血清 (浙江天杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387)Jrypsin(AMRESC0 公司批号：2010/04) ;EDTA(AMRESCO 公司批号：2009/10);PenicillinGSodiumSalt(AMRESC0公司批号：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESO)公司批号：2010382);无水乙醇（南京化学试剂有限公司 批号：080310182) ;MTT(Biosharp批号：0793) ;PBS(实验室自配）；
[0023] 1. 4实验器材：莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMlL);可见-紫外光微孔板检 测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏 净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579);精 密移液器（法国吉尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S); 全自动高压灭菌锅（日本SANK)公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密 实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号： 2001);低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0. 2ym滤器（MILLIP0RE型号： SLGP033RB) ;10cm培养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移 液管、Tips若干。
[0024] 2实验方法：1)KB细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（10cm培 养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰 蛋白酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞 后将其转入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。2)将细胞种 入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180y1，培养板放入细胞培养箱中（37°C，5%C02)常 规培养。3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入壮腰补肾丸溶液，继续培养24h。 4) 24h后加入20yIMTT溶液（5mg/ml，即0. 5%MTT)，继续培养4h。5) 4h后扣板法倒去上 清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物 充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时设置本底（不加细胞， 只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组 设定6个复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率（％) = (对照孔OD 值-给药孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重复3次。
[0025] 3实验结果：MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对 KB细胞增殖抑制有差异（P〈0. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂量 达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0026] 表1壮腰补肾丸对人口腔上皮癌细胞KB增殖抑制影响研宄（X土SD)
[0027]
[0028] 注：与对照组比较，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0029] 4实验结论：壮腰补肾丸可以抑制人口腔上皮癌细胞KB增殖，减少人口腔上皮癌 细胞KB的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种壮腰补肾丸的制备方法，由熟地黄400g、山药200g、泽泻150g、茯苓150g、肉苁 蓉100g、红参100g、麦冬50g、菟丝子100g、车前子50g、菊花100g、远志50g、白术100g、龙 骨100g、牡蛎100g、续断100g、当归150g、黄芪150g、首乌藤50g、合欢50g、五味子50g作为 原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取上述药材加入到CO2超临界萃取器 中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温 度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间150-180min，得超临界萃取物，粉碎成细 粉，过筛，混匀，每100g粉末加练蜜120g制成大蜜丸，制成200粒，每粒重10g。2. 根据权利要求1所述壮腰补肾丸的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带 剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。3. 根据权利要求1所述壮腰补肾丸的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃 取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。4. 根据权利要求1所述壮腰补肾丸在制备抑制人口腔上皮癌细胞KB增殖药物中的应 用，其特征在于壮腰补肾丸由熟地黄400g、山药200g、泽泻150g、茯苓150g、肉苁蓉100g、红 参l〇〇g、麦冬50g、菟丝子100g、车前子50g、菊花100g、远志50g、白术100g、龙骨100g、牡 蛎100g、续断100g、当归150g、黄芪150g、首乌藤50g、合欢50g、五味子50g作为原料药制 成，制备方法为：取熟地黄400g、山药200g、泽泻150g、茯苓150g、肉苁蓉100g、红参100g、 麦冬50g、英丝子100g、车前子50g、菊花100g、远志50g、白术100g、龙骨100g、牡嫩100g、 续断100g、当归150g、黄芪150g、首乌藤50g、合欢50g、五味子50g，加入到CO2超临界萃取 器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa， 温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间150-180min，得超临界萃取物，粉碎成 细粉，过筛，混匀，每100g粉末加练蜜120g制成大蜜丸，制成200粒，每粒重10g。5. 根据权利要求4所述壮腰补肾丸在制备抑制人口腔上皮癌细胞KB增殖药物中的应 用，其特征在于壮腰补肾丸的制备方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为5%。6. 根据权利要求4所述壮腰补肾丸在制备抑制人口腔上皮癌细胞KB增殖药物中的 应用，其特征在于壮腰补肾丸的制备方法中所述〇)2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度 40°C，CO2流量 2ml/g生药?min，萃取时间 160min。
【专利摘要】本发明属于中药制剂领域，具体提供一种壮腰补肾丸的制备方法，由熟地黄400g、山药200g、泽泻150g、茯苓150g、肉苁蓉100g、红参100g、麦冬50g、菟丝子100g、车前子50g、菊花100g、远志50g、白术100g、龙骨100g、牡蛎100g、续断100g、当归150g、黄芪150g、首乌藤50g、合欢50g、五味子50g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得含量有很大提高，用量减少，本发明还提供了壮腰补肾丸在制备抑制人口腔上皮癌细胞KB增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61K9/20, A61K35/02, A61K35/618, A61P35/00, A61K36/8968
【公开号】CN104887947
【申请号】CN201510342680
【发明人】李洋
【申请人】南京华宽信息咨询中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日