形状，例如膜可以被设置成正方形、长方形、 三角形、椭圆形或不规则形状。膜可以具有范围从l mrr^to30ci^的表
面积。或者，当过滤装置被设置成多孔板时，膜的大小可以被设计成适 合商业可获得的多孔板。合适的多孔板可以具有至少一个由过滤装置构 成的孔，过滤装置包括多个依次设置的多个膜，使得被施加于滤器的样 品首先与第一个膜接触，随后与一个或多个后继的膜接触，例如其中第 一个膜包含多糖而第二个膜包含硅酸盐。
图1显示了由本发明的组件部分组成的一步式可重复使用的过滤装
置的实例。移开样品池盖(l)，向样品池(2)内加入样品，由于重力或者施 加于装置的一些外力造成样品流动，并使得样品与多个多孔膜(4)中的第 一个多孔膜接触。多个多孔膜都可以位于膜支持物(5)之上，所述膜支持 物与滤液杯之间以液体连通，所述滤液杯也可作为洗脱下的靶的的接收 器。也提供了滤液盖(6)。因为装置可以被拆卸且多个多孔膜可以被替 换，因此它适合于重复使用。膜可以分离开用于洗脱和再捕获DNA和 RNAo
图2显示了一步式不可重复使用的本发明的过滤装置的实例。可以 顺序使用所述的单次施加的过滤装置，以便从样品例如细胞裂解物中纯 化出DNA和RNA。
图3a显示了本发明的多孔过滤装置的实例。每个孔都包含多孔膜 (30)。多个板可以彼此上下叠放。每个板包含不同的多孔材料。因此， 在一个实施方式中，包含多糖膜的板可以被叠放于包含硅酸盐膜的板的 上方。可以拆除叠放的板，以便洗脱并再捕获分离的RNA和DNA。
图3b显示了包含本发明的多孔过滤装置的设备的另一个实例。设 备可以包括可拆卸外套(32)，其包含位于外套内的外套垫层(33)以提供有 助于施加真空的密封性。外套(32)衔接一个或多个过滤板(34)，其包含多 个孔，其中至少其中一个孔包含多孔膜。当使用多个叠放的板时，每个
板都包含多孔膜，第一个多孔膜可以是多糖膜例如混合纤维素酯膜或硝 酸纤维素膜，以及第二个多孔膜可以是硅酸盐膜例如玻璃纤维膜。多孔
膜可以彼此相互叠放。在与样品接触之后，可以分开过滤板，以便分开
洗脱和再捕获DNA、 RNA或两者。每个过滤板(34)都可以位于收集板 (35)之上，所述收集板是由多个孔组成的，适合于接收依照本发明的方 法分离的核酸。收集板的孔可以与过滤板的孔彼此一一相对应。收集板 可以位于包含真空歧管的基座(36)之上。
图4显示了本发明的多孔过滤装置的另一个实例。装置可以包含用 于接收样品的漏斗(41)，其与由多个用于接收样品例如大体积样品的孔 组成的可拆卸过滤板接触，其中至少一个孔包含一个或多个多孔膜 (42)。在一些实施方式中，两个多孔板(42)可以彼此叠放。第一个过滤板 可以包含多糖膜以及第二个板可以包含硅酸盐膜。 一个或多个过滤板都 可以位于多孔板例如Ziptip (Millipore Corp.， Billerica， MA)(43)之上。 Ziptip⑧板的孔可以与过滤板的孔一一相对应。Ziptip 可以包含树脂或 其他适合于滞留核酸例如RNA的固相支持物。在具体的实施方式中， 树脂可以包含聚A、聚U、或聚T琼脂糖。Ziptip⑧板可以位于由多个孔 组成的收集板(44)之上。孔可以与Ziptip⑧板的孔一一对应，并且可以含 有TMA试剂例如重构的扩增用试剂以及扩增用寡聚物和重构的酶。收 集板可以位于包含多联真空歧管的基座(45)之上。
图5显示了本发明的单个样品过滤装置的另一个实例。可以顺序使 用两个或多个用于从样品中分离出DNA和RNA的装置，每个装置包含 适合于结合DNA或RNA的树脂例如膜。设备可以包含接收器(51)例如 Microfil⑧或Milliflex (Millipore Corporation, Billerica, MA)。接收器可 以位于装有适合于滞留靶核酸分析物的核酸捕获树脂的微柱(52)之上。
