药效试验
方法:采用C57BL/6近交系小鼠分别经X-ray (2.8Gy,剂量率为1.35Gy min-1，距离170cm)照射建立辐射免疫损伤模型，采用流式细胞术和RT-PCR等方法，观察辐射对胸腺细胞分化发育和成熟T细胞亚群分化的影响及其本发明的保护效应。通过检测胸腺细胞凋亡状态、凋亡相关基因(bcl2/bax，caspases)的表达、特异性表型分子组成(CD4+SP，CD8+SP，CD4+CD8+DP)、胸腺树突状细胞表型特征以及细胞间信号分子(LFA-1，ICAM-1)、外周免疫器官Tn/TEM/TCM、Thl/Th2/Thl7/Treg等亚群及其细胞因子分泌模式以及应对辐射的变化状态、本发明的逆转效应等。
[0014](I) X射线辐照小鼠模型:选用健康C57BL/6近交系小鼠21只，随机分为3组(每组7只):阴性对照组与照射模型组小鼠自由摄食饮水；实验组，服用本发明实施例1制备药物，连续饮用10天后，采用X射线全身照射，距离170cm.总剂量为3.0Gy ;继续服用7?10天后，处死各组小鼠，分离小鼠外周血、脾脏、骨髓、胸腺等免疫器官单个核细胞，检测Tn、TCM, Tem, Thl、Th2、Thl7、Treg等T细胞亚群增殖分化状态。
[0015](2)肿瘤模型小鼠:采用健康C57BL/6近交系小鼠21只，随机分为3组(每组7只):阴性对照组与照射模型鼠自由摄食饮水；本发明实验组，连续饮用10天后，采用X射线全身照射，距离170cm.总剂量为3.0Gy;照射第三天，小鼠尾静脉注射B16小鼠黑色素瘤细胞(2X 105/300μ1/只)，继续连续服用中药制剂，10天后按常规方法处死小鼠，检测肺脏肿瘤负载量(肿瘤克隆数)，分离小鼠外周血、脾脏、骨髓、胸腺等免疫器官单个核细胞，检测Τη、TCM、TEM、Thl、Th2、Thl7、Treg等T细胞亚群增殖分化状态。
[0016]结果:
1.本发明制剂对辐射模型胸腺细胞凋亡的保护作用:
T细胞作为免疫系统的主体细胞群，是辐射诱导的整体免疫力下降中的主角。胸腺作为扩充外周T细胞库的能源储备中枢，是保护机体免疫实力的重要措施之一。实验组(OCT)可降低胸腺细胞凋亡率，提高胸腺基质细胞抗原递呈分子(1-Ad)的表达能力，促进CD4+CD8+DP活化，提高胸腺DP细胞的生存力，增强细胞间的信息传递，为T细胞的分化发育和成熟提供微环境保障。结果如图1和图2所示。
[0017]对辐射后Tn/Tm细胞重建的调节作用特征:
实验同步观察了实验组中药制剂针对淋巴器官T细胞亚群Tn/TEM/TCM，发现实验组可有效保护Tn成熟分化，提高在淋巴器官的分布能力，为效应性T细胞的活化提供资源。T细胞在辐射后免疫重建期，Tem是重建能力较快的一群细胞，OCT对这个亚群细胞具有选择性促进作用，而对具有免疫惰性的Tai发挥相对的抑制作用(结果见图3)。
[0018]优化剂对免疫重建过程中效应性T细胞亚群细胞因子分泌能力的影响:在辐射损伤后，Th2类细胞亚群没有显著改变，而参与抗肿瘤、抗病毒的Thl类细胞因子显著下降，这是辐射后T细胞功能下降的重要原因。实验组OCT对辐射诱导的T细胞分泌IFNg的能力下降具有显著的保护作用(图4A)。Thl7细胞亚群在辐射后免疫重建过程中比例和数量明显升高，OCT对这群细胞的重建具有限制作用(K0.05，图4B)。Treg细胞亚群在辐射损伤后免疫重建过程中比例明显高于正常对照，OCT中药制剂可下调Treg的增殖(K0.05，图4C)。
