一种治疗心肌梗死的药物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种治疗心肌梗死的药物，具体涉及含有转录因子MyoD为有效成分的治疗心肌梗死的药物。
【背景技术】
[0002]miRNA是一类长约21_25nt，进化上高度保守的单链非编码RNA，大部分由基因的内含子区域产生，主要通过抑制mRNA翻译或促进其降解从而调控基因表达。单个miRNA可以直接调节上百个基因的表达，进而间接对上千个基因表达发挥调控作用，在细胞增殖、凋亡、分化、代谢等一系列生理过程中发挥着重要作用。
[0003]转录因子(transcript1n factor，TF)是一类包含多个独立区域的组合蛋白质，它参与了转录过程的激活或抑制，转录因子与miRNA在高等真核细胞生物的基因转录水平和转录后水平发挥重要的调控作用。转录因子与miRNA之间呈现高度的协调性，两者在转录水平与转录后水平的调控上紧密联系。在转录水平，转录因子作为一种重要的调控因子参与调控多种基因的表达。近些年研宄表明转录因子可以直接调控miRNA的表达，并且参与了包括心血管疾病发生等多种生物学进程。转录因子与miRNA形成的调控网络已被广泛地研宄，先前研宄表明，转录因子可以直接结合在miRNA的启动子区并调控miRNA的表达。这一发现使TF与miRNA 2种处于不同调控水平的网络有机地联系在了一起。全基因组microRNA革El基因预测分析也表明，microRNA的革El点大多都是转录因子。
[0004]人类的miR-206分别位于第6号染色体上，并且相当保守。miR-206是肌肉特异表达的miR-1家族成员之一。研宄已证明，miR-206仅在脊椎动物的骨骼肌中特异表达，且在慢肌中高表达。人类MyoD基因位于染色体Ilp 15.4，共有线性DNA 6490bp，mRNA 1974bp，蛋白质318个氨基酸。MyoD在其他类型细胞转化为成肌细胞和成肌细胞分化为肌管的过程中起重要作用；在特异肌基因转录调控中，MyoD起着总开关的作用。本研宄拟在前期研宄的基础上，通过双萤光素酶报告基因实验进行MyoD与miR-206启动子结合的预测与验证，初步研宄转录因子MyoD对miR-206启动子活性的影响，从而为miR-206的调控网络及作用原理提供依据。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于为心肌梗死提供一种治疗药物组合物。为解决上述问题，本发明人经潜心研宄发现了一种治疗心肌梗死的药物，其特征在于，含有MyoD为有效成分。
[0006]本发明所述一种治疗心肌梗死的药物，优选有效成分占所述药物总重量为:所述MyoD 占 70 ?85%。
[0007]本发明所述一种治疗心肌梗死的药物，更优选所述MyoD占85%.
[0008]本发明所述一种治疗心肌梗死的药物，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0009]本发明还提供一种药物在治疗心肌梗死中的应用，其特征在于，所述药物含有MyoD为有效成分。
[0010]本发明还提供一种药物在治疗心肌梗死中的应用，优选所述有效成分占所述药物总重量为:所述MyoD占70%?85%。
[0011]本发明还提供一种药物在治疗心肌梗死中的应用，更优选所述MyoD占85%。
【具体实施方式】
[0012]下面将具体说明本发明的实施方式，然而本发明的实施方式并不被以下【具体实施方式】所限制。
[0013]1.从基因文库中获取MyoD
[0014]①基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
[0015]②基因文库的种类:1、基因组文库；2、部分基因文库。
[0016]利用PCR技术扩增目的基因
[0017]①PCR含义:是一项在生物体外复制特定DNA片段的核糖合成技术。全称是多聚酶链式反应。
[0018]②PCR原理:DNA双链复制。
[0019]③前提条件:有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
[0020]④扩增过程:目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此重复循环多次。
[0021]⑤结果:每次循环后的目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增。
[0022]2.载体构建
[0023]I)组成
[0024](I)目的基因；⑵启动子；(3)终止子；(4)标记基因。
[0025]3.功能
[0026]I)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
[0027]2)使目的基因能够表达和发挥作用。
[0028]4.步骤
[0029]I)用一定的限制酶切割质粒，使之出现一个黏性末端切口。
[0030]2)用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端。
[0031]3)将目的基因片段插入质粒切口，加入适量DNA连接酶，使目的基因与质粒形成重组质粒。
[0032]4)基因表达载体的构成:目的基因+启动子+终止子+标记基因
[0033]5.目标导入
[0034]I)转化
[0035]目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
[0036]2)受体种类
[0037](I)、微生物:细菌细胞
[0038](2)、植物细胞:卵细胞、受精卵、体细胞
[0039](3)、动物细胞:受精卵、胚胎细胞
[0040]6.检测鉴定
[0041](1)、检测:
[0042]①、导入检测:检测受体细胞染色体DNA上是否含有目的基因。
[0043]DNA分子杂交法(DNA探针法)。
[0044]②、表达检测:检测目的基因是否完成转录出mRNA。
[0045]分子杂交法检测RNA。
[0046]检测目的基因是否完成表达翻译成蛋白质。
[0047]提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
[0048](2)、鉴定:个体生物学水平鉴定，鉴定抗性等。
[0049]6.血浆miRNA提取步骤
[0050]I)等体积的血楽和2 X Denaturing试剂充分混勾，室温放置5分钟。
[0051 ] 2)加入两倍于血浆体积的酚-氯仿，颠倒混合60秒，室温下16000 X g离心15分钟(如离心效果不好，即两相液面分离不好需再次离心，或将所有的水相吸出至一新管后再次离心5分钟).