树脂可以适合于滞留靶分析物例如来自样品中的核酸，样品例如为包含 RNA和DNA例如基因组DNA的细胞裂解物。树脂可以包含多糖例如 纤维素。树脂可以包含硅酸盐例如玻璃纤维。微柱可以与用于将裂解物 抽吸通过柱的注射器(53)以液体连通。
图6a显示了密封的封闭式顶罩过滤装置的实例。封闭式顶罩装置 可以用于在无菌条件下加工处理样品。顶罩可以作为一个或多个多孔膜
的外壳，还可以包含一个或多个不作为样品或试剂进口的通气口。通气 口可以是由任何合适材料构成的，其容许空气和其他气体通过，但是不 容许特殊物质例如微生物通过。在一个实施方式中，通气口是由可透气 的疏水性屏障构成的。亲水性屏障也是可以的。在一些实施方式中，通 气口可以位于有顶罩的外壳结构的表面上。在另一个实施方式中，通气 口可以被设置成作为伸入到有顶罩的外壳的一部分内的侧臂，例如与含 有一个或多个多孔膜的带顶外壳相连通的入口。当样品流过过滤装置
时，可以用Luer锁紧塞封闭通气口。塞子可以由固体材料构成，或者本 身可以是通气口，因此可以由膜屏障例如疏水性膜构成。通气口的应用 提供了释放压力的手段，并因此避免了对滤器的损害。
图6b显示了单次使用本发明的膜装置的实例，其中装置包含多个 叠放的膜性滤筒。装置中的每个滤筒都可与下一个相邻的滤筒以液体连 通。滤筒可以由一个或多个多孔膜构成。如果滤筒包含多于一个的多孔 膜，滤筒所含的多孔膜彼此可以相同或不同。在一些实施方式中，可以 用加热的聚丙烯融合滤筒内的多个膜。例如，第一个滤筒可以由混合纤 维素酯(MCE)膜构成，叠放在第一个滤筒之下的第二个滤筒可以由玻璃 纤维膜构成。MCE可以具有比玻璃纤维膜更小的标定孔径。
图7显示了本发明的一个实施方式的具有多个膜通气口的装置的实 例。装置可以与注射器经双向真空阀(止回阀组件)相连接。双向真空阀 可以与溶液歧管连通。从溶液歧管分出多个与溶液容器(例如样品、裂解 物、洗涤液、洗脱液/缓冲液)和空气通气口相连的管路。每个液体管路 都受电控夹闭阀控制。可以依次地引入样品、随后是裂解缓冲液、随后 是洗涤液、随后是洗脱缓冲液，以便在设备的第一个多孔膜表面上捕获 并裂解细胞，然后从装置的叠放膜上捕获、洗涤并洗脱下核酸。装置的 第一个多孔膜可以包含聚合物例如MCE。第二个膜可以包含硅酸盐例 如玻璃纤维。聚合物膜的标定孔径可以小于硅酸盐膜的标定孔径。图7 所示的系统是一个如何实现自动化的实例。
膜
可以按叠放的构型或顺序地设置膜(图8)。本发明所用的膜可以由 本领域已知的任何多孔材料组成。合适的多孔材料实例包括但不限于聚 醚砜、聚酰胺、例如琼脂糖、纤维素、多糖、聚四氟乙烯、聚砜、聚 酯、聚氟乙烯、聚丙烯、碳氟化合物例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯 醚))(poly(tetrafluoroethylene-co-perfluoro(alkyl vinyl ether)))、聚碳酸酯、 聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、陶瓷、尼龙、碳纳米管和金属。
在某些具体的实施方式中，第一个膜可以包含混合纤维素。在其他
具体的实施方式中，第一个膜可以包含硝酸纤维素。膜可以包含范围为 从0.1%至1』100%、 1.0%至1] 99.9%、 5%到95%、 10%到90%、 20%到 80%、 30%到70%、 40%到60%的量的硝酸纤维素。在一些实施方式 中，第一个膜可以包含至少50%的硝酸纤维素。
第二个膜可以包含玻璃或玻璃纤维。在一些实施方式中，可以使用 适合于滞留核酸例如RNA的树脂。如果需要包含捕获探针的任选的第 三个膜，第三个膜可以包含任何已知的多孔材料例如尼龙、聚乙烯砜 (polyethylene sulfone)。
