-DOXNPs(B)的核磁共振氢谱 图； 图3为本发明实施例的纳米粒前药PEG-DOXNPs和PEG-DOX-CurNPs的粒径分布（A) 和微观形态（B，C); 图4为本发明实施例的PEG-DOX-CurNPs在酸性条件下的粒径变化（A)和微观解体变 化（C); 图5为本发明实施例的pH敏感纳米粒前药的体外释放；(A)DOX在不同pH条件下的 响应性释放曲线；(B)Cur在不同pH条件下的响应性释放曲线； 图6为本发明实施例的pH敏感纳米粒前药细胞胞吞：细胞对裸药D0X、裸药Cur，PEG-DOX-CurNPs的摄取； 图7为本发明实施例的pH敏感纳米粒前药细胞毒性评价：裸药D0X、裸药Cur、PEG-D0X NPs、裸药DOX&Cur和PEG-DOX-CurNPs对（A)IfepG2 和（B)HeLa细胞的细胞毒性； 图8为本发明实施例的pH敏感纳米粒前药静脉注射后，药物的瘤内分布：(A)静脉注 射后Ih; (B)静脉注射后24h; (C)静脉注射后48h。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而 并非对本发明的限制。其中所用到的化学试剂有市售，所用到的阿霉素、姜黄素也有市售。
[0027] 实施例1 图1为本发明实施例的pH敏感纳米粒前药示意图。从图1中可以看出，本发明双敏感 层交联纳米粒具有三层结构，外层为具有高度生物相容性的PEG，内核为与亲水端键和的抗 肿瘤药物D0X，再通过疏水作用包裹另一疏水抗肿瘤药物Cur。
[0028] (a)pH敏感纳米粒前药的制备 称取 200mg分子量为 2000 的mPEG_CHO(Methoxy-poly(ethyleneglycol)-aldehyde) 和50mg阿霉素（DOX)，将其共溶于2.0mL的二甲基亚砜（DMSO)内，加入20yL三乙胺 作为催化剂，40 °C水浴锅内震荡反应24h。将溶液置于截留分子量为IKDa的透析袋内， DMSO作为透析液，透析48h以除去未反应的DOX;再将溶液置于截留分子量为3. 5KDa的 透析袋内，PBS(pH7. 4)作为透析液，透析48h以除去DMS0。将得到的pH敏感的前药纳 米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉（PEG-DOXnanoparticles(NPs))。结构 反应式如式1-1所示：
式1_1 (b)PEG-DOX-CurNPs制备 称取PEG-DOX冻干粉30mg，6mg姜黄素（curcumin)，共溶于2mLDMSO内，将溶液缓 慢的逐滴加入盛有10mLPBS(pH7. 4)的烧杯内，不断震荡。最后将混合溶液置于截留分 子量为IKDa的透析袋内，PBS(pH7. 4)作为透析液，透析48h以除去未反应的curcumin 和DMS0。得到前药纳米粒溶液PEG-DOX-CurNPs。
[0029] 利用核磁共振波谱对纳米粒前药PEG-DOX进行表征，结果如图2所示。对本实施 例中所得聚合物的特征峰进行分析，结果表明，该纳米粒前药被成功合成。
[0030] 实施例2: PEG-DOX-CurNPs的敏感性表征，具体步骤如下： 将制备的PEG-DOX-CurNPs放置在pH5. 0酸性溶液条件下，37°C的恒温振荡器中孵育 至48h，利用激光粒度仪和透射电镜检测纳米粒粒径和形态的变化。检测结果如图4A所 示，纳米粒前药的粒径在24h和48h时发生明显增大，通过扫描电镜显示48h时的纳米 粒发生明显的解体，其形状很不规则（图4C)。
[0031] 实施例3: PEG-DOX-CurNPs的体外释放行为表征，具体步骤如下： 取5mLPEG-DOX-CurNPs封装在截留分子量为3500Da的透析袋中，加入40mL透 析液，透析液为pH分别为7. 4、6. 5、5. 0的磷酸盐缓冲溶液，释放在37°C的恒温振荡器中进 行。在预定的时间点，取出5mL的释放液，补加相同体积的新鲜释放液。药物的释放量利 用紫外分光光度计进行测定。
[0032] 释放行为的评价结果如图5所示，DOX和Cur表现出相似的释放曲线，原因是由于 席夫碱键为酸响应断裂键，导致PEG与DOX发生断裂的同时，纳米粒前药与Cur的疏水作用 随之消失，即在纳米粒前药解体的时候，所有被负载的药物均被同时释放。
[0033] 实施例4: 载药纳米粒的细胞摄取，具体步骤如下： 以含10%胎牛血清（FBS; Biochrom Ag, Germany)的DMEM (Sigma-Aldrich, USA)为基础培养液，将细胞（IfepG2)以I X IO5个/mL细胞浓度接种于24孔板中，置于37°C、5 % CO2、饱和湿度条件下培养。将裸药D0X、裸药Cur、PEG-D0X-Cur NPs用DMEM稀释，得到药物 浓度在10 ~ 100yg/mL的溶液。取500yL各浓度的上述溶液分别加到接种过细胞的孔 板中替代原培养液。加入等体积生理盐水的培养在DMEM中的细胞作为对照组。与载药纳 米粒孵育培养一段时间后，取出培养板，用流式细胞仪检测细胞对纳米载体的摄取能力。
[0034] 检测结果如图6所示，药物与细胞作用8 h后，可见H印G2细胞对纳米粒前药中所 有药物的摄取能力远远高于裸药，同时明显的提高了药物在胞内的作用时间。
[0035] 实施例5: 纳米粒前药的细胞毒性评价，具体步骤如下： 以含 10% 胎牛血清（FBS;BiochromAg,Germany)的DMEM(Sigma-Aldrich,USA)为 基础培养液，将细胞（IfepG2和HeLa)以IXIO5个/mL细胞浓度接种于96孔板中，置于37 °C、5 %CO2、饱和湿度条件下培养。裸药D0X、裸药Cur、D0X&Curmixtures，PEG-DOXNPs和 PEG-DOX-CurNPs，取100yL各浓度的上述溶液分别加到接种过细胞的孔板中替代原培养 液。培养在DMEM中的细胞作为对照组。分别培养一段时间后，取出培养板，用MTT法检测 材料的毒性。
