可复制型双质粒抗肾癌dna疫苗及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，涉及一种抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗及其构建方 法与应用。
【背景技术】
[0002] 肾细胞癌是成人肾脏肿瘤中最常见的一种类型，大约占到成人恶性肿瘤的3%，占 所有肾脏肿瘤的80%，是泌尿系肿瘤中致死率最高一种肿瘤。当肿瘤组织局限在肾实质时， 肾细胞癌的预后相对较好，5年生存率为70-80%，对于这类病例，部分或根治性手术是主 要的治愈性治疗方式。然而当肿瘤组织发生局部或远处转移，即进展为转移性肾癌时，预后 就相对较差。这是因为肾细胞癌是一种"惰性肿瘤"，对一些传统的治疗方式，比如化疗和 放疗都不敏感，IFN和IL-2细胞因子治疗后中位生存期也只有13个月，没有获得理想的疗 效，预后相对较差。临床上20-30%的肾癌患者在初次诊断时已经发生了转移，并且大约有 三分之一的局限性肾癌患者最终进展为转移性肾癌。血管内皮生长因子（VEGF)和雷帕霉 素靶蛋白（mTOR)信号通路靶向药物的出现，为医生和患者提供了的新治疗选择。然而这些 药物的治疗效果也存在一定的局限性，有相当一部分的患者服用这类靶向药物后没有获得 相应的临床预期效果。同时，这类药物也存在费用昂贵、有短期和长期毒性等缺点。因此， 传统的治疗方法在克服肿瘤复发和转移方面有很大的局限性，成为肿瘤治疗的瓶颈。对于 转移性肾细胞癌的治疗仍然是一个棘手的问题，仍然需要进一步的研宄。
[0003] 在Edward Anthony Jenner发现牛痘疫苗一个世纪以后，德国医生Paul Ehrlich (1854-1915)和美国医生 William Bradley Coley (1862-1936)最早提出了肿瘤疫 苗的概念。二十世纪九十年代中期，治疗性疫苗概念的被正式提出，各种研宄和开发工作也 广泛开展起来。肿瘤治疗性疫苗目前是治疗性疫苗研发中的"重中之重"。它够激活机体免 疫系统，产生特异性抗肿瘤效应，一方面有利于清除外科手术后残留的肿瘤细胞，另一方面 能够产生免疫记忆，防止肿瘤复发与转移。
[0004] 肿瘤疫苗是一种肿瘤主动免疫治疗方式，通过接种使得机体获得一种内源性的抗 肿瘤免疫应答反应。这种免疫应答可以是特异性的，针对选定的一些特定肿瘤抗原；也可以 是非特异性的，免疫应答并不针对某种特定的抗原，例如全肿瘤细胞疫苗。肿瘤疫苗主要分 为肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗、肽疫苗和基因疫苗四种类型，基因疫苗根据载体的不同可 以分为细菌载体基因疫苗、病毒载体基因疫苗和裸质粒DNA疫苗。
[0005] 近年来肿瘤DNA疫苗的研宄得到了广泛关注，逐渐成为肿瘤免疫治疗领域的研宄 热点。大量的研宄发现，肿瘤DNA疫苗与其它类型肿瘤疫苗相比，具有一定的优势。第一， DNA疫苗免疫机体后与病毒感染过程相似，在宿主细胞内进行转录翻译，表达抗原蛋白，分 泌到细胞外，或在细胞内修饰后通过MHC I途径递呈至抗原递呈细胞（APCs)，进一步激活 体液和细胞免疫应答。第二，DNA疫苗更加安全且产生的靶抗原特异性更强。与之相比，病 毒载体基因疫苗则会引起机体产生针对外源性病毒蛋白的免疫反应，从而产生针对疫苗的 排斥，不能多次应用，降低了疫苗的效果。第三，电穿孔技术的应用使DNA疫苗的表达效率 的得到了极大地提高。电穿孔使细胞膜在瞬间出现多个孔道，增加了质粒DNA的导入量，使 肌肉或真皮内注射的质粒DNA能够更多地被肌肉细胞、角化细胞、单核细胞和树突状细胞 (DCs)摄取。第四，DNA疫苗构建更加简单，生产和加工过程更加简便。
[0006] DNA疫苗成功的关键是如何打破免疫耐受诱发高效的免疫应答，并且同时避免产 生自身免疫损伤。
【发明内容】
[0007] 本发明针对恶性肿瘤治疗中的核心难题"免疫耐受"，基于复制子DNA疫苗载体 PSVK，开展了系统性的免疫增效策略研宄，并成功构建了一种新型的抗肾癌双质粒可复制 型DNA疫苗。
[0008] 本发明的一个目的在于提供一种抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗。其活性成分包 括以下组分：
