检测乙型肝炎病毒DNA及其G₁₈₉₆A突变的方法及试剂盒的制作方法

专利名称：检测乙型肝炎病毒DNA及其G₁₈₉₆A突变的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测野生型及G1896A突变型的乙型肝炎病毒DNA的方法，特 别是涉及一种使用锁核酸(LNA， Locked Nucleic Acids)和分子信标探针结合的 技术进行实时PCR的检测方法。本发明还进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。
背景技术：
病毒性乙型肝炎(HB， hepatitis B)是一种世界性的传染性疾病(Lok AS, Heathcote EJ, Hoofhagle JH. Gastroenterology 2001; 120:1828-1853)。我国是HBV 感染的高发区，约50-70%的人群受过HBV的感染，约8-12。/。的人群为慢性HBV 感染者。目前全世界每年约有120万人死于HBV感染引起的疾病。乙型肝炎病 毒感染不仅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且还与肝硬化(liver cirrhosis, LC) 和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma, HCC)的发生、发展有密切的关系。
临床上HBeAg转阴以及HBeAb阳性常常被认为是HBV病毒复制减少、肝 损伤和肝癌危险性减轻以及治疗可以终止的指标。然而近期发现，许多患者尽管 HBeAg是阴性的，但病毒仍大量复制，肝损伤程度也很严重(即所谓的HBeAg 阴性慢性乙型肝炎)。近年来的临床与基础研究均表明，HBeAg阴性慢性乙型肝 炎在慢性乙型肝炎患者中所占的比例逐年增大，其在临床表现、预后、抗病毒治 疗方案与应答等诸多方面与HBeAg阳性慢性乙型肝炎存在着显著差异。研究表 明，HBeAg阴性慢性乙型肝炎是由于HBV基因组发生变异引起的。
HBV基因组共含有4个基因区，分别为S， C， P， X基因区，每个基因 区构成一个独立的开放阅读框(ORF， open reading frame)。 C基因区又包括两 部分前C (pre-C)区和C区。HBeAg是C基因区的表达产物，该基因区的5' 端发生突变常导致HBeAg分泌量的减少，且最常见的突变有两种 一是C基因 启动子处的1762 (A—T， A1762T)和1764 (G— A， G1764A)双突变(Okamoto H, Tsuda F， Akahane Y， Sugai Y, Yoshiba M, Moriy咖a K， et al. J Virol 1994; 68:
8102-8110)，该突变导致了转录因子结合的改变(Buckwold VE， Xu Z, Chen M, Yen TS, Ou JH. J Virol 1996; 70: 5845-5851 and Li J， Buckwold VE, Hon MW， Ou JH. J. J Virol 1999; 73: 1239-1244.)，以至于前C区mRNA的减少，从而减少了 HBeAg的合成；二是前C (pre-C)区的1896位点(G—A， G1896A)发生的突 变，该突变导致该区第28个密码子成为终止密码子，使得HBeAg的翻译提前终 止，从而也减少了HBeAg的合成。有证据表明，HBeAg阴性突变体的主要原因 (占60—80%)就是由于pre-C区的1896位点(G—A， G1896A)发生突变引起 的(Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, Karayiannis P, McGarvey MJ, Makris A， et al. Lancet 1989; 2: 588-591)。
近期研究又发现，pre-C区的G则6A突变主要发生在HBV的B、 C和D型 标本中，可能与急性肝炎的发生相关(Annie Pang， Man-Fung Yuen, He-Jun Yuan, Ching-Lung Lai, Yok-Lam Kwong, Journal of H印atology 2004; 40:1008-1017)。 又有证据证明pre-C区的G1896A突变是与HBV的持续性感染以及原发性肝癌的 发生有关。然而，不管G则6A突变是与急性肝炎的发生还是与HBV的持续性感 染相关，它的检测在抗乙型肝炎病毒的诊疗、预后及病毒自然史的研究中都有着 十分重要的指导意义。
