对神经毒剂的暴露的治疗的制作方法
【专利说明】对神经毒剂的暴露的治疗
[000。 发明背景 发明领域
[0002] 本申请提供了预防和治疗对有机憐酸盐试剂的暴露的毒性作用的方法。在实施方 案中，施用递送编码下酷胆碱醋酶的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的序列的核酸分子的祀 向阳离子脂质体复合物。适当地，施用是通过吸入。还提供了阳离子脂质体复合物和产生 用于此类施用的复合物的方法。
[000引发明背景
[0004] 有机憐酸盐试剂（0巧通常用作杀虫剂、杀昆虫剂和用于治疗医学病况诸如青光 眼和阿尔茨海默病的药物。不幸地是，它们还已被开发用作神经毒剂诸如沙林、梭曼、维埃 克斯（V讶和塔崩。运些0P化合物属于已知的最毒的化学物质。对甚至少量的暴露可W是 致命的。死亡因由横隔肌和肋内肌的麻搏、大脑呼吸中枢的抑制、支气管疫李、抽摇和唾液 分泌过多引起的窒息而发生（综述于1中）。0P中毒的机理是导致酶的不可逆失活的乙酷 胆碱醋酶（Ac证）的活性位点中的丝氨酸的径基的憐酸化。AchE(其在突触间隙水解乙酷胆 碱（Ach))是神经传递中的必需酶。AchE的失活导致Ach的快速积累，随后产生PNS胆碱能 过度刺激和死亡。在CNS中，胆碱能过度兴奋增加神经元放电，从而触发抽摇和急性神经细 胞死亡。
[0005] 虽然存在用于暴露后使用的解毒治疗，但它们已证明疗效有限，产生严重的副作 用，并且没有阻止失能（暂时性或永久性的）或不可逆的脑损伤（1，2)。因此，正在寻求预 防性措施。用于抵消0P毒性的一种方法是利用生物清除剂隔离和中和运些化合物。在所测 试的生物清除剂中，人血清下酷胆碱醋酶度化巧（也称为假胆碱醋酶，或胆碱醋酶）似乎是 最适合于人使用的（3)。B化E是一种存在于几乎每一个组织（包括血浆、脑、肌肉、肾、肝和 肺）中的丝氨酸酶（4)。血清中的人B化EQiB化巧（340kDa)是具有Ti/2为11-14天的球状 四聚体分子，由四个相同的亚基组成，并且通过重糖基化（5)来免受蛋白水解。个体亚基组 装成四聚体需要来源于lamellipodin(5)或来自大鼠胶原蛋白尾（A化EQ亚单位）的富含 聚脯氨酸的肤度on的文章，Krejci的文章，Antamirano的文章），或任何其他富含聚脯氨 酸的蛋白质的存在。B化EW相高的水平（4倍于平均基因的表达）天然表达（4)。其还在 许多含醋药物中的降解中起着重要作用，并且是胆碱醋酶抑制剂（包括强效0P神经毒剂） 的天然生物清除剂。
[0006] 每一个hB化E分子中和一个0P分子化）。据报道，利用重组人B化E和人血清B化E 的预处理可W保护动物（包括晒齿动物、豚鼠、猪和非人灵长类动物）免受高达5倍LDs。的 神经毒剂的伤害化，7)。B化E与广谱的0P毒药的不可逆结合和其灭活作用使其成为用于 抗神经毒剂的预防性治疗的理想候选者。除了其用于多种战时暴露前和暴露后场景的用途 W外，其还具有作为对用于对故意/意外神经毒气释放起反应的第一反应者的预治疗和作 为对杀虫剂过度暴露、过量服用可卡因或班巧酷-胆碱诱导的呼吸暂停的暴露后治疗的潜 在用途（8)。
[0007] 据估计，在人中，250mg/70千克的B化E剂量是在用一个L05。的OP攻击后实现高效 保护所需要的（3)。然而，在血液中该生物清除剂酶的天然存在的量（~8-72mg/6L)太低W至于因0P与B化E的化学计量和不可逆的结合W及其间的相互作用、不利的0P/B化E质 量比和酶的老化而不能实现足够的保护（4, 9)。因此，关键是开发显著升高B化E在血浆中 的表达水平和量的方法。为此目的，正在制定不同的策略。最直接的方式是直接注入大剂 量高度纯化的天然hB化EW增加其在血流的量。运已被证明对于抗致死剂量的梭曼和维埃 克斯的保护是成功的，但对于战场使用是不实用的。此外，转基因动物和细胞培养的使用尚 未能产生足够量的hB化E来切实可行地使用。
[000引能够自发地再活化（使得它们可用于结合并灭活另外的0P分子）的B化E突变 体的衍生是另一种具有一定成功的使用的方法。当用组氨酸取代第117位上的甘氨酸 (G117H)时B化E经显示获得0P水解酶活性和增强的再活化（10, 11)。该突变体在水解乙 酷胆碱醋酶抑制剂二乙氧憐酷硫胆碱上是高效的并且还可高效地水解神经毒剂沙林和维 埃克斯巧）。更重要的是，表达G117H突变体的转基因小鼠对0P具有抗性（12)。虽然已 产生60种W上的B化E突变体，但G117H仍然是最高效的突变体之一并且迄今仍在被研究 巧）。然而，迄今为止，还未开发出在通过非侵入途径施用后在体内长时间高效地递送或产 生B化E或活性nrtB化E的四聚体形式的方法。
[0009] 因此，存在对开发递送B化EW预防和治疗对0P试剂的暴露的技术和方法的迫切 需要。本发明通过提供用于此类治疗和/或预防的基于阳离子-脂质体的药物递送系统来 满足运些需要。
[0010] 发明概述
[0011] 在一个实施方案中，提供了治疗或预防哺乳动物的与对有机憐憐酸盐试剂的暴露 相关的毒性的方法。此类方法适当地包括对哺乳动物施用阳离子脂质体复合物，其中所述 阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、直接与阳离子脂质体复合（但非化学缀合于其） 的配体、与阳离子脂质体结合的编码下酷胆碱醋酶度Ch巧的核酸分子和与阳离子脂质体 结合的编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子。
[0012] 在实施方案中，通过选自如下途径的途径施用所述复合物：鼻内施用、静脉内施 用、口服施用、舌下施用、肌内施用、病灶内施用、皮内施用、透皮施用、眼内施用、腹膜内施 用、经皮施用、气务剂施用、器巨内施用、脑内施用、局部施用、皮下施用、内规镜施用、绘释 植入物、通过渗透或机械累的施用和通过吸入的施用。