[0009] 1)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带复合基因 sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7 (简称 G250FGB)的可复制型 DNA 疫苗载体 pSVK-G250FGB， 所述G250FGB复合基因是自5'端至3'端依次由tG250复合抗原基因、人IgG Fc段基 因 （GenBank 号：Z17370)、GPI 基因 （GenBank 号：XM676434)、GM/CSF 基因 （GenBank 号： NM-000758)和B7. 1基因（GenBank号：NM-005191)组成的融合基因，G250FGB复合基因的 结构如图IA所示；
[0010] 2)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因（CAVE) 的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE，所述肿瘤血管复合基因（CAVE)自5'端至3'端依 次由小鼠 VEGFR2胞外区1-4段（肿瘤血管靶抗原）基因（GenBank号：57923,286-1536bp)、 人 IgG Fe 段基因 （GenBank 号：Z17370)基因 、GPI 基因 （GenBank 号：XM676434)、人 IL12A 基因（GenBank号：24430218)和人IL12B基因（GenBank号：24497437)构成，肿瘤血管复合 基因的结构如图IC所示。
[0011] 所述复制子DNA疫苗载体pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0012] tG250复合抗原基因是异种化嵌合抗原基因，同时含有人肾癌抗原G250、猴和鼠 的肾癌抗原CAIX基因，为了打破机体对自身抗原的免疫耐受，采用了分区段异种化抗原 嵌合设计，使同源性较高的区段被异种化抗原代替，从而诱导不同种属间的交叉免疫反 应。具体来讲，tG250抗原基因中自5'端第1-132、169-183、298-513位碱基分别为猴肾 癌抗原 CAIX 基因 （Genebank 号：XM001088481)，自 5' 端第 133-168、247-258、514-897、 1084-1092 位碱基分别为人 G250 基因 ，（Genebank 号：A J010158),而自 5' 端第 184-246、 259-297、898-1083、1093-1131位碱基分别为选取的是鼠肾癌抗原CAIX基因（Genebank号： BC120544)，tG250复合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0013] 所述tG250复合抗原基因与人IgG Fc段和GPI基因融合，然后与GM/CSF基因和 B7. 1基因通过IRES序列相连组成G250FGB复合基因，其中，自5'端第70-201、238-252、 367-582位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因，自5'端第202-237、316-327、583-966、 1153-1161 位碱基分别为人 G250 基因，自 5' 端第 253-315、328-366、967-1152、1162-1200 位碱基分别为鼠肾癌抗原CAIX基因，自5'端第1201-2473位碱基为Fc段基因，自5'端 第2474-2600位碱基为GPI基因，自5'端第2622-3246位碱基为IRES序列，自5'端第 3253-3684位碱基为GM/CSF基因，自5'端第3709-4497位碱基为B7. 1基因，所述G250FGB 复合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0014] 将以pSVK为出发载体构建的携带复合基因 sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称 G250FGB)的重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗命名为pSVK-G250FGB，其核苷酸序列如序列 表中序列4所示，其中，自5'端第7415-11913位碱基为G250FGB复合基因序列。
[0015] 所述肿瘤血管复合基因（CAVE)由小鼠 VEGFR2胞外区1-4段基因与人IgG Fc段 和GPI基因融合，然后与人IL12A和IL12B基因通过IRES序列相连组