pre-C区突变常常是通过PCR扩增后测序确定，或者通过线性探针检测 (Stuyver L, De Gendt S， Cadranel JF, Van Geyt C, Van Reybroeck G Dorent R, et al. Hepatology 1999; 29: 1876-1883);更近的方法有通过TaqMan-MGB探针来检测 (Annie Pang, Man-Fung Yuen, He-Jun Yuan, Ching-Lung Lai， Yok-Lam Kwong. Journal ofHepatology 2004; 40: 1008-1017)。然而测序方法比较麻烦，而且对杂合 体的检测灵敏度有很大的局限性(一般<20% )(Therese L. Waltz, Salvatore Marras, Gemma Rochford, John Nolan， Eugenia Lee， Margherita Melegari, and Henry Pollack, Journal of Clinical Microbiology 2005; 1:254-258);线性探针(如TaqMan探针) 用于SNPs(single nucleotide polymorphisms)的检测特异性不太好(Marras S.A.E, Kramer F,R., Tyagi S. The Humana Press Inc. 2003; 212: 111-128);而TaqMan-MGB 探针的合成价格极其昂贵，而且合成该探针的厂家极少，探针合成来源受到限制。 分子信标探针则恰恰能弥补上面那些方法的不足，已被证明是一种新颖的可用于 检测SNPs的好方法(Marras SA, Kramer FR, Tyagi S. Methods Mol. Biol. 2003; 212:
111-128)。尽管如此，本实验室初步的实验结果却表明，常规的分子信标探针的
臂和环必须都相对较短才能使得它对野生型HBV DNA及其G1896A突变的检测
特异性达到要求，而且这种相对较短的分子信标探针检测时所采用的PCR程序
也必须与常规的实时PCR程序不同，它必须在低温(比退火温度低的温度)下
检测荧光。这就无形中延长了整个PCR程序的运行时间。
为了解决这个问题，我们采用了锁核酸(LNA， Locked Nucleic Acids)技术。
锁核酸(LNA， Locked Nucleic Acids) —词是1998年Koshkin et al.首先提出来
的，它是指一种寡核苷酸衍生物，该衍生物中含有一个或几个结构特殊的核苷酸
单体，这种核苷酸单体是在核糖的2'-0与4'-C间通过不同的縮水作用形成氧亚
甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，形成了刚性的缩合结构,增加了磷酸盐骨架的
局部结构的稳定性。与常规的寡核苷酸探针相比，锁核酸探针与单链互补的靶
DNA或RNA的亲和力更强；且探针的融解温度(Tm)有相当程度的提高，这
样就可以使用较短的探针在常规的温度下检测SNPs (Luis A. Ugozzoli, David
Latorra， Randi Pucket, Khalil Arar, and Keith Hamby, Analytical Biochemistry 2004;
324:143-152);而且锁核酸探针对SNPs检测的特异性也增强。所以，本发明利
用锁核酸和分子信标探针结合的技术以及实时PCR方法，试图灵敏且特异地检
测出临床血液标本中野生型及G1896A突变型的乙型肝炎病毒DNA。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种检测临床血液标本中野生型及G朋6A突变型的 乙型肝炎病毒DNA的方法，特别是提供了一种使用锁核酸和分子信标荧光探针 结合技术的实时PCR检测方法。
本说明书中所使用的术语"G,896A突变"是指乙型肝炎病毒DNA序列的第 1896位点发生了碱基突变，从碱基G变成碱基A。
本发明的检测方法包括以下步骤(1)从待检的血液标本中提取病毒DNA; (2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信标探针(该探针是锁核酸LNA，即 Locked Nucleic Acids)，对提取的病毒DNA进行实时PCR以扩增包含1896位点 的耙DNA片段，并对野生型和G1896A突变型的乙型肝炎病毒DNA进行检测； (3)根据实时PCR的扩增曲线，分析并判断标本中乙型肝炎病毒DNA是野生 型的还是G1896A突变型的。该方法的特征在于聚合酶链反应体系中使用的正向
和反向引物分别是-
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID N0:2)
