一种层层自组装的小口径组织工程血管及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程技术，具体是关于一种纳米颗粒修饰的层层自组装生物人工血管及其构建方法。
【背景技术】
[0002]近几年，心血管疾病的发病率以及死亡率逐年升高，每年有大量的病人需要进行旁路移植手术，因此临床上对于直径小于6mm的组织工程血管需求量很高。但是小口径组织工程血管常常由于血栓形成以及内膜增生而导致移植手术失败。大量的研宄表明内皮细胞具有抗血栓、抑制血小板的聚集和平滑肌细胞病理性增殖的功能，因此组织工程血管的早期快速内皮化是维持小口径组织工程血管移植后通畅的一个十分重要的因素。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，在缺血或者血管受损的情况下，可以从骨髓动员并归巢到相应部位，促进血管内皮的修复以及血管生成。因此，在组织工程血管的构建中选择合适的分子促进干细胞的动员，并能选择性的捕获血液中的内皮祖细胞是提高组织工程血管通畅率的一个重要研宄靶点。
[0003]科学家通过在组织工程血管的内表面涂层抗体或者蛋白特异性捕获血液循环中的内皮祖细胞，在早期取得了较好的通畅效果。然而在移植后期出现了不同程度的内膜增生，甚至堵塞。宄其原因，主要是因为组织工程血管内表面涂层的药物缓释时间较短，不能长时程的发挥功能。在移植后期药物释放完毕后，组织工程血管的局部微环境不适合归巢的内皮祖细胞的生存，但是可以刺激平滑肌的病理性增生。组织工程血管移植后都面临着高剪切力和高冲刷力的力学刺激，同时能快速的将物质推送到全身各个部位。因此对控释材料的安全性和稳定性具有特别高的要求。腺苷是一种内源性核苷，具有细胞保护和促进血管生成的作用。我们的研宄发现腺苷可以促进内皮祖细胞动员归巢、促内皮祖细胞旁分泌和抑制平滑肌的病理性增殖等。然而目前还没有一种既安全又能稳定控制腺苷的释放，还能适合血液循环系统这个特殊环境应用的控释体系。
[0004]环糊精的研宄经历了一百多年的时间，现已广泛的用于医药和生物技术等行业。β -环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，外侧由羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区，可以包裹各种化合物，具有很好的药物控释和生物可降解性等特点。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以通过氨基和羟基与腺苷或受体活化药物结合，目前也已经作为一种材料应用于药物制剂。研宄表明环糊精和壳聚糖能够形成一个稳定的结合物，相对于单独的环糊精或者壳聚糖能更长时程的控制药物释放。
【发明内容】
[0005]本发明主要是针对现有技术的不足，提供一种能长时程控制药物释放，在早期在体动员和捕获内皮祖细胞的组织工程血管，促进血管快速内皮化，移植后期抑制内膜增生和血管狭窄，主要用于血管的取代治疗和冠状动脉搭桥。为实现本发明的上述目的而采用的技术方案，即构建一种能长时程控释又能促进早期快速内皮化的组织工程血管，其采用如下方法构建:
(I)控制药物释放的纳米缓释颗粒的制备:筛选具有内皮祖细胞动员捕获功能和微环境优化功能的药物，如腺苷及其Al，A2b, A2a, A3四个受体的激动剂等，筛选以及修饰合适的化合物，检测其对人体的安全性和不良反应。具体为??每80-100mg的β -环糊精与20-30mg的腺苷或腺苷A2a受体激动剂或腺苷Al受体激动剂或腺苷A2b受体激动剂或腺苷A3受体激动剂溶于20-30ml的去离子水中，获得溶液I ;每60_80mg的壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，获得溶液II ;按照溶液II与溶液I 3-5:1的比例混合，离心分离，获得纳米缓释颗粒。
[0006](2)组织工程血管基质的构建:用异种或同种血管或皮肤组织提取胶原，然后去除胶原中的抗原，获得生物相容性良好的胶原；保留胶原的天然网状结构。
[0007](3)血管的编织:将所述胶原和弹性材料按重量百分比60?80%:20?40%用电纺丝纺织方法编织血管支架；或将所述胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比50?70%:12?18%:1?5%:15?35%用电纺丝纺织方法编织血管支架；或采用人工合成材料编织血管支架。
[0008](4)层层自组装方式构建组织工程血管:将所述纳米缓释颗粒与所述血管支架孵育24-48小时，充分洗涤后，继续用纳米缓释颗粒孵育24-48小时，PBS洗三次；然后用腺苷或腺苷A2a受体激动剂直接孵育24小时，PBS洗三次；再用EDC或者SPDP交联24小时；获得层层自组装的工程血管。
[0009]本发明获取的人源性生物胶原已去除抗原性，可控降解，可原位成型。具有良好的生物相容性，较好的力学性能。胶原是血管细胞外基质主要成分，同时胶原的三维空间结构具有较好的强度，是组成血管的重要成分。用于构建生物人工血管的胶原，在保持三螺旋结构的同时去除其抗原点一尾肽。这种材料为天然生物材料，来源广泛，无毒性，降解产物可被机体吸收，不对机体产生危害，制作简便，易于塑形，并在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。
[0010]生物血管支架本身具有良好的细胞诱导性，进一步复合表面修饰物质后，为种子细胞粘附、增殖、分化、迀移及发挥抗凝血等功能提供较好的微环境。本发明中血管腔表面修饰有以下优点:实验表明一方面在移植早期表征的分子可以释放入血，进入骨髓促进内皮祖细胞的动员，同时表征在血管表面的分子可以通过受体-配体结合的方式捕获循环中增多的内皮祖细胞；另一方面血管表征的纳米材料可以长时程的控释分子的释放，促进局部微环境的优化，达到长时程通畅的功能。这种方法在早期促进快速内皮化的同时，同时还能优化局部的微环境。尚未有这些设想或实验结果的报道。
【具体实施方式】
[0011 ] 下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。
[0012]1、纳米缓释颗粒的制备:80-100mg的β -环糊精与20_30mg的腺苷等药物溶于20-30ml的去离子水中，室温搅拌24-48h。60_80mg的壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，搅拌均匀后，搅拌均匀后，缓慢加入1_3%ΤΡΡ溶液l_2ml，继续室温搅拌2_8个小时。按照壳聚糖溶液与β -环糊精与腺苷溶液3-5:1的比例混合，继续搅拌2-4小时后，20000g/min，4度下离心分离，蒸馏水洗三遍后，冷冻干燥。扫描电镜检测纳米缓释颗粒的形态，红外波谱扫描检测其包裹情况，结果可见纳米颗粒包含其中一个波峰与样品扫描波峰一致，说明纳米颗粒包含了相关样品，而对照组不含相应波峰。
[0013]2、组织工程血管基质的构建:在无菌条件下，取动物颈总动脉，用生理盐水将血液冲洗干净。在37°0，5%0)2条件下用0.15%的胰酶消化40-180分钟。用RNA酶，DNA酶、脂肪酶去除核酸和脂肪，得到去除细胞和细胞外基质而保留血管胶原纤维和弹力纤维的血管基质材料。将8-12 mg/ml的胶原溶液孵育已经制备好的血管基质材料24小时，之后用5-20 mM京尼平或EDC对孵育了胶原的血管基质材料进行交联，时间为24-48小时，然后用PBS清洗3-5次。用电纺丝纺织方法将获得的胶原和弹性材料复合，按重量