C)下进行浓缩；
[0070] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-25°c，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28y g，产率为1. 4%。
[0071] 实施例4燕窝提取物的制备
[0072] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[007引 似将白燕或黄燕用水（30°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:500)浸泡约 5h,血燕用温水浸泡约化；
[0074] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0075] (4)收集燕窝滤渣，在20°C和-80°C冰箱中反复冻融6次，破碎燕窝滤渣；
[0076] (5)用水洗漆两次，每次3min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0077] (6)同时将滤渣收集起来，用0. 1 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0.Img的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣她；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[007引 （7)用消化液7倍体积的S蒸水稀释燕窝消化液；
[0079] (8)将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[0080] (9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件（2°C)下进行浓缩；
[0081] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-30°c)~（-20°c)，真空度为 50-200Pa，冻干时间为36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0082] 实施例5燕窝提取物的制备
[0083] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[0084]似将白燕或黄燕用水（28°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:300)浸泡约 6h,血燕用温水浸泡约12h;
[0085] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0086] (4)收集燕窝滤渣，在15°C和-80°C冰箱中反复冻融3次，破碎燕窝滤渣；
[0087] (5)用水洗漆两次，每次5min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[008引 （6)同时将滤渣收集起来，用0. 5 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 5mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0089] (7)用消化液6倍体积的=蒸水稀释燕窝消化液；
[0090] 做将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[00川 （9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件巧°C)下进行浓缩；
[0092] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-28°C，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0093] 实施例6ELASA法定量检测EGF含量
[0094] (1)将实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉用透明质酸钢溶液进行溶解，为实 验品；将EGF标准品溶解，设置了 4个浓度，分别是10yg/ml，20yg/ml，30yg/ml、40yg/ ml及50yg/ml;从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；
[0095] (2)留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10°C~35°C下避光放置；
[0096] (3)分别将实验品或不同浓度的标准品（0yg/ml孔加试剂稀释液）加入相应孔 中，100y1/孔，用封板胶纸封住反应孔，37°C解箱解育90min;
[0097] (4)洗板 4 次；
[009引 （5)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100y1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解 箱避光解育60min;
[0099] 做洗版4次；
[0100] (7)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100y1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解 箱避光解育30min;
[0101] 做洗版4次；
[0102] (9)加入显色底物，lOOyl/孔，于37°C解箱避光解育15min;
[0103] (10)加入终止液，100y1/孔，混匀后检测其吸光度值伽4W值）。
[0104] 柄;准品结果如图1。
[01化]上述EGF标准品符合标准曲线y=0. 03X+0. 2。而我们检测到的实验品中的EGF的0〇45。平均值为1. 32,根据标准曲线图1，从而得知实验品中的EGF浓度为37. 3 y g/ml。
[0106] 将本发明实施例2至实施例5制备获得的燕窝提取物冻干粉进行上述试验，结果 与实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉的试验结果相近，无显著差异（P> 0. 05)。
[0107] 综合上述试验数据表明，制备获得的燕窝提取物冻干粉中的EGF浓度显著提高。
[0108] 实施例7紫外分光光度计法定量检测生物素含量