并且实时PCR反应中所用的野生型和G1896A突变型的分子信标探针(都属于 LNA)分别是
(3) 5， -FAM-CAACGCTTT^GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT|GGCCA0GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待检血液标本是指含有乙型肝炎 病毒DNA的血液标本。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分子信标探针的特征是探针的 环部分含16个碱基，探针的臂部分含5个碱基。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的野生型的分子信标探针是用来检 测血液标本中野生型的乙型肝炎病毒DNA;而所说的G1896A突变型的分子信标 探针则是用来检测含G1896A突变的乙型肝炎病毒DNA， 二者都是经LNA化的。 其中前者5'端标记有HEX荧光基团，3'端标记有DABCYL淬灭基团，而后 者的5'端则是标记FAM荧光基团，3'端也是标记DABCYL淬灭基团。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的实时PCR扩增所用的程序是 50°C 120秒(l个循环)~~ 95°C 180秒(l个循环)95°C 10秒，56°C 30秒(40个循环)。其中56t:是检测荧光的温度。
本发明的另一个目的是提供用于检测野生型及G则6A突变型的乙型肝炎病毒 DNA的试剂盒，该试剂盒包括(1)血液标本中乙型肝炎病毒DNA提取试剂；
(2)聚合酶链反应混合液；(3)酶混合液；(4)突变型阳性对照；(5)野生型 阳性对照；(6)阴性对照。其特征在于聚合酶链反应体系中使用的正向和反向引 物分别是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)
并且实时PCR反应中所用的野生型和G1S96A突变的分子信标探针(都属于LNA) 分别是 (3) 5， -FAM-CAACGCTTT^GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5' -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA提取试剂由提取液A、提 取液B和提取液C组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应混合液由lOxPCR buffer、 dUTPs、正反向两条引物、野生型和突变型分子信标探针等组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的酶混合液由普通Taq酶和UNG 酶组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的突变型阳性对照是是经过测序确 认过的含G1896A突变的HBV DNA片段的质粒；野生型对照是经过测序确认过 的含1896位点不发生突变的野生型HBV DNA片段的质粒；阴性对照是高压灭 菌水。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于用于聚合酶链反应的正向和反向
引物分别是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)
并且实时PCR反应中所用的野生型和G1896A突变型的分子信标探针(都属于 LNA)分别是
(3) 5， -FAM-CAACGCTTT@}CCAgGGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCCA@GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
犮明内容
本发明提供一种检测野生型和Gi896A突变型的乙型肝炎病毒DNA的方法，特 别是提供了一种使用锁核酸(LNA， Locked Nucleic Acids)和分子信标荧光探针 结合技术的实时PCR检测方法。本发明还进一步提供了用于检测临床血液标本 中野生型和G1896A突变型的乙型肝炎病毒DNA的试剂盒。