[0019]促进放射后NK细胞的增殖与活化
NK细胞作为天然免疫的主要细胞群在抗肿瘤、抗病毒免疫反应过程中扮演了重要角色，有研究证明，T细胞亚群特别是Tem的活化可以促进NK细胞的增殖与功能。OCT制剂在促进辐射小鼠Tem重建时，对NK细胞产生如何影响，也是我们探讨的关键问题之一。研究发现，虽然照射后NK比例没有显著变化(图5A)，NK分泌IFNg的能力明显下降。随着OCT促进Tem的修复，OCT处理组NK细胞比例明显升高，并且NK分泌IFNg的能力明显增强(K0.01 图 5B)。
[0020]保护放射免疫损伤的抗肿瘤效应
以上结果显示OCT中药制剂可优势提高辐射后免疫衰老小鼠Tn、TEM以及效应性T细胞Thl等细胞亚群和NK的免疫重建，这些细胞亚群的优势修复能力，是否能够改善辐射后免疫衰老小鼠抵抗肿瘤转移的作用，为进一步验证这一结果，我们为辐射后小鼠尾静脉注射Β16黑色素瘤细胞，并同步喂饲OCT制剂，发现小鼠经该制剂处理后，对X射线照射有明显的保护作用，其肺脏肿瘤转移克隆明显减少，如图6。
[0021]结论:OCT促进放射后T细胞在胸腺的分化发育，扩充辐射后外周免疫器官初始T细胞含量，补充T细胞亚群分化能源，并且对T细胞亚群的分化和功能紊乱有平衡调节作用:可选择性促进Tn/TEM、Thl等亚群和NK细胞的免疫重建，有利于机体抗肿瘤、抗病毒、抗感染的免疫重建，这以结果可以使该制剂成为新的免疫增强剂，临床用于放疗的免疫防护和免疫重建促进剂，防治肿瘤转移等免疫低下相关疾病具有重要的临床应用价值。
【主权项】
1.一种防治免疫衰老的中药配方，其特征在于，由以下重量份药物制备而成:熟地6-600、石解5?500,山药5?500,枸祀5?500、山莱英4?400、英丝子6?600、杜仲4?400、肉桂3?300、当归3?300、黄芪6-600、白芍5-500、玉竹5-500、川芎5-500。
2.根据权利要求1所述的中药配方的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:取以上各味混合，经水漂洗后加入10倍体积75%乙醇，浸泡2h，回流煎煮1.5h，滤取药液，药渣加入10倍体积50%乙醇，回流煎煮1.5h，滤取药液，合并药液，80°C减压浓缩回收乙醇，收集醇提清膏，得乙醇提取物；药渣加入10倍体积水，煎煮1.5h，，滤取药液，浓缩成膏，合并乙醇与水提醇沉提取物，制成膏剂、水剂、颗粒、糖浆等，使含生药1.92g/ml。
【专利摘要】本发明提供了一种防治免疫衰老的中药配方，由以下重量份药物制备而成：熟地6-600、 石斛5～500，山药5～500，枸杞5～500、山茱萸4～400、菟丝子6～600、杜仲4～400、肉桂3～300、当归3～300、黄芪6-600、白芍5-500、玉竹5-500、川芎5-500；同时，本发明还提供了其制备方法；本发明可以在提高脾脏、胸腺等淋巴器官指数和NK、NKT细胞活性的同时，可靶向促进T细胞亚群中Tn与Th1类亚群的活性，可防治T细胞免疫衰老和促进放疗后T细胞免疫重建。
【IPC分类】A61P37-04, A61K36-8984
【公开号】CN104689088
【申请号】CN201510110467
【发明人】姚成芳, 郭钰琪, 王丽, 李霞, 张洪海, 郑晓丹
【申请人】山东省医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月13日