具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高分子化学和生物医学工程技术领域，涉及一个能够负载多个化疗药 物的PH敏感纳米粒前药，特别是具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法 与应用。
【背景技术】
[0002] 传统化疗在治疗癌症疾病时受到了多重限制，小分子抗肿瘤药物常作为临床上治 疗脑胶质瘤疾病的化疗制剂，但由于其本身的物理化学特性导致的生物利用度差、血液/ 肾清除速率高、特异性差、肿瘤蓄积浓度低、毒副作用大，以及肿瘤多药耐药等问题严重限 制了其临床应用。临床上必须通过增加给药剂量来满足有效浓度的药物到达肿瘤细胞内， 由此会导致机体毒副作用的发生。联合治疗的提出给传统化疗提供了新的转机，拟通过药 物间对肿瘤细胞的不同作用机制发挥杀伤效果，进而降低每个药物的给药剂量以降低对正 常组织的毒副作用。然而，由于不同药物的理化性质导致的体内药代动力学特性的不同，使 药物根据各自的特性在体内分布代谢，导致注射到体内的药物不能够"同时同位"的发挥杀 伤肿瘤的作用。并没有从根本上解决化疗效率差，毒副作用大的难题。
[0003] 纳米载体在改善化疗药物的水溶性、生物利用度和延长体内循环时间方面取得了 很明显的结果。而传统的纳米载体通过物理负载药物的方法载药量一般都很低，必须通过 注射高浓度载体或频繁注射才能实现有效药物浓度被递送至肿瘤内，由此导致体内大量的 载体蓄积可能产生未知的毒副作用以及肿瘤耐药的产生。同时一些通过纳米沉淀技术组 装的载体，常常会导致纳米药物在注射到体内几小时后会有部分药物发生"突释"。这些过 早释放的药物由于被动扩散会导致机体产生严重的副作用；同时二次释放的药物由于浓度 低、释放速率慢导致抗肿瘤活性明显降低。因此，有必要设计一个能够可控制药物释放的纳 米粒前药，即保证药物活性在长循环时"隐藏"起来，到达肿瘤细胞时实现完全释放，以此来 达到高效杀伤肿瘤并降低毒副作用的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一个能够负载多个药物并响应肿瘤细胞内环境药物释放的 高载药量的纳米粒前药，特点是：实现纳米粒前药通过被动靶向（EPR效应）进入肿瘤细胞 内，pH敏感纳米粒前药实现多个抗肿瘤药物在胞内的响应性释放，根据药物的不同机制发 挥联合杀伤肿瘤细胞的作用。即保证了有效浓度的多个药物到达瘤细胞内发挥联合抗肿瘤 作用，同时降低了药物在正常组织的渗透和载体蓄积所引起的副作用和系统毒性。
[0005] 本发明中，设计了一个具有高载药量，肿瘤微环境响应性释放的纳米粒前药，通过 物理负载的方式负载其它药物实现同时递送多个药物，以发挥联合抗肿瘤作用彻底杀伤肿 瘤细胞，以此来解决化疗药物的相容性和生物利用度的问题，同时解决了载体的负载和递 送药物的效率，以及单一药物治疗导致的耐药性的产生。
[0006] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 具有共递送多个药物的PH敏感纳米粒前药，具有如下的结构： PEG-W-Cur-NPs其中PEG为聚乙二醇； DOX为：阿霉素； W为姜黄素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱、长春花碱、地塞米松、或博来霉 素； NPs为：nanoparticles，粒径为 183. 5±4. 5nm纳米粒； 根据透射电子显微镜（TEM)拍照结果，显示本发明的药物形态为圆形的纳米粒子药物， 根据动态光散射（DLS)结果显示本发明的纳米粒子药物粒径为183. 5 ±4. 5nm，粒径均一。