为了克服现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了一个适于检测野生型和 G则6A突变型的乙型肝炎病毒DNA的方法，该方法包括(1)从待检血液标本 中提取病毒DNA; (2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信标探针(该探针是 一种锁核酸LNA，即Locked Nucleic Acids)，对提取的病毒DNA进行实时PCR 以扩增包含1896位点的靶DNA片段，并对野生型和G1896A突变型的乙型肝炎 病毒DNA进行检测；(3)根据实时PCR的扩增曲线，分析并判断标本中乙型肝 炎病毒DNA是野生型的还是G1896A突变型的。该方法的特征在于聚合酶链反应 体系中使用的正向和反向引物分别是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)
(2) 5'-AAGGCAAAAMGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)
并且实时PCR反应中所用的野生型和Gi896A突变型的分子信标探针(都属于
LNA)分别是
(3) 5' -FAM-CAACGCTTT0GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5, -HEX-CAACGCTTT§GGCCA|gGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待检血液标本是指含有乙型肝炎 病毒DNA的血液标本。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分子信标探针的特征是探针的 环部分为16个碱基，探针的臂部分为5个碱基。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的野生型的分子信标探针是用来检 测血液标本中野生型的乙型肝炎病毒DNA;而所说的G1896A突变突变型的分子 信标探针则是用来检测含G1896A突变的乙型肝炎病毒DNA， 二者都是经LNA 化的。其中前者5'端标记有HEX荧光基团，3'端标记有DABCYL淬灭基团；而 后者的5'端则是标记FAM荧光基团，3'端也是标记DABCYL淬灭基团。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的实时PCR扩增所用的程序是 50°C 120秒(l个循环)~~ 95°C 180秒(l个循环)^ 95°C IO秒，56°C 30秒(40个循环)。其中56'C是检测荧光的温度。
简单地说，为了完成本发明的方法，首先提取待检临床血液标本中乙型肝炎 病毒DNA，然后以提取的DNA为模板，使用合成的正向和反向寡核苷酸引物进
行PCR扩增。扩增时以HEX和DABCYL修饰的野生型分子信标荧光探针检测 野生型模板，同时以FAM和DABCYL修饰的G1896A突变型的分子信标荧光探 针检测乙型肝炎病毒DNA的G1896A突变。最后再根据实时PCR的扩增曲线判 断所检测的血液标本是含野生型的乙型肝炎病毒DNA还是含G1896A突变型的乙 型肝炎病毒DNA。现针对本发明的几个主要步骤，分别详述如下
1. 乙型肝炎病毒DNA的提取 本发明采用的是优化后的乙型肝炎病毒DNA的提取方法。首先是在约50/il
的临床血液标本中加入PEG8000以沉淀病毒，离心后去掉上清；再加入NaOH 并在95'C下使病毒完全裂解；最后再加入Tris-HCl以中和裂解液，离心后取5/xl 上清用于PCR扩增。
2. 引物的设计和合成
为了特异、高效地扩增待检临床血液标本中包含1896位点的乙型肝炎病毒的 靶DNA片段，我们从GeneBank中调出乙型肝炎病毒各亚型的尽可能多的全基 因组DNA序列，然后通过DNAStar软件进行各亚型序列比较，并把序列比较后 的Consensus序列输出。接着从Consensus序列中找出含1896位点左右长约200bp (1896位点约在中间)的一段序列用Beacon5.0软件进行引物设计。最后再把 Beacon5.0软件找好的引物序列到比较好的各亚型序列中去核对其保守性，若保 守就可发到引物合成公司(主要是上海生工生物工程技术服务有限公司)进行合 成。本发明中设计的一条正向和一条反向引物的序列分别是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID N0:2)
3. 探针的合成和标记 分析乙型肝炎病毒DNA1896位点上下游序列的保守性，我们合成了两条分子
信标探针，它们的环均为16个碱基，臂都是5个碱基。其中一条探针的5'端标 记有FAM荧光基团，3'端标记有DABCYL淬灭基团，是用来检测临床血液标本 中含G1896A突变的的乙型肝炎病毒DNA。另一条探针的5'端标记有HEX荧光 基团，3'端也是标记有DABCYL淬灭基团，是用来检测临床血液标本中野生型 的乙型肝炎病毒DNA。这两条探针都是经过LNA化的，其中前者有3个碱基进 行LNA化，而后者只有两个碱基进行LNA化。LNA化的探针使得试剂盒有良