[0013] 适当地，所述配体是转铁蛋白、抗体和抗体片段，包括单链Fv抗体片段，诸如抗转 铁蛋白受体单链Fv灯fRscFv)。
[0014] 在其它实施方案中，配体祀向阳离子脂质体还包含与阳离子脂质体结合的含有 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQIDN0:1)肤的肤。
[0015] 适当地，编码B化E的核酸分子被包含在第一质粒中并且编码富含聚脯氨酸的肤 的核酸分子被包含在第二质粒中。在实施方案中，编码B化E的核酸分子被包含于第一质粒 构建体，其从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；化）巨细胞病毒（CMV)启动 子；（C)多克隆位点；(d)编码B化E的核酸分子；和（e)SV40多聚A序列，其中当与野生型 腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。在实施方案中， 编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子被包含于第二质粒构建体，其从5'至3'包含：(a)至少 一个人腺病毒增强子序列；化）巨细胞病毒（CMV)启动子；（c)多克隆位点；（d)编码富含聚 脯氨酸的肤的核酸分子；和（e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质 粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
[0016] 或者，编码B化E的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子存在于相同的 构建体中，但编码B化E的核酸分子被置于美国公开专利申请号2007/0065432中公开的 高表达启动子的下游，而编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子被置于标准启动子诸如RSV或 CMV的下游。
[0017] 适当地，B化E是B化E的突变形式，包括B化E的突变形式为G117H突变体。
[0018] 在示例性实施方案中，阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中 性或辅助脂质的混合物。适当地，配体和阳离子脂质体W在约1:1至约l:l〇〇(w:w)的范围 内的比率，例如在约1:10至约1:50 (w:w)的范围内的比率或在约1:20至约1:40 (w:w)的 范围内的比率存在。
[0019] 在实施方案中，阳离子脂质体包含二油酷=甲基憐酸锭与二油酷憐脂酷乙醇胺和 胆固醇的混合物；二油酷=甲基憐酸锭与胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基漠化锭与二 油酷憐脂酷乙醇胺和胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基漠化锭与二油酷憐脂酷乙醇胺的 混合物；双十八烷基二甲基漠化锭与胆固醇的混合物或二油酷=甲基憐酸锭与二油酷憐脂 酷乙醇胺的混合物。
[0020] 适当地，阳离子免疫脂质体复合物中的核酸分子W约10:1至约1:1〇(编码下酷 胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的 摩尔比存在，或核酸分子W约5:1至约1:5(编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔 数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子W 约4:1 (编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分 子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子W约2:1(编码下酷胆碱醋酶度化巧的 核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适 当地，核酸分子W约1:1 (编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯 氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在。
[0021] 在实施方案中，核酸分子的总量W约1:1至约l:40(yg核酸：yg脂质体）或 约1:5至约l:20(yg总核酸：yg脂质体）的重量比存，或更适当地核酸分子的总量W约 1:10(yg总核酸：yg脂质体）的重量比存在。
[0022] 适当地，施用复合物W治疗与对至少lxLDs。的有机憐酸盐试剂的暴露相关的毒 性，更适当地W治疗与对多至lOxLDs。的有机憐酸盐试剂的暴露相关的毒性。在实施方 案中，施用复合物W预防与对至少lxLDs。的有机憐酸盐试剂的暴露、更适当地对多至lOx LDw的有机憐酸盐试剂的暴露相关的毒性。
[0023] 在实施方案中，在对有机憐酸盐试剂暴露之前或之后立即施用复合物。在其它实 施方案中，在对有机憐酸盐试剂的潜在暴露之前至少6小时施用复合物。适当地，在对有机 憐酸盐试剂的潜在暴露之前至少一周一次地施用复合物。
[0024] 适当地，哺乳动物是人。