[0007] 本发明所述具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药的制备方法，其特征在于 按如下的步骤进行： (1)PH敏感纳米粒前药的制备：称取200mg分子量为2000的mPEG-CHO(醛基化聚乙 二醇)和50mg阿霉素，将其共溶于2.0mL的二甲基亚砜内，加入20yL三乙胺作为催化 剂，40°C水浴锅内震荡反应24h; (2) 将溶液置于截留分子量为IKDa的透析袋内，DMSO作为透析液，透析48h除去未 反应的DOX;再将溶液置于截留分子量为3. 5KDa的透析袋内，pH7. 4的PBS作为透析液，透 析48h除去DMSO; (3) 将得到的pH敏感的前药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉 (PEG-DOXnanoparticles(NPs)(聚乙二醇化阿霉素纳米粒前药)。
[0008] (4)PEG-D0X-Cur(聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素）制备：称取PEG-DOX冻干粉30 mg，6mg姜黄素（w)，共溶于2mLDMSO内，将溶液缓慢的逐滴加入盛有10mLpH7. 4的PBS 烧杯内，不断震荡，最后将混合溶液置于截留分子量为IKDa的透析袋内，pH7. 4的PBS作为 透析液，透析48h以除去未反应的姜黄素和DMS0,得到前药纳米粒溶液PEG-DOX-CurNPs (聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素纳米粒前药)。
[0009] 本发明更进一步公开了含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药的药物组 合物，所述的组合物的剂型为冻干粉或者为生理盐水分散液针剂。
[0010] 本发明更进一步公开了具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药在制备用于诊 断试剂、荧光探针，诊疗一体化方面的应用。
[0011] 本发明提供的pH敏感的纳米粒前药，提供了一个负载多个药物的平台，实现了多 个药物在肿瘤环境内的同时响应性释放，保证了不同药物的体内动力学一致性，并根据各 自的抗肿瘤机制协同杀伤肿瘤细胞。
[0012] 实验结果证明：以PEG-DOXNPs的基础上，负载另一疏水抗肿瘤药物，能够实现两 个或多个药物的共同快速释放，同时根据不同抗肿瘤机制发挥协同杀伤肿瘤细胞的能力， 其抗肿瘤效果尤为明显；由于前药的PEG的引入，导致药物在体内的作用时间明显延长，同 时由于被动靶向的作用导致药物在肿瘤内的蓄积含量明显的高于裸药(例如D0X)，导致其 体内体内抗肿瘤效果会更加明显。
[0013] 本发明典型的含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药，其制备方法为： pH敏感纳米粒前药的制备方法是：称取200mg分子量为2000的mPEG-CHO (Methoxy-poly(ethyleneglycol)-aldehyde)和 50mg阿霉素（DOX)，将其共溶于 2.OmL的二甲基亚砜（DMSO)内，加入20yL三乙胺作为催化剂，40°C水浴锅内震荡反应24h。将 溶液置于截留分子量为IKDa的透析袋内，DMSO作为透析液，透析48h以除去未反应的 DOX;再将溶液置于截留分子量为3. 5KDa的透析袋内，PBS(pH7. 4)作为透析液，透析48h 以除去DMS0。将得到的pH敏感的前药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干 粉（PEG-DOXnanoparticles(NPs))〇