好的的特异性和灵敏度。两条探针的具体序列如下
(3) 5， -FAM-CAACGCm@GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4)
其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
4. 核酸扩增体系的优化
为了增强PCR扩增的效果(主要是曲线的光滑度和荧光强度)，并且提高试剂 盒检测的灵敏度和特异性，我们首先对PCR扩增程序的各个参数(主要是退火 温度和时间以及检测温度和时间)进行优化，最终选择的PCR运行程序是50°C 120秒(1个循环)一~^95。C 180秒(1个循环)^ 95°C 10秒，56'C 30秒 (40个循环)。其中检测荧光的温度是56'C。然后在这个PCR扩增程序的基础 上再对MgCl2浓度、Taq酶、dUTPs、 Tris-HCl、 KC1、引物和探针的用量进 行优化。
5. 扩增结果的分析和判断
荧光明显比荧光域值(在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在 荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)高，扩增曲线光滑且明显呈S型趋势的 才能判断为阳性；否则为阴性。每个实验的突变型阳性对照和野生型阳性对照的 扩增结果都应确定是阳性，而阴性对照的扩增结果都应是确定的阴性才可以。
如前所述，由于本发明采用了 LNA化的分子信标荧光探针，使得野生型和 G1896A突变型的乙型肝炎病毒DNA检测的灵敏度和特异性都完全可以符合临床 需求。另外，本发明对MgCl2浓度、酶、dUTPs、 Tris-HCl、 KC1、引物和探 针的用量进行优化，使得实时PCR的扩增曲线更加美观和稳定，从而使得检测 结果更加可靠。此外，本发明检测两种最通用的荧光^FAM和HEX荧光，适 用于市场上大部分荧光PCR仪检测，而且也大大减少了检测成本，利于推广应 用。
本发明的另一个目的是提供用于检测野生型和G^6A突变型的乙型肝炎病毒 DNA的试剂盒，该试剂盒包括(1)血液标本中乙型肝炎病毒DNA提取试剂； (2)聚合酶链反应混合液；(3)酶混合液；(4)突变型阳性对照；(5)野生型 阳性对照；(6)阴性对照。其特征在于聚合酶链反应体系中使用的正向和反向引 物分别是
(1) 5, -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID N0:2)
并且实时PCR反应中所用的野生型和G1896A突变型的分子信标探针(都属于 LNA)序列分别是
(3) 5' -FAM-CAACGCTTT0GCCA|GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT|GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA提取试剂由提取液A (40 %PEG8000)、提取液B (0.25MNaOH)和提取液C (0.4MTris-HCl， pH6.4)组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应混合液(每人份) 由2.5^1 lOxPCR buffer (850mMKCl， 400 mM Tris-Cl， pH8.9' 50。/。v/v甘油)、 0.2^1 dUTPs (dATP、 dUTP、 dGTP、 dCTP各25mM)、正反向两条引物(都是 100/xM)各O.lpd、野生型和突变型分子信标探针(100 /AM)各O.lpl、 1.5/xl MgCl2 (25mM)等组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的酶混合液由普通Taq酶(5U尔1) 和UNG酶(lU/pl)按v/v-5:l组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的其中所说的突变型阳性对照是 经过测序确认过的含G1896A突变的HBV DNA片段的质粒；野生型阳性对照是 经过测序确认过的含1896位点不发生突变的野生型HBV DNA片段的质粒；阴 性对照是高压灭菌水。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于聚合酶链反应的正向和反向引物
分别是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3， (SEQ ID NO:2) 并且实时PCR反应中所用的野生型和01896八突变的分子信标探针(都属于