[0052]3)回收上层水相至一干净试管中，记录回收水相体积。
[0053]4)加入1.25倍水相体积的无水乙醇并充分混匀。
[0054]5)加入700ul (每次不超过)无水乙醇混合液于过滤柱上，1000Xg离心30秒，弃滤出液(多次过柱使用同一过滤柱和同一收集管).
[0055]6)加入700ul Wash I于过滤柱上，1000Xg离心20秒，弃滤出液。
[0056]7)加入500ul Wash 2/3于过滤柱上，1000Xg离心20秒，弃滤出液，重复I次。
[0057]8)再次离心I分钟，取出滤柱中液体残留。
[0058]9)加入预热95°C的RNase-free水到滤膜中心，1000Xg离心50秒，洗脱液流出液保存于-80 °C。
[0059]7.miRNA质量的检测
[0060]取混匀的RNA样品lul，以RNase-free水作空白对照测定260、280nm的吸光值。根据A260/A280计算核酸纯度及浓度。
[0061]8.miRNA基因芯片分析
[0062]使用miRNeasy mini试剂盒进行总RNA的纯化。然后用分光光度计检测RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。分离得到的RNA采用miRCURY? Hy3?/Hy5? Power标记试剂盒对miRNA进行标记。标记好的样本与miRCURY? LNA Array (v.18.0)进行杂交。样本杂交后采集图像，最后图像采用扫描分析软件进行数据分析。冠心病组标准值与正常对照组标准值相比高于2.0倍或低于2.0倍即认为存在显著性上调或下调趋势。miRNA基因芯片分析由上海康成生物技术有限公司完成。
[0063]9.转录因子结合位置(TFBS)预测
[0064]首先在UCSC 生物信息学网站上(http://genome.ucsc.edu)搜索 hsa-miR-206基因上游启动子区2000bp以内的序列；再进一步应用TRANSFAC (http://www.gene-regulat1n.com/pub/databases.html)和 TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)在线工具，预测hsa-miR-206在基因组上游2000bp以内是否存在转录因子结合位置(TFBS)。
[0065]下面根据结果顺序依次介绍本发明药物所取得的意想不到的效果。
[0066]第一，本研宄结果显示本，一共纳入240例研宄对象，其中冠心病组120例，男性77例，女性43例;正常对照组120例，男性57例，女性63例。冠心病组平均年龄64.70 ±6.79 ；正常对照组年龄63.69±5.96.吸烟，高血压，糖尿病，甘油三酯，LDL-C和HDLIC差异均无统计学意义。
[0067]第二，使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描，芯片图像的原始荧光强度数据由GenePix Pro 6.0软件完成分析，通过原始值减去背景值来做修正，并用中值做标准化，分别计算出3个冠心病患者及3个正常对照样本中miRNA的标准值及两两之间标准值的比值.用火山图中挑选出差异表达的miRNA。
[0068]第三，用MEV软件对差异表达miRNA进行聚类分析。结果显示:通过miRNA基因芯片检测并统计分析后结果显示，表达差异倍数大于5倍的miRNA分子共33个。
[0069]第四，入选的4 种 miRNA 即 has-miR-574_5p，has-miR-206，has-miR-303a_3p 和has-miR-383的基本信息。
[0070]第五，生物信息学预测MyoD是miR-206基因启动子区转录因子。分别应用生物信息学软件TRANSFAC和TFSEARCH对转录因子进行预测，选择2个软件预测结果的交集作为候选转录因子。结果发现，在miR-206基因上游启动子区有2个转录因子MyoD结合位点。因此，生物信息学预测认为，MyoD是miR-206基因的转录因子。
[0071]根据以上各实验结果，可得知使用发明的药物后，取得的技术效果有:与对照组相比，使用MyoD对心肌梗死有干预治疗作用。
【主权项】
1.一种治疗心肌梗死的药物，含有转录因子MyoD为有效成分，其特征在于，所述MyoD占有效成分70%?85%。2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述MyoD占有效成分85%。3.如权利要求1或2所述的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。4.一种药物在干预治疗心肌梗死中的应用，其特征在于，所述药物含有转录因子MyoD为有效成分。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述有效成分占所述药物总重量的百分比为:所述MyoD占70%?85%。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述MyoD占85%。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗心肌梗死的药物，含有转录因子MyoD为有效成分，所述MyoD占有效成分70％～85％。实验研究结果表明，这种治疗心肌梗死的药物能有效干预治疗心肌梗死。
【IPC分类】A61P9/10, A61K38/17, A61K48/00
【公开号】CN104922657
【申请号】CN201510197193
【发明人】周建庆, 廉姜芳, 步世忠, 陈小良, 黄晓燕, 杨曦
【申请人】宁波市医疗中心李惠利医院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年4月22日