本发明的合适的膜可以具有范围从0.0001 nm到100 pm、 0.1 pm到 80jam、 lnm至lj50(am、 2 |am到45 的孔径。在一些实施方式中，顶 层膜或首先接触样品的膜的标定孔径要比第二个或后继膜的标定孔径更 小。在具体的实施方式中，其中至少一个膜具有至少2nm的孔径。在其 他实施方式中，至少其中一个膜具有至少45pm的孔径。在某些实施方 式中，本发明提供了孔径范围从O.lpm到5(Him，例如45pm的纤维素 膜。在具体的实施方式中，本发明提供了孔径范围从0.1拜到IOO拜的 硅酸盐膜。在其他实施方式中，本发明提供了孔径为0.7pni的硅酸盐
使用膜而不使用用于分析物吸附或色谱法的多孔珠的显著优点是两 种格式之间的液体流动模式的差异。当例如在填充床中使用多孔珠时， 在所施加的迁移流中的分析物弥散到薄膜表面，然后也在珠孔内缓慢弥 散。当使用膜时，在所施加的迁移流中的分析物快速地移动通过膜，只 需要弥散到薄膜表面。利用膜可能比珠能更快地实现对分析物的饱和结 合。因为膜是一种侧向远大于纵向的结构，因此在各种驱动力下都可以 出现物质转移经过膜。
除了其中大多数迁移都与膜表面垂直的正常流动装置外，也可以将 径向流动装置用于分析物吸附和色谱分析。在径向流动装置中，液流流 经缠绕于多孔圆筒状玻璃料周围的膜。液流可以是从内向外或者从外向 内。
核酸样品
样品在此表示包含源自任何生物学来源的核酸的材料。生物学来源 可以是任何活体的或死的事物例如植物、动物、病毒颗粒。生物学来源 可以是整个生物体或源自生物体的器官或组织。生物学来源可以是单细 胞的例如细菌、支原体，或者是多细胞的例如动物或植物，或者是非细 胞的例如病毒。细胞来源可以包含真核细胞、原核细胞包括支原体。真 核细胞的实例可以包含源自任何哺乳动物的细胞，例如人、非人灵长 类、马、山羊、绵羊、鼠、兔、小鼠、豚鼠。原核细胞的实例包括革兰 氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡 萄球菌。当样品是细胞样品时，可以在与多个膜接触之前裂解细胞。对 于细胞样品是原核细胞的情况，可以在与多个膜接触之前例如通过离心 澄清样品。样品可以包含天然存在的样品或那些部分或全部人工生成的 或加工过的样品。
在此所述方法中的用于分离的靶核酸包含样品中发现的任何核酸，
包括DNA、 RNA、 PNA、 LNA和一种以上核酸类型的杂种。核酸可以
是双链的、单链的或多链的。当靶是DNA时，DNA可以是质粒 DNA、载体DNA、基因组DNA包括线粒体DNA、或上述任何DNA的 片段。当靶包含RNA时，RNA可以是mRNA、 tRNA或rRNA例如16s RNA、 23sRNA。核酸可以包含核苷酸类似物例如链终止剂。耙核酸的 大小范围可以从2到30个核苷酸或者可以是千碱基或更大的范围。
试剂盒
本发明也提供了可以用于从样品中分离出核酸的试剂盒。试剂盒可 以包含本发明的一个或多个过滤装置以及一个或多个容器。试剂盒可以 包含一种或多种对照或样品靶核酸或标本。试剂盒可以任选地包括本发 明方法所用的各种缓冲液。例如，当靶核酸包含于由细胞组成的样品中 时，试剂盒可以包含适合于裂解细胞的裂解缓冲液。试剂盒也可以任选 地包含用于消除试剂或非特异滞留的或结合的物质的洗涤缓冲液。试剂 盒也可以任选地包括用于从膜中洗脱出结合的靶核酸的洗脱缓冲液。可 以在不同的容器中以溶液的形式提供每种缓冲液。或者，可以以干燥形 式或粉末形式提供缓冲液，可以根据使用者所需的用途将其制备成溶 液。在这种情况中，可以提供小包装的缓冲液。对于装置是自动化的情 况，试剂盒可以提供动力源。试剂盒也可以包含真空泵。试剂盒也可以 包含用于使用装置和/或制备适用于本发明的装置和方法的试剂的说明 书。当实施本发明的方法或者当使用本发明的装置时，也可以包括任选 地包括记录并分析所获得的数据的软件。
实施例
实施例l:利用离心设备同时纯化RNA和基因组DNA