LNA)分别是
(3) 5, -FAM-CAACGCTTT^GCCA0GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4)
其中蓝色标记的碱基是进行LNA化的。 本发明的试剂盒不但能特异地区分野生型的和G1896A突变的乙型肝炎病毒 DNA ，而且其检测灵敏度远大于测序方法，能检测到野生型和突变型杂合模板 中大于等于5%以上的突变型模板和10%以上的野生型模板(杂合模板的乙型肝 炎病毒DNA的浓度是1.0xl07copies/ml);弓l物和探针序列都非常保守，所以试 剂盒检测的准确性极高，几乎无漏检现象。所以本发明的方法和试剂盒特别适用 于临床血液标本中野生型和G1896A突变型的乙型肝炎病毒DNA的鉴定和区分。


图1显示乙型肝炎病毒DNAG则6A突变的灵敏度检测结果。所用的模板都是 经过测序确认过的含G1896A突变的HBVDNA片段的质粒，其中浓度最高的模 板约为1.0xl06copies/ml，浓度最低的模板约为1.0xl02copies/ml。
图2显示FAM标记的&896八突变型探针的特异性检测结果。所用的模板都是 经过测序确认过的1896位点不发生突变的野生型乙型肝炎病毒DNA。
图3显示野生型乙型肝炎病毒DNA的灵敏度检测结果。所用的模板都是经过 测序确认过的1896位点不发生突变的HBV DNA片段的质粒，其中浓度最高的 模板约为1.0xl06copies/ml，浓度最低的模板约为1.0xl02copies/ml。
图4显示HEX标记的野生型探针的特异性检测结果。所用的模板都是经过测 序确认过的含G1896A突变的乙型肝炎病毒DNA。
图5显示野生型和G则6A突变型乙型肝炎病毒DNA杂合模板中突变模板的灵 敏度检测结果。所用的杂合模板是把血清中乙型肝炎病毒DNA浓度都为 1.0xl07copies/ml的G1896A突变的模板和1896位点不发生突变的野生型模板按 v/v分别为100:0、 50:50、 25:75、 10:90、和5:95的比例混合而成，各杂合比例 的模板扩增曲线依次是图中按从左到右顺序排列。
图6显示野生型和Gi896A突变型乙型肝炎病毒DNA杂合模板中野生模板的灵 敏度检测结果。所用的杂合模板是把血清中乙型肝炎病毒DNA浓度都为 1.0xl07cOpieS/ml的1896位点不发生突变的野生型模板和G1896A突变的模板按
v/v分别为100:0、 50:50、 25:75和10:90比例混合而成，各杂合比例的模板扩增
曲线依次是图中按从左到右顺序排列。 图7显示33例含乙型肝炎病毒DNA的临床血清的G1896A突变的荧光PCR检
测结果和测序结果的比较。所用血清的HBVDNA拷贝数是用英科新创(厦门)
科技有限公司的HBV DNA荧光PCR定量检测试剂盒定量的。具体拷贝数如
"3.65E+08"实际上是指被检标本中含3.65xl08copies/ml的HBVDNA。
发明的
具体实施例方式
实施例1:临床血液标本中乙型肝炎病毒DNA的提取
从临床血液标本中取出50/xl血清到一高压过的1.5ml的离心管中，加入25pl 提取液A (40%PEG-8000)，振荡混匀5s， 12，500g离心5min;弃上清，加25/il 提取液B (0.25MNaOH)，振荡15s，使沉淀尽量溶解，96'C裂解10min;加提 取液C (0.4MTris-HCl缓冲液，pH6.4) 25pd，混匀，96°C 10min; 12，500g离 心15min，取5/il上清进行PCR扩增。
实施例2:靶核酸的PCR扩增
在一 PCR反应管中加入单人份的PCR反应混合液，再加入0.2/il的酶混合液， 最后再加入5/xl模板(待检模板或阴阳性对照品)，充分混匀后稍稍离心(约5 秒)。然后将反应管放入荧光PCR仪(能检测到FAM和HEX的PCR仪)，按下 列条件扩增50°C 120秒(1个循环)~~ 95°C 180秒(1个循环)~~ 95°C 10秒，56'C30秒(40个循环)，其中56'C是检测荧光的温度。
所使用的PCR扩增体系中包括2.5jd 10xPCRbuffer (850mMKCl， 400mM Tris-Cl, pH8.9， 50。/。v/v甘油)、0.2/il酶混合液、0.2/nl dUTPs (含dATP、 dUTP、 dGTP、dCTP各25mM)、正反向两条引物(SEQIDNO:l和SEQ IDN0:2， 100/iM) 各0.1/xl、野生型和突变型分子信标探针(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4， 100pM) 各0.1/a1、 25mMMgCl2 1.5/il和5/il模板，最后补水到25/il。