[0109] (1)标准曲线的绘制
[0110] 将生物素标准品进行溶解和稀释，分别稀释成W下浓度；200yg/ml、400yg/ml、 600yg/ml、800yg/ml、1000yg/ml，在590皿处分别测定各浓度标准品溶液的吸光度值 A(0D590)，记录所得读数如下表1。
[0111] 表1生物素标准品的吸光度值（0D590)
[0112]
[011引 0)样品的测定
[0114] 将实施例1制备的燕窝提取物冻干粉用透明质酸钢溶液进行溶解，为生物素样 品。将样品按上述方法测定在590nm处的吸光度值（0D590)，平行测定=份。记录读数，得 生物素样品的吸光度值为0. 368。
[0115] 根据表1，我们可W绘制出图2 :
[0116] 根据图2,可知生物素标准品的标准曲线符合y= 5. 4X+0. 106,检测到样品中生物 素的吸光度值为；〇. 368,由此可知，相应吸光度值的浓度为0. 0485mg/ml，即48. 5yg/ml。
[0117] 将本发明实施例2至实施例5制备获得的燕窝提取物冻干粉进行上述试验，结果 与实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉的试验结果相近，无显著差异（P> 0. 05)。
[0118] 综合上述试验数据表明，制备获得的燕窝提取物冻干粉中的生物素浓度显著提 局。
[0119] 实施例8效果试验
[0120] (1)设计一份燕窝提取物冻干粉的使用效果调查问卷。问卷对象为暨南大学
[0121] 经济学院国际贸易专业14级学生30人，男15,女15。调查内容如下：
[0122]
[0124] (2)将燕窝提取物冻干粉及溶媒7套，发给试用者使用，每人每年1套，连续使用7 天。
[0125] (3)7天后，将调查问卷发给试用者，要求试用者认真填写。
[01%] (4)将调查问卷收集后，进行分析和讨论。
[0127] 30份调查问卷中，其中28份调查问卷说明我们的燕窝提取物冻干粉具有美白嫩 肤、枯斑除污垢、改善皮肤的功效。
[0128] 对比例1用ELASA法定量检测现有技术与本发明中的EGF含量
[0129] ELASA法具体的实验步骤如实施例6,检测到现有方法和本发明中的EGF的0〇45。值 分别为1. 08和1. 32,根据标准曲线图1，得知现有技术体与本发明中的的EGF浓度分别为 2. 68yg/ml和37. 3yg/ml，其差异具有统计学意义。
[0130] 对比例2用紫外分光光度计法定量检测现有技术与本发明中的生物素含量
[0131] 紫外分光光度计法具体的实验步骤如实施例7,检测到现有方法和本发明中的生 物素的吸光度分别为0. 284和0. 368,根据标准曲线图2,得知现有技术体与本发明中的的 生物素浓度分别为32. 9yg/ml和48. 5yg/ml，其差异具有统计学意义。
[0132] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种燕窝提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1 :取燕窝与25°C~40°C的水混合、浸泡，过滤，收集滤渣； 步骤2 :取所述滤渣，于-80°C冷冻1~2h，再于10°C~35°C融化0. 5~lh，按照上述 操作反复冻融，洗涤、过滤，收集滤液和滤渣； 步骤3 :取步骤2所述滤渣，与中性蛋白酶混合，酶解，获得消化液； 步骤4 :取步骤3所述消化液稀释、过滤后，与步骤2所述滤液混合浓缩，获得浓缩液。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，以g/L计，所述燕窝与所述 水的质量体积比为1: (300~500)。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述浸泡的时间为3~ 24h〇4. 根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述过滤采用筛 网的目数为70目。5. 根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述反复冻融的 次数为3~6次。6. 根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述中性蛋白酶 的酶活为30万U/g，所述中性蛋白酶的浓度为0. 1 %~0. 5%，所述中性蛋白酶与步骤2所 述滤渣的质量比为1~2 :2~3。7. 根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述酶解的时间 为2~8h。8. 根据权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述稀释为取所述 消化液与水混合；所述水与所述消化液的体积比为5~10:1。9. 根据权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述浓缩的比例为 15:1，所述浓缩的温度为2 °C~8 °C。10. 根据权利要求1至9任一项所述的制备方法，其特征在于，获得浓缩液后还包括冻 干的步骤；所述冻干的温度为_35°C~-20°C，所述冻干的真空度为50Pa~200Pa，所述冻 干的时间为30h~36h。11. 根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制得的燕窝提取物。12. 根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制得的燕窝提取物在制备促进细胞再 生、增强免疫力、养颜、延缓衰老的药物、食品、化妆品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用。该方法提高了燕窝提取物中蛋白的活性和纯度，获得的燕窝提取物具有独特的美白嫩肤、美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高了产品品质。
【IPC分类】A61P37/04, A61K38/01, A61P17/16, A61K35/57, A61Q19/00, A61P7/00, A23L1/29, A61P39/06, A61K8/98, A61Q19/08
【公开号】CN104906555
【申请号】CN201510402496
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 罗二梅, 王小燕
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月9日