离心收集过夜培养的铜绿假单胞菌。将细胞沉淀重悬于含有溶菌酶 (lmg/ml)的Tris-EDTA(TE)缓冲液中。在孵育5分钟之后，加入含有 1%13-巯基乙醇的裂解缓冲液(3 M GuSCN， 0.01 M Tris-HCl， pH 7.6，0.035 MEDTA)，并离心细菌裂解物。将上清液转移到新试管内，并向 裂解物中加入100%乙醇。
将包含"109个细菌的澄清的裂解物混合物装入到包含单层MCE膜 (Millipore Corporation, Billerica， MA)的禽心装置中。离心装置，并将滤 过液装入到具有标定孔径为0.7微米的单层玻璃纤维膜(APFF) (Millipore Corporation, Billerica， MA)的离心装置中。离心后一装置，并废弃滤过 液。用包含1 M GuSCN、 0.01 M Tris-HCl， pH 7.6、 0.035 M EDTA、 25% EtOH的缓冲液1洗涤MCE膜和玻璃纤维膜装置，随后用包含70% EtOH (于0.01 M Tris-HCl中，pH 7.6)的缓冲液2洗涤两次。
随后，用水作为洗脱缓冲液在MCE过滤装置上实施洗脱步骤。洗 脱液含有分离的RNA(见图9a)。用水对玻璃纤维膜进行洗脱，在其洗脱 液中得到了分离的基因组DNA(见图9b)。
实施例2:利用叠放过滤板从原核细胞中同步纯化RNA和基因组DNA
离心收集过夜培养的铜绿假单胞菌。将细胞沉淀重悬于含有溶菌酶 (lmg/ml)的TE缓冲液中。在孵育5分钟之后，加入含有1%|3-巯基乙醇 的裂解缓冲液(如实施例1所述)，并离心细菌裂解物。将澄清的上清液 转移到新试管内，并向裂解物中加入乙醇，使得裂解物中的乙醇终浓度 为35%。
将该混合物装入到叠放的96孔过滤板中，MCE膜板在顶层，玻璃 纤维位于底层，使得混合物首先与MCE过滤板接触。向每个孔内装入 含有1-5 x 108个裂解细菌的澄清上清液。离心叠放的过滤板，并废弃过 滤液。向每个孔内加入洗涤缓冲液1 (如实施例1所述)，现在单个板地 离心板。用洗涤缓冲液2(如实施例l所述)进行两次以上的洗涤。
分别用水从MCE过滤板(图10a)和玻璃纤维板(图10b)中洗脱出细 胞RNA和基因组DNA。实施例2:利用叠放过滤板从真核细胞中同步纯化RNA和基因组DNA
用胰蛋白酶处理3T3 NIH成纤维细胞并沉淀。将细胞沉淀重悬于含 有1% P-巯基乙醇的裂解缓冲液(如实施例1所述)。向裂解物中加入 EtOH，使得其在裂解物中的终浓度为35%，并将混合物装入到叠放的 MCE和玻璃纤维过滤板上。每孔装入5xl()S个成纤维细胞。离心过滤板 叠层，并废弃过滤液。向每个孔内加入洗涤缓冲液1 (如实施例1所 述)，并将板单个地进行离心。用洗涤缓冲液2 (如实施例1所述)再进行 两次洗涤。
分别用水从MCE过滤板(图lla)和玻璃纤维板(图llb)中洗脱出细 胞RNA和基因组DNA。
实施例4:用RT-PCR定性测定RNA
用Protoscript First Strand cDNA Synthesis Kit (New England BioLabs， Beverly, MA)(NEB)将在上面所述试验中所用的从MCE滤器的单个孔中 洗脱下的原核以及真核RNA (200ng)转录成cDNA。根据NEB试剂盒手 册，用随机引物合成cDNA。对于每个cDNA合成都包含一个阴性对照 (没有逆转录酶的样品)(图12的泳道2和5)。泳道5所示的条带是引物 二聚体。