[0036] 结果如图7A，B所示，细胞毒性呈现明显的浓度依赖性。并且PEG-DOX-CurNPs 的协同作用明显高于DOX&Curmixtures，取得了明显的体外联合治疗结果。
[0037] 实施例6: PEG-DOX-CurNPs静脉注射后，药物在正常组织和肿瘤内分布，具体步骤如下： 取健康Balb/c小鼠，雌性，体重19 ± 2g，将培养的H印G2细胞在无菌条件下进行快 速接种，于小鼠右后腿皮下注射细胞瘤液0.2mL/只，细胞浓度为5.0X106/只。在接种一 周以后，肿瘤体积达到100mm3(V=l/2(aXb2))时，小鼠被随机分成2组，即裸药DOX和 PEG-DOX-CurNPs组，DOX的给药剂量为5mg/kg。尾静脉注射给药后，在预定的时间处死 小鼠，解剖取出肿瘤组织。利用活体成像仪检测药物在肿瘤内的分布。
[0038] 结果如图8所示，当各制剂静脉注射后，PEG-DOX-CurNPs在肿瘤组织的药物富 集量显著高于裸药DOX组，并且纳米粒前药的协同作用会保证DOX和Cur共同到达肿瘤部 位。此外，由于亲水端PEG的引入明显的延长了DOX和Cur在体内的循环时间，增加了治疗 效果。
[0039] 实施例7: 在此体系基础之上，根据实施例1试验内容，利用PEG-DOX分别负载疏水抗肿瘤药物 紫杉醇（PTX)和喜树碱（CPT),得到纳米粒前药PEG-DOX-PTXNPs和PEG-DOX-CPTNPs。利 用实施例2对纳米粒前药进行表征，其结果见表1。得到的纳米粒前药结构及粒径大小类似 于PEG-DOX-CurNPs，说明在PEG-DOX的前提下负载任何一种抗肿瘤药物都能得到一个很 好的纳米级的前药： 表1
【主权项】
1. 具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药，其结构如下： PEG-DOX-W-NPs 其中PEG为聚乙二醇； DOX为：阿霉素； W为姜黄素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱、长春花碱、地塞米松、或博来霉 素； NPs为：粒径183. 5 ±4. 5nm纳米粒。2. 权利要求1所述具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药的制备方法，其特征在于 按如下的步骤进行： (1)PH敏感纳米粒前药的制备：称取200mg分子量为2000的mPEG-CHO醛基化聚乙二 醇和50mg阿霉素，将其共溶于2.0mL的二甲基亚砜内，加入20yL三乙胺作为催化剂， 40°C水浴锅内震荡反应24h; (2) 将溶液置于截留分子量为IKDa的透析袋内，DMSO作为透析液，透析48h除去未 反应的DOX;再将溶液置于截留分子量为3. 5KDa的透析袋内，pH7. 4的PBS作为透析液，透 析48h除去DMSO; (3) 将得到的pH敏感的前药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉聚乙 二醇化阿霉素纳米粒前药； (4) 聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素制备：称取PEG-DOX冻干粉30mg，6mg姜黄素（w)， 共溶于2mLDMSO内，将溶液缓慢的逐滴加入盛有10mLpH7. 4的PBS烧杯内，不断震荡， 最后将混合溶液置于截留分子量为IKDa的透析袋内，pH7. 4的PBS作为透析液，透析48h 以除去未反应的姜黄素和DMS0,得到前药纳米粒溶液聚乙二醇化的阿霉素-姜黄素纳米粒 前药。3. -种药物组合物，其特征在于它含有权利要求1所述的具有共递送多个药物的pH敏 感纳米粒前药及要学上和接受的药用载体。4. 权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的组合物的剂型为冻干粉或者为生 理盐水分散液针剂。5. 要求1所述的具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药在制备用于诊断试剂、荧光 探针，诊疗一体化方面的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种具有共递送多个药物的pH敏感纳米粒前药及其制备方法和应用。外层为具有高度生物相容性的聚乙二醇，内核为与亲水端键和抗肿瘤药物阿霉素（DOX），再通过疏水作用包裹另一疏水抗肿瘤药物姜黄素（Cur）。其结构是为：PEG-DOX-W-NPs。在pH响应条件下，纳米粒前药通过解体同时释放多个抗肿瘤药物以发挥联合治疗作用。本发明提供的pH敏感纳米粒前药，其生物相容性好，体内作用时间长。制备方法简便、稳定性良好、便于操作推广。
【IPC分类】A61K31/573, A61K31/12, A61K38/14, A61K31/475, A61K49/00, A61P35/00, A61K47/34, A61K47/48, A61K31/337, A61K45/06, A61K31/4745, A61K31/704
【公开号】CN104888235
【申请号】CN201510224988
【发明人】刘鉴峰, 张玉民, 褚丽萍, 刘金剑, 杨翠红, 高红林
【申请人】中国医学科学院放射医学研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月6日