4-硫-5-噻吩基尿苷在抗黑色素肿瘤细胞中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及4-硫-5-噻吩基尿苷的新用途，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002]恶性黑素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤。皮肤黑素瘤表现为色素性皮损在数月或数年中发生明显改变。虽其发病率低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高，因此早期诊断、早期治疗很重要。恶性黑素瘤大多发生于成人，巨大性先天性色素痣继发癌变的病例多见于儿童。黑色素肿瘤是常见的发生于多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜。近年来，我国黑色素肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势。如何有效控制及治疗黑色素肿瘤是一个比较热门的课题，早期恶性黑色素瘤的治疗以手术切除为主，晚期转移性黑色素瘤的治疗尚缺乏有效的治疗手段。
[0003]含有巯基的嘧啶环系列化合物具有抗癌活性和免疫增强作用，硫原子较氧原子的外层电子的不同，硫原子的3p电子受原子核的束缚比氧原子的2p电子小，离域后与大环上的电子共轭，使共轭效应增强；硫原子上的电子可通过3p — 3d跃迀，硫原子3p轨道的电子比氧原子中2p轨道的电子的能级高，而硫原子的3d轨道能级比羰基C = O的2 *轨道提高不多，故硫羰基C = S的3p — 3d跃迀所需能量小，有利于3p电子的激发，含有硫羰基的核苷类化合物嘧其4-位羰基氧被硫取代后吸光度变大，最大吸收峰红移，对光及其敏感。噻吩作为重要的含硫五元杂环化合物，尤其在抗癌方面，其噻吩衍生物同样具有良好的生物活性。近期文献报道，噻吩环作为苯环的生物电子等排体，比苯基同系物具有更好的治疗效果，显示出具有较高的合成价值。噻吩为富电子芳环，电荷密度大于苯环，在生物体内更易发生JT-JT相互作用，而且噻吩中的硫原子具有一定的亲核性，易与亲电性的受体发生相互作用或与金属或金属离子配位，正因如此，我们把含有巯基的嘧啶环系列化合物和噻吩环的特点结和到同一个化合物中，即将噻吩环应用于药物合成中与药效团相连所得的新化合物，可望改善药物的药代动力学性质，降低药物的毒副作用，增强药物靶向性，提高治疗指数。研宄含有噻吩环的硫碱基的核苷酸衍生物抗肿瘤方面具有非常重要的意义。
[0004]现有技术中已报道的4-硫-5-噻吩基尿苷有多种药理作用，其中，关于癌症的治疗用途中尚未有其关于黑色素肿瘤的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种4-硫-5-噻吩基尿苷的新用途。
[0006]本发明提供4-硫-5-噻吩基尿苷在制备治疗黑色素肿瘤的药物中的应用。
[0007]所述的4-硫-5-噻吩基尿苷可阻断黑色素肿瘤细胞A375细胞的有丝分裂抑制其增生，诱导细胞凋亡。
[0008]所述的4-硫-5-噻吩基尿苷对肿瘤细胞的作用有较强特异性。
[0009]由构效关系研宄表明，对5-取代胸苷的类似物，在碱基C-5位上具有吸电子基或能与杂环共轭的基团时，形成波长较长核苷类化合物，由于不同结构的含有硫羰基的核苷类化合物展现了不同的生理活性，这类化合物都具有较高的生物活性。
[0010]本发明的有益效果是:4_硫-5-噻吩基尿苷对人黑色素肿瘤细胞A375作用可阻止细胞有丝分裂进程，从而发挥抑制肿瘤细胞增生的作用。4-硫-5-噻吩基尿苷对正常人成纤维细胞其敏感性低于肿瘤细胞，这说明4-硫-5-噻吩基尿苷的抗肿瘤作用具有强特异性，具有潜在的临床应用价值，在人体黑色素肿瘤治疗方面有很好的应用前景。
[0011]本发明通过4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷的药理实验对其应用进一步详细说明。
【附图说明】
[0012]图1为4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷的分子结构；
[0013]图2为4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷的紫外谱图；
[0014]图3为不同浓度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷处理人黑色素肿瘤细胞抑制作用；
[0015]图4为不同浓度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷和5-氟尿嘧啶(5-FU)对人黑色素肿瘤细胞抑制作用；
[0016]图5为不同浓度的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷细胞周期实验；
[0017]图6为4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷对A375细胞周期的影响；
