一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学、实验动物学和光动力治疗学领域，特别涉及一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型及其建立方法。
【背景技术】
[0002]人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HP V)是一种双链DNA病毒，属于乳头瘤病毒属。HPV感染性疾病或疣，为皮肤科门诊常见疾病，感染部位可遍及全身，皮肤和黏膜均可累及。尖锐湿疣是由HPV引起的生殖器部位的疣状病灶，与生殖器癌相关。流行病学研宄表明，其人群携带率(包括一过性感染)可以高达50%?60%。其传播主要通过直接接触传播，可引起尖锐湿疣等，且与人类肿瘤特别是宫颈癌、阴茎癌的发生密切相关。因此，我们必须采取积极有效的治疗措施，光动力疗法在其中发挥了重要作用。
[0003]光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)是一种光激发的化学疗法。当一定波长的光照射具有光化学活性的物质即光敏剂(PS)，便会产生一系列的活性分子，从而影响细胞毒性致使细胞死亡。该疗法是完全不同于手术、放疗、化疗和免疫治疗之后的又一种正在研宄、快速发展中的崭新疗法，由于其特异性强，选择性高等优点，近年来临床PDT的研宄得到广泛开展，广泛用于多器官、多部位的肿瘤及非癌症状的治疗，在恶性肿瘤和各种良性疾病的治疗中都取得了令人瞩目的成就，已成为世界肿瘤防治科学中最活跃的研宄领域之一O
[0004]HPV有较强的种属特异性，只能感染人类的皮肤和黏膜组织。因此，在人乳头瘤病毒所致疾病的治疗研宄领域，仍然以研宄患者为主，相应的动物模型还处在摸索阶段。为了构建HPV致病的动物模型，学者们构思了很多方法，但收效甚微。有研宄者试图通过转基因的方法，将人乳头瘤病毒的主要致病基因HPV18 URR与HPV18 E6/E7开放读码框连接并进行显微注射，可获得一定量的出现间充质性宫颈肿瘤的实验动物，提示HPV某些型别的高致癌性。但这种方法操作相对烦琐，成功率低，模型不稳定。因此，为便于PDT治疗人乳头瘤病毒所致疾病的机理、药物应用等研宄，建立一个稳定的、重现性好的动物模型进行临床前的动物实验是必要的。本发明应用一种普通的、易于饲养的动物，建立了一个建模时间短、操作次数少、感染HPV致病率高、建模致死率低的动物模型，为光动力治疗人乳头瘤病毒所致疾病尖锐湿疣奠定了基础。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中建立人乳头瘤病毒感染的动物模型可控性差、不稳定，成功率不高，建模时间较长，操作复杂，成本较高，一般实验室中难于建立等缺陷，而提供了一种人乳头瘤病毒感染致尖锐湿疣动物模型及其建立方法。本发明的建模方法实验时间短、感染HPV致病率高、建模致死率低，该模型能够应用于人乳头瘤病毒所致的尖锐湿疣的光动力治疗药物筛选。
[0006]本发明通过下述技术方案解决上述技术问题:
[0007]一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型及其建立方法，其包括以下步骤:
[0008]步骤1、将新鲜尖锐湿疣疣体组织送至实验室，彻底去除皮下脂肪组织，制作组织块。所述的组织块为钢尺及游标卡尺测量，10号手术刀片制作的0.05-0.1cm3大小组织块；
[0009]步骤2、以4周龄雄性SCID小鼠为试验动物，用镊子将步骤一制得的单个组织块塞到接种针的针孔中，接种到小鼠背部皮下；
[0010]步骤3、将步骤二接种后的小鼠进行饲养；
[0011]步骤4、将步骤三饲养后的尖锐湿疣动物模型用于光动力药物筛选。
[0012]步骤I中，新鲜的疣体组织切取自门诊手术中的尖锐湿疣患者的患处。
[0013]步骤I中，尖锐湿疣患者的诊断必须符合《性传播疾病临床诊疗指南》，且均以醋酸白试验和病理诊断证实。
[0014]步骤2中，所述的接种过程严格按照无菌手术原则操作，快速完成，操作过程中要始终保持疣体组织的湿润。
[0015]步骤3中，所述的饲养时间为2-4周。
[0016]步骤3中，所述的饲养在SPF级环境中饲养；所述的SPF级环境为:温度22±2°C，湿度56±5%，I周换2-3次垫料，控制I?!光照，12h黑暗；饲料:常规饲料；自由进食、进水。
[0017]步骤4中，所述的光动力药物筛选中使用的激发波长为400?700nm，光照剂量100 ?300J/cm2。
[0018]步骤4中，所述的动物模型的用途为尖锐湿疣光动力治疗方法中光敏剂药物的活性测试和筛选。
[0019]本发明中除所述的尖锐湿疣组织块外，所用试剂和原料均市售可得。
[0020]本发明的积极进步效果在于:本发明的建模方法实验时间短、操作次数少、感染HPV致病率高，模型能够专门应用于光动力疗法治疗人乳头瘤病毒所致疾病的实验室阶段相关研宄。
【具体实施方式】
[0021]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0022]下述实施例中涉及的饲养均是在SPF级环境下进行饲养，具体条件为:温度22±2°C，湿度56±5%，1周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料:常规饲料；自由进食、进水。
[0023]实施例1:
[0024]4周龄SCID小鼠，50只，体重llg±l?2g。将门诊手术切取的新鲜疣体组织，置入含UW器官保存液的冰盒送至实验室。用含青霉素、链霉素各100U/mL的生理盐水稍加漂洗后，将疣体组织的皮下脂肪组织彻底去除。钢尺及游标卡尺测量。10号手术刀片制作0.05cm3大小组织块若干，用镊子塞到接种针的针孔中，接种到小鼠背部皮下。整个实验过程严格按照无菌手术原则操作，快速完成。操作过程中要始终保持疣体组织的湿润。饲养两周。小鼠皮肤伤口逐渐愈合，疣体组织逐渐与皮肤组织粘合牢固。由于血供的影响，在人体中湿润、生长旺盛的疣体组织，表面出现部分萎缩、干燥，但是其基底部呈现生长态势。从表面可明显看出植入尖锐湿疣组织块的小鼠臀部部位逐渐长出疣体组织，并且不断增大，在14d后平均直径达到0.8±0.03cm。建模接种成功率100%，建模成活率98%。
[0025]实施例2:
[0026]接种两周后，选取疣体大小均在直径Icm左右的12只小鼠，6只一组，第一组是对照组，不作治疗，第二组为治疗组，将小鼠患处清洁干净，在患处表面及其周围Icm内涂以光敏剂5-ALA乳剂，然后于黑暗环境中避光lh，再行激光照射。选用以405nm为特定波长的激光器进行照射。依据疣体大小确定照射面积，照射时间约30min，照射剂量为150J/cm2。当疣体体积较大时，适当延长照射时间和增加照射点。经激光照射的PDT治疗后，小鼠体重均有正常范围内的下降，表观健康。治疗组中各只小鼠患处均出现不同程度的皮损、皮下血管和组织损伤及浅表溃疡，七天后测得平均抑疣率为63.46%。
[0027]实施例3:
[0028]接种两周后，选取疣体大小均在直径Icm左右的12只小鼠，6只一组，第一组是对照组，不作治疗，第二组为治疗组，将小鼠患处清洁干净，在患处表面及其周围Icm内涂以236mg/ml的光敏剂5-ALA甲酯混悬剂，然后于黑暗环境中避光lh，再行激光照射。选用以405nm为特定波长的激光器进行照射。依据疣体大小确定照射面积，照射时间约30min，照射剂量为150J/cm2。当疣体体积较大时，适当延长照射时间和增加照射点。经激光照射的PDT治疗后，小鼠体重均有正常范围内的下降，表观健康。治疗组中各只小鼠患处均出现不同程度的皮损、皮下血管和组织损伤及浅表溃疡，七天后测得平均抑疣率为65.12%。
【主权项】
1.一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型及其建立方法，包括以下步骤: 步骤1、将新鲜尖锐湿疣疣体组织送至实验室，彻底去除皮下脂肪组织，制作组织块。所述的组织块为钢尺及游标卡尺测量，10号手术刀片制作的0.05-0.1cm3大小组织块； 步骤2、以4周龄雄性SCID小鼠为试验动物，用镊子将步骤一制得的单个组织块塞到接种针的针孔中，接种到裸鼠背部皮下； 步骤3、将步骤二接种后的SCID小鼠进行饲养； 步骤4、将步骤三饲养后的尖锐湿疣动物模型用于光动力药物筛选。2.如权利要求1所述的一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型的建立方法，其特征在于:步骤I中，新鲜的疣体组织切取自门诊手术中的尖锐湿疣患者的患处。3.如权利要求2所述的一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型的建立方法，其特征在于:步骤I中，尖锐湿疣患者的诊断必须符合《性传播疾病临床诊疗指南》，且均以醋酸白试验和病理诊断证实。4.如权利要求1所述的一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型的建立方法，其特征在于:步骤2中，所述的接种过程严格按照无菌手术原则操作，快速完成，操作过程中要始终保持疣体组织的湿润。5.如权利要求1所述的一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型的建立方法，其特征在于:步骤3中，所述的饲养时间为2-4周。6.如权利要求1或5所述的一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型的建立方法，其特征在于:步骤3中，所述的饲养在SPF级环境中饲养；所述的SPF级环境为:温度22±2°C，湿度56±5%，I周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料:常规饲料；自由进食、进水。7.如权利要求1所述的一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型的建立方法，其特征在于:步骤4中，所述的光动力药物筛选中使用的激发波长为400?700nm，光照剂量100 ?300J/cm2。8.如权利要求1所述的一种动物模型在尖锐湿疣光动力治疗中用于光动力药物筛选的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种用于光动力药物筛选的尖锐湿疣动物模型及其建立方法，其包括以下步骤：步骤1、将新鲜疣体组织送至实验室，彻底去除皮下脂肪组织，制作组织块。所述的组织块为钢尺及游标卡尺测量，10号手术刀片制作的0.05-0.1cm3大小组织块；步骤2、以4周龄雄性SCID小鼠为试验动物，用镊子将步骤一制得的单个组织块塞到接种针的针孔中，接种到SCID小鼠背部皮下；步骤3、将步骤二接种后的SCID小鼠进行饲养；步骤4、将步骤三饲养后的动物模型用于光动力药物筛选。本发明的建模方法实验时间短、感染HPV致病率高、建模致死率低，该模型能够应用于人乳头瘤病毒所致的尖锐湿疣的光动力治疗药物筛选。
【IPC分类】A01K67/027, A61D7/00, A61K49/00
【公开号】CN104888236
【申请号】CN201510235927
【发明人】陈志龙, 严懿嘉, 叶颖, 陈聃烨, 高迎华, 陈珍琰
【申请人】陈志龙
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月11日