利用卩-肌动蛋白引物(正向引物GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA (SEQ ID NO: 1);反向引物CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT， (SEQ ID NO: 2)) (Applequist et al. 2002, International Immunology 14(9): 1065-1074)，用标准的方法扩增真核cDNA(见图12a)。利用16S rRNA 基因引物(正向引物GGT CTG AGA GGA TGA TCA GT， (SEQ ID NO: 3);反向引物TTA GCT CCA CCT CGC GGC， (SEQ ID NO: 4)) (Widmer et al. 1998, Applied and Environmental Microbiology, 64(7): 2545),用PCR扩增原核cDNA(见图12b)。
实施例5:比较利用离心装置中的单个MCE滤器或商业化可获得的柱得 到的RNA纯度
离心收集过夜培养的铜绿假单胞菌。将细胞沉淀重悬于含有溶菌酶 (lmg/ml)的TE缓冲液中。在孵育5分钟之后，加入含有1%^巯基乙醇 的裂解缓冲液，并离心细菌裂解物。将澄清的上清液转移到新试管内， 并向裂解物中加入100%乙醇。将混合物装入到三个具有单层MCE膜的 离心装置以及一个Midi RNeasy⑧旋转柱(Qiagen, Valencia, CA)中。向膜 装置或柱中装入每个装置lxl()S个细菌的澄清上清液。离心装置和柱， 并废弃过滤液。随后用洗涤缓冲液1 (如实施例1所述)洗涤，以及用洗 涤缓冲液2 (如实施例1所述)洗涤两次。用水洗脱RNA。图13显示了 MCE膜装置的纯化得到了纯RNA。 Qiagen RNeasy⑧柱得到了仍有显著 量的基因组DNA污染的RNA产物(图13，列14)。
在说明书和权利要求书中所用的表示整数数量、反应条件等的所有 数目都应当理解为在所有情况中都被术语"大约"修饰。因此，除非有 相反的说明，本说明书和所附的权利要求书中所设定的参数都是近似 的，且可能根据本发明要达到的所需的性能而变化。最低限度地、且无 意于限制将等同条款适用于权利要求书的范围，每个数值参数都应当根 据有效数字的量和一般的舍入方法进行理解。
在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可以对本发明进行多种修 饰和变更，这对于本发明的技术人员是显而易见的。仅仅以实施例的方 式提供了在此所述的具体的实施方式，并不作为任何的限制。本说明书 和实施例应该只被认为是举例说明的，下面的权利要求书表明了本发明 的真实范围和精神。
序列表
<110>米利波尔公司
<120〉自生物学样品中分离RNA和DNA
<130> MCA-849 US
<160> 4
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 20
〈212〉 DNA
<213〉 ARTIFICIAL
<220〉
<223〉 ARTIFICIAL PRIMER
<400> 1
gtggggcgcc ccaggcacca
<210> 2
〈211〉 21
<212> DM
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> ARTIFICIAL PRIMER
〈400〉 2
ctccttaatg tcacgcacga t 21
<210> 3
<211〉 20
<212> DNA
<213〉 ARTIFICIAL
<220>
<223〉 ARTIFICIAL PRIMER
<400> 3
ggtctgagag gatgatcagt
<210> 4
〈211〉 18
<212〉 DNA
〈213〉 ARTIFICIAL
<220〉
<223> ARTIFICIAL PRIMER
<400> 4
ttagctccac ctcgcggc 18
权利要求
1.一种从细胞样品中分离DNA和RNA的方法，包括a)用裂解缓冲液裂解细胞样品；b)任选地澄清细胞样品，以获得澄清的上清液；c)将包含多糖的第一个膜与裂解物相接触，以使得RNA与第一个膜结合；和d)将裂解物或第一个膜的过滤液与第二个膜相接触，以使得DNA与第二个膜结合，据此从细胞样品中分离出DNA和细胞RNA。