实施例3:乙型肝炎病毒DNAG1896A突变的灵敏度和特异性检测
以含G1896A突变的乙型肝炎病毒DNA片段的质粒 (1.0xl06copies/ml-1.0xl02copies/ml)为模板，使用本发明的试剂对乙型肝炎
病
毒DNAG化96A突变的灵敏度进行检测，检测结果参见图l。从图l的结果可 以看出，本发明的方法和试剂盒至少可以检测到模板浓度仅为1.0xl02COpieS/ml 的G^6A突变的乙型肝炎病毒DNA。换句话说，就是本发明的灵敏度完全可以 符合临床的需求。
再以16个1896位点不发生突变的野生型的乙型肝炎病毒DNA (约 1.0xl06cOpieS/ml)为模板，使用本发明的试剂对FAM标记的突变型探针的特异 性进行检测，检测结果参见图2。从图2的结果可以看出，本发明的方法和试剂 盒中的FAM荧光标记的突变型探针对1896位点不发生突变的野生型乙型肝炎 病毒DNA的检测结果均为阴性。也就是说，本发明中FAM标记的突变型探针 的特异性可以符合临床的需求。
实施例4:野生型乙型肝炎病毒DNA的灵敏度和特异性检测 以1896位点不发生突变的乙型肝炎病毒DNA片段的质粒 (1.0xl06copies/ml-1.0xl02copies/ml)为模板，使用本发明的试剂对野生型乙型 肝炎病毒DNA的灵敏度进行检测，检测结果参见图3。从图3的结果可以看出， 本发明的方法和试剂盒至少可以检测到模板浓度仅为1.0xl02CopieS/ml的野生型 乙型肝炎病毒DNA。换句话说，就是本发明的灵敏度完全可以符合临床的需求。 再以16个G^96A突变的乙型肝炎病毒DNA (约1.0x106copies/ml)为模板， 使用本发明的试剂对HEX标记的野生型探针的特异性进行检测，检测结果参见 附图4。从图4的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒对Gw6A突变的乙型肝 炎病毒DNA的检测结果均为阴性。也就是说，本发明中HEX标记的野生型探 针的特异性可以符合临床的需求。
实施例5:野生型和突变型杂合模板的灵敏度检测
把血清中乙型肝炎病毒DNA浓度都为1.0xl07copies/ml的G1896A突变的模 板和1896位点不发生突变的野生型模板按v/v分别为100:0、50:50、25:75、 10:90、 和5:95的比例混合而成，再以各比例的混合好的标本为模板，用本发明的试剂 进行杂合模板中突变模板的灵敏度检测，检测结果参见图5。
再把临床血清中乙型肝炎病毒DNA浓度都为1.0xl07copies/ml的1896位点 不发生突变的野生型模板和G1896A突变的模板按v/v分别为100:0、 50:50、 25:75 和10:90比例混合而成，再以各比例的混合好的标本为模板，用本发明的试剂进 行杂合模板中野生模板的灵敏度检测，检测结果参见图6。
从图5和图6的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒至少可检测到野生和 突变杂合模板中只占5%01896八突变或10%野生的模板，灵敏度远大于测序(测 序对杂合模板的检测灵敏度一般是20%以上)。
实施例6:临床血清标本的检测
使用本发明的方法和试剂盒，对33份含乙型肝炎病毒DNA的临床血清标本 进行检测，其中8例为纯合突变，19例为纯合野生，6例为杂合体。为了进一步 证实本发明方法的准确性，我们对上面33份标本的PCR产物进行序列测定，结 果表明，使用本发明的试剂盒对纯合模板的检测结果和测序结果完全吻合；而对 杂合模板的检测结果更完美，因为它能把野生和突变扩增结果都显示出来，而测 序只能显示杂合模板中的一种结果(具体结果参照图7)。可见本发明的方法和 试剂盒完全可以满足临床检测的需要。
序列表
<110>英科新创(厦门)科技有限公司
<120>检测乙型肝炎病毒DNA及其G1896A突变的方法及试剂盒
<140> <141> <160>2 <210> 1 <211>19 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 1
TCCAAGCTGT GCCTTGGGT
<210> 2 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 2
AAGGCAAAAA AGAGAGTAAC TCCACA
<210> 3 <211>24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400> 3
CAACGCTTTA GGCCATGGAC GTTG
<210> 4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400> 4