[0014]PEG-DOX-Cur制备方法是：称取PEG-DOX冻干粉 30mg，6mg姜黄素（curcumin)， 共溶于2mLDMSO内，将溶液缓慢的逐滴加入盛有10mLPBS(pH7. 4)的烧杯内，不断震荡。 最后将混合溶液置于截留分子量为IKDa的透析袋内，PBS(pH7. 4)作为透析液，透析48h 以除去未反应的curcumin和DMS0。得到前药纳米粒溶液PEG-DOX-CurNPs。
[0015] 本发明含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药其pH敏感响应性能够实现 药物的特异性释放的同时，纳米粒发生断裂后，药物发挥抗肿瘤作用，亲水端溶于体内可降 低体内载体的蓄积。本发明选择聚乙二醇（PEG)为亲水端，抗肿瘤药物阿霉素（DOX)直接作 为疏水内核，药物直接键合在亲水分子PEG上能够显著地提高载药能力；亲水端和疏水端 通过PEG末端的醛基（CHO)与DOX的氨基（NH2)反应得到具有pH响应的席夫碱键，能够满 足药物快速的可控制释放。在此纳米粒前药基础上，搭建一个能够同时递送多个药物的前 药纳米粒平台。即通过疏水作用将另外一种疏水抗肿瘤药物包覆在纳米粒前药核内，同时 也增强了纳米粒前药内核的稳定性。纳米粒前药在体循环（PH7. 4)下持稳定；但被肿瘤细 胞摄取后，在内涵体/溶酶体pH4.0 ~ 6. 5条件下，具有pH敏感性的席夫碱键发生响应性 断裂，纳米粒前药解体释放D0X，同时由于疏水作用力的消失导致另一疏水药物的释放。由 于纳米粒前药的结构较简单，因此当席夫碱键断裂之后会导致所有药物的快速释放，以杀 伤肿瘤细胞。
[0016] 优选的，PEG的分子量为2000,作为Golden standard的亲水段长度，能够有效的 改善DOX的水溶性及药代动力学特性，明显的降低RES对纳米粒的体循环清除。
[0017] 优选的，疏水性抗肿瘤药物DOX作为纳米粒前药的疏水内核，较强的疏水作用力 能够使前药聚集成纳米粒子，由于其适宜的分子量能够使纳米粒前药的载药量高达20%。
[0018] 优选的，在亲水端和疏水药物之间形成具有pH敏感的席夫碱键，其酸响应性释放 特异性高，能够实现纳米粒前药在肿瘤特定环境下的响应性释放及肿瘤细胞的摄取。
[0019] 优选的，姜黄素（Curcumin，Cur)作为另一疏水药物通过物理包覆的方式负载到纳 米粒前药内，通过与DOX良好的疏水作用被包覆到内核。在肿瘤特定环境下的响应性同时 释放两个化疗药物，二者根据各自不同的抗肿瘤活性协同，联合杀伤肿瘤细胞。
[0020] 优选的，在此纳米粒前药PEG-DOX基础上，任何疏水药物包括紫杉醇（PTX)、多西 他赛（TXT)、喜树碱（CPT)、羟基喜树碱（HCPT)、长春花碱（VLB)、地塞米松（DXM)、或博来霉 素（BLM)都可以通过物理包覆的方式负载要纳米粒前药内，通过同时递送和同时释放多个 抗肿瘤药物，实现联合化疗。
[0021] 本发明公开的含有具有共递送多个药物的pH敏感纳米前药，特点是： (1)载药量高，原因是将疏水药物直接键合到亲水分子上。
[0022] (2)载体量低，原因是抗肿瘤药物DOX直接作为纳米粒的疏水内核。本发明提供 的pH敏感的纳米粒前药，其pH敏感响应性能够实现药物的特异性释放的同时，纳米粒发 生断裂后，亲水端溶于体内，药物发挥抗肿瘤作用，降低体内载体的蓄积。
[0023] (3)生物相容性好。其pH敏感响应性能够实现药物的特异性释放的同时，纳米粒 发生断裂后，药物发挥抗肿瘤作用，亲水端溶于体内可降低体内载体的蓄积。能够负载多个 疏水性抗肿瘤药物。原因是纳米粒前药能够通过疏水作用将另一种疏水药物包覆在核内。
[0024] (4)本发明提供了一个负载多个药物的平台，实现了多个药物在肿瘤环境内的 同时响应性释放，保证了不同药物的体内动力学一致性，并根据各自的抗肿瘤机制协同杀 伤肿瘤细胞。同时制备方法简便易行，稳定性良好，便于操作推广。
[0025]
【附图说明】： 图1为本发明实施例的pH敏感纳米粒前药示意图； 图2为本发明实施例的PEG-CHO(A)纳米粒前药PEG