[0018]图7为不同浓度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷处理小鼠黑色素肿瘤细胞抑制作用；
[0019]图8为不同浓度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷处理成纤维细胞MTT掺入实验。
【具体实施方式】
[0020]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0021]如无特殊说明，本发明所涉及试剂均市售可得，以下实施例优选采用:碘化丙啶、醋酸购自于sigma公司；三氯乙酸购自上海生工生物公司；Trypsin，MTT购自于生工生物公司；双三苯基磷二氯化钯，2-(三丁基锡烷基)噻吩和尿嘧啶核苷等试剂均为市售品；人黑色素肿瘤细胞系A375细胞和小鼠黑色素瘤细胞B16-F1均购自南京凯基生物公司；DMSO购自上海生工生物有限公司，用于药品的溶解。
[0022]如无特殊说明，所用设备均为常规选择，本发明所用设备包括:薄层色谱用硅胶GF254为青岛海洋化工厂产品；净化工作台为苏州净化公司产品，水套式CO2孵育箱由美国shellab公司制造；微孔板分光光度计为上海元析仪器有限公司制造，流式细胞仪为美国BD公司产品；熔点用X-4数显型熔点仪测定(巩义市英峪予华仪器厂)，温度未校正；IR测定用Nicolet 550智能傅立叶红外光谱仪(赛默飞世尔科技)；紫外-可见分光光度计为JASC0-UV560 ;核磁共振光谱仪，NMR用BrukerAC P400型核磁共振仪测定。
[0023]本发明所制备的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷采用申请号为201310374980.7，发明名称为:含硫尿苷抗癌药物和中间体及合成方法的专利申请文件中涉及的制备方法制备所得。
[0024]实施例1 4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷对人黑色素肿瘤细胞(A375)和小鼠黑色素肿瘤细胞(B16-F1)的增殖抑制试验
[0025]1.细胞培养
[0026]将B16-F1和A375分别用含10 % (V/V)热灭活胎牛血清和抗生素(青霉素)100yg/ml，链霉素100 μ g/ml的DMHM和RPMI1640培养液中，在37°C，5% CO2培养箱中孵育。根据细胞密度，每2-3天换新鲜培养基一次。B16-F1和A375均为贴壁生长的肿瘤细胞，细胞传代用0.25%的胰蛋白酶消化，按1:3-4的比例扩增。
[0027]2.细胞增生率测定(MTT实验)
[0028]取对数生长期细胞，将B16-F1和A375分别接种于平底96孔板细胞培养板，每孔100 μ I，含I X 14个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，设置三个复孔，37°C,5% CO 2培养过夜。次日分别用DMEM和RPMI1640完全培养液稀释4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷药物，浓度为药物终浓度的2倍，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每孔100 μ 1，每个浓度设三个复孔。
[0029]对照孔只加100 μ I细胞培养液。加药后，各孔总体积为200 μ 1，4硫尿苷的药物终浓度分别为100 μ Μ，200 μ Μ，300 μ Μ，400 μ Μ，500 μ Μ。加药后，细胞继续培养48小时。细胞培养结束前4小时，向各孔加入20 μ I MTT溶液(5mg/ml，PBS稀释)。培养结束后，轻轻甩弃各孔培养液，并将培养板倒扣于纸巾轻拍数次，以去除各孔残留液体。然后向每孔加入100 μ IDMSO溶液以溶解细胞内沉淀的MTT代谢产物，用微孔板分光光度计测定波长570ηΜ的吸光度(OD)。细胞增生率=(各药物处理孔OD值/对照孔OD值)XlOO %。
[0030]试验结果如下:
[0031](1)4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷对A375的生长具有抑制作用
[0032]4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷是一种新合成的化合物，它对肿瘤细胞的作用尚无报道，因此首先通过MTT掺入实验观察不同剂量的4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷对A375的影响。用剂量范围在100-500uM的4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷处理A375，48小时后检测MTT代谢产物。图3为用药物浓度处理A37548小时，通过MTT掺入实验测定各组细胞的OD值并计算细胞增生率。如图所示，与未加药物的对照组比较，4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷在10uM/L浓度时对A375细胞的增