CAACGCTTTG GGCCATGGAC GTTG
权利要求
1.一种利用锁核酸和分子信标结合的技术来检测临床血液标本中野生型和G1896A突变型乙型肝炎病毒DNA的方法。该方法包括以下步骤(1)从待检血液标本中提取病毒DNA；(2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信标探针(探针都属于锁核酸LNA，即Locked Nucleic Acids)，对提取的病毒DNA进行实时PCR以扩增包含1896位点的靶DNA片段，并对野生型和G1896A突变型的乙型肝炎病毒DNA进行检测；(3)根据实时PCR的扩增曲线，分析并判断标本中乙型肝炎病毒DNA是野生型的还是G1896A突变型的。
2. 根据权利要求l的方法，其中待检DNA扩增所用的正向和反向引物分别是(1) 5' -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)(2) 5'-AAGGCAAMAAGAGAGTMCTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)并且实时PCR反应中所用的野生型和Gi896A突变型的分子信标探针(都属于LNA)分别是(3) 5， -FAM-CAACGCTTT@GCCAgGGACGTTG-DABCYL-3' (SEQ ID NO:3)(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4)其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
3. 根据权利要求l的方法，其中所说的实时PCR扩增所用的程序是50°C 120 秒(1个循环)~~ 95°C 180秒(1个循环)^ 95°C 10秒，56°C 30 秒(40个循环)。其中56-C是检测荧光的温度。
4. 根据权利要求1的方法，其中所说的待检血液标本是指含有乙型肝炎病毒DNA的血液标本。
5. 根据权利要求2的方法，其中所说的野生型分子信标探针是用来检测血液标 本中野生型的乙型肝炎病毒DNA，而突变的分子信标探针是用来检测血液标 本中G朋6A突变的乙型肝炎病毒DNA。因为野生型和突变型探针中都有碱基 是进行LNA化的，从而使得本发明的方法检测的灵敏度和特异性比常规的实 时PCR都相对有所增强。其中前者5'端标记有F細荧光基团，3'端标记有 DABCYL淬灭基团；而后者的5'端则是标记HEX荧光基团，3'端也是标记 DABCYL淬灭基团。
6. —种利用锁核酸和分子信标结合的技术来检测野生型及G朋6A突变型的乙型 肝炎病毒DNA的试剂盒，该试剂盒包括(1)血液标本中乙型肝炎病毒DNA提取试剂；(2)聚合酶链反应混合液；(3)酶混合液；(4)突变型阳性对照；(5)野生型阳性对照；(6)阴性对照。其中(1)由提取液A、提取液B和 提取液C组成；(2)由10XPCR buffer、 dUTPs、正反向两条引物、野生型 和突变型分子信标探针等组成；(3)由普通T叫酶和UNG酶组成；(4)是经 过测序确认过的含G^6A突变的HBVDNA片段的质粒；(5)是经过测序确认 过的含1896位点不发生突变的野生型HBVDNA片段的质粒；(6)是高压灭菌 水。
7. 根据权利要求6的试剂盒，其中用于聚合酶链反应的正向和反向引物分别是(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)。
8. 根据权利要求6的试剂盒，其中用于聚合酶链反应的野生型和突变型分子信 标探针分别是(3) 5， -FAM-CAACGCTTT@GCCA@GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-MBCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框标记的碱基是进行LNA化的。
全文摘要
本发明涉及野生型和G₁₈₉₆A突变型的乙型肝炎病毒DNA的检测方法和试剂盒，特别是涉及使用锁核酸(LNA，Locked Nucleic Acids)和分子信标探针结合的技术以及实时PCR方法来检测野生型和G₁₈₉₆A突变型的乙型肝炎病毒DNA的方法及用于完成该检测的试剂盒。本发明的方法可以特异且灵敏地检测出临床血液标本中的野生型和G₁₈₉₆A突变型的乙型肝炎病毒DNA。
文档编号C12Q1/70GK101338343SQ20071012956
公开日2009年1月7日 申请日期2007年7月3日 优先权日2007年7月3日
发明者宋庆涛, 蔡剑英 申请人:英科新创(厦门)科技有限公司