[0025] 还提供了治疗人的与对有机憐酸盐试剂的暴露相关的毒性的方法。此类方法适当 地包括对人鼻内或通过气雾剂吸入施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合物包 含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合（但非化合缀合于其）的抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码下酷胆碱醋酶度化巧的核 酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子。 适当地，ITRscFv和阳离子脂质体W在约1:20至约1:40 (w:w)的范围内的比率存在，并且核 酸分子W约1:5至约l:20(yg核酸：yg脂质体）的比率存在。适当地，阳离子免疫脂质 体复合物中的核酸分子W约10:1至约1:1〇(编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔 数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或核酸分子W约5:1至 约1:5的摩尔比（编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的 肤的核酸分子的摩尔数）存在，或更适当地，核酸分子W约4:1 (编码下酷胆碱醋酶度化巧 的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更 适当地，核酸分子W约2:1 (编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚 脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子W约1:1 (编码下 酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数） 的摩尔比存在。在实施方案中，施用复合物W治疗与对至少lxLDw的有机憐酸盐试剂的暴 露相关的毒性。
[0026] 还提供了用于预防人的与对有机憐酸盐试剂的暴露相关的毒性的方法。此类方法 适当地包括对人鼻内或通过气雾剂吸放施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合 物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合（但非化学缀合于其）的抗转铁蛋白受体 单链FvOTRscFv)、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码下酷胆碱醋酶度化巧 的核酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肤的核酸 分子。适当地，TTRscFv和阳离子脂质体W在约1:20至约1:40 (w:w)的范围内的比率存在， 并且核酸分子W约1:5至约1:20 (yg核酸：yg脂质体）的比率存在。适当地，阳离子免疫 脂质体复合物中的核酸分子W约10:1至约1:1〇(编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的 摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或核酸分子W约5:1 至约1:5 (编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸 分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子W约4:1(编码下酷胆碱醋酶度化巧 的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更 适当地，核酸分子W约2:1 (编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚 脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子W约1:1 (编码下 酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数） 的摩尔比存在。在实施方案中，施用复合物W预防与对至少lxLDs。的有机憐酸盐试剂的暴 露相关的毒性。
[0027] 还提供了将下酷胆碱醋酶度化巧递送至哺乳动物的血流的方法。此类方法适当 地包括对哺乳动物鼻内或通过气雾剂吸入施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复 合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合（但非化学缀合于其）的抗转铁蛋白受 体单链Fv(TfRscFv)、阳离子脂质体、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码下酷 胆碱醋酶度化巧的核酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯 氨酸的肤的核酸分子。适当地，ITRscFv与阳离子脂质体W在约1:20至约l:40(w:w)的范 围内的比率存在，核酸分子W约1:5至约l:20(yg核酸：yg脂质体）的比率存在。