2. 权利要求l的方法，其中DNA是基因组DNA。
3. 权利要求l的方法，其中裂解缓冲液具有非酸性的pH值。
4. 权利要求3的方法，其中裂解缓冲液包含离液剂和螯合剂。
5. 权利要求l的方法，其中所述澄清步骤包括离心所述样品。
6. 权利要求l的方法，其中第一个膜是混合纤维素酯膜。
7. 权利要求l的方法，其中第二个膜是硅酸盐膜。
8. 权利要求1的方法，还包括以多种洗涤缓冲液洗涤第一个和第 二个膜。
9. 权利要求8的方法，其中所述多种洗涤缓冲液具有非酸性的pH值。
10. 权利要求8的方法，其中所述多种洗涤缓冲液包括一种包含离 液剂、螯合剂和醇的缓冲液。
11. 权利要求8的方法，其中所述多种缓冲液包括至少一种包含醇 的缓冲液。
12. 权利要求8的方法，其中首先用包含离液剂、螯合剂和醇的缓 冲液洗涤膜，随后用包含醇的洗涤缓冲液洗涤膜。
13. 权利要求1的方法，还包括将第一个和第二个膜与洗脱缓冲液 相接触。
14. 权利要求13的方法，其中所述洗脱缓冲液是水。
15. —种从细胞样品中分离基因组DNA和细胞RNA的方法，包括 a)用pH值为7.6并包含3M硫氰酸胍、0.01M Tris-HCl和0.035M EDTA的裂解缓冲液裂解细胞样品；b)离心细胞样品，以获得澄清的上清液；c) 将上清液与混合纤维素酯膜相接触，以使得RNA与膜结合；和d)将第 二个膜与上清液或第一个膜的过滤液相接触，以使得DNA与包含玻璃 纤维的第二个膜结合；e)用包含离液剂、螯合剂和醇的非酸性的洗涤缓 冲液洗涤两个膜，f)用包含醇的非酸性的洗涤缓冲液洗涤两个膜，据此 从细胞样品中分离出DNA和细胞RNA。
16. 权利要求15的方法，还包括用水将DNA和RNA中的至少一 种自其相应的膜上洗脱下来。
17. —种用于从细胞样品中分离DNA和RNA的试剂盒，包括a)包 含多糖的第一个膜以及包含硅酸盐的第二个膜；b)任选地一或多种非酸 性的洗涤缓冲液；c)一或多个容器。
18. 权利要求17的试剂盒，其中第一个膜是混合纤维素酯膜以及第 二个膜是玻璃纤维膜。
19. 权利要求17的试剂盒，其中所述一或多种洗涤缓冲液包括包含 离液剂、螯合剂和醇的第一种非酸性的洗涤缓冲液以及包含醇的第二种 非酸性的洗涤缓冲液。
20. 权利要求18的试剂盒，还包括适合于裂解细胞样品的非酸性的 裂解缓冲液。
21. 权利要求20的试剂盒，其中裂解缓冲液包括离液剂和螯合剂。
22. 权利要求1的方法，其中第一个膜和第二个膜各自包括多孔板 或单孔板。
23. 权利要求22的方法，其中多孔板或单孔板是叠放设置的。
24. 权利要求23的方法，其中在步骤c)之后离心所述多孔板或单孔板。
25. 权利要求23的方法，其中在步骤c)之后给所述多孔板或单孔板 施加真空。
26. 用于从细胞样品中分离RNA的试剂盒，包括a)混合纤维素酯 膜；b)—或多种非酸性的洗涤缓冲液；和c)一个或多个容器。
27. 权利要求26的试剂盒，其中一或多种洗涤缓冲液包括包含离液 剂、螯合剂和醇的第一种非酸性的洗涤缓冲液和包含醇的第二种非酸性 的洗涤缓冲液。
28. 权利要求26的试剂盒，还包含适合于裂解细胞样品的非酸性的 裂解缓冲液。
29. 权利要求28的试剂盒，其中裂解缓冲液包含离液剂和螯合剂。
全文摘要
本发明涉及利用包含多个膜的过滤装置从样品中分离出核酸的方法。本发明也提供适合于从样品中分离核酸的包含多个膜的设备和试剂盒。
文档编号C12N15/10GK101113437SQ20071012929
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者K·翁杰纳, R·F·巴吉奥 申请人:米利波尔公司