适当 地，阳离子免疫脂质体复合物中的核酸分子W约10:1至约1:10 (编码下酷胆碱醋酶度化巧 的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或核 酸分子W约5:1至约1:5(编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯 氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子W约4:1 (编码下酷 胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的 摩尔比存在或更适当地，核酸分子W约2:1 (编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔 数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子的摩尔数）的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子W 约1:1 (编码下酷胆碱醋酶度化巧的核酸分子的摩尔数：编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分 子的摩尔数）的摩尔比存在。在实施方案中，施用复合物W导致至少250mg/70kg度化E的 重量/人的重量）的人血流中的B化E的量。
[0028] 或者，编码B化E的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子存在于相同的 构建体中，但编码B化E的核酸分子被置于美国公开专利申请号2007/0065432 (通过引用W 其整体并入本文）中公开的高表达启动子的下游，而编码富含聚脯氨酸的肤的核酸分子被 置于标准启动子诸如RSV或CMV的下游。
[0029] 附图概述
[0030] 图1显示在来自祀向阳离子免疫脂质体递送的转移瘤中转基因表达的存在。
[0031] 图2显示作为将基因置于本文中所述的高表达启动子的控制下的结果的蛋白质 表达的增加。
[0032] 图3A和3B显示至利用具有含有GFP基因的pSCMV高表达质粒（图3A)或具有巧 光标记的寡核巧酸（图3B)的scL注射的Ba化/C小鼠的脑的scL递送。
[0033] 图4A-4B显示通过颈内静脉置管在大鼠中注射的祀向1TR并且具有编码GFP的质 粒（lOOygcDNA)的脂质体复合物的脑切片。
[0034] 图5显示在对Ba化/c小鼠鼻内施用后，W游离（未被封装的）或scL封装的质粒 DNA形式存在的巧光素酶基因的表达水平。
[0035] 图6显示使用检测E服I和E服II蛋白的抗体进行的总细胞蛋白质的Western分 析。
[0036] 图7显示将wt-BChE、mt-BChE和ppro基因亚克隆进pSCMV载体的结果。
[0037] 图8显示wt-B化E、mt-B化E和卵ro基因在pSCMV载体中的超螺旋结构的百分比。
[0038] 图9显示在用递增量的sckm巧化E/ppro复合物中的DNA转染后C册-K1细胞中 的B化E的表达水平。
[0039] 图10显示在用scL-m巧化E/ppro复合物体外转染A549细胞后16天B化E的表达。
[0040] 图11显示在用scL-nrtB化E/ppro复合物体外转染A549细胞后28天B化E的表达。 [00川发明详述
[0042] 术语"复合物"、"纳米复合物"、"脂质体复合物"和"纳米脂质体"在本说明书 中可互换地用于指本文中公开的阳离子脂质体。用于本发明的实践的示例性阳离子脂质体 及其产生方法公开于美国公开专利申请号2003/0044407和2007/0065499中，其每一个的 公开内容通过引用W其整体并入本文。
[0043] 如本文中所用，术语"约"是指引用值，W及在该引用值的10%内的值。例如，" 约100皿"包括90皿至110皿的值，包括在该范围之间的值。
[0044] 如本文中所用，术语"配体"是指可化学缀合于阳离子脂质体或与其直接结合/ 复合（但非化学缀合于其）的任何合适的祀向部分。用于本发明的实践的示例性配体包 括，但不限于，蛋白质（例如，转铁蛋白或叶酸）、肤（例如，L-37pA)、抗体、抗体片段（包括 Fab'片段和单链Fv片段）和糖类（例如，半乳糖）化及其它祀向分子。
[0045] 示例性方法和组合物公开于美国公开专利申请号2003/0044407和2007/0065499 中，其中按照本发明的实施方案的复合物通过简单高效的非化学缀合来产生。示例性方法 和组合物公开于美国专利号7, 479, 276中，其中按照本发明的实施方案的复合物通过化学 缀合来产生。运些专利和专利申请的每一个的公开内容通过引用W其整体并入本文。
[0046] 在示例性实施方案中，完整抗体或抗体片段可用作制备本发明的复合物的配体。 在适当的实施方案中，使用抗体片段，包括抗体的F油片段和单链Fv片段（scFv)。一 种合适的抗体是抗转铁蛋白受体（抗TfR)单克隆抗体，并且合适的抗体片段是基于抗 1TR单克隆抗体的scFv。合适的抗1TR单克隆抗体是祀9(参见，例如，化yes，B.F.，等 人，"CharacterizationofaMonoclonalAntibody巧E9)thatDefinesaHumanCell SurfaceAntigenofCellActivation, "J.Immunol. 127:347-352 (1981) ;Batra,J.K.， 等人，"Single-chainTmmunotoxinsDirectedattheHumanTransferrinReceptor ContainingPseudomonasExotoxinAorDiphtheriaToxin:anti-TFR(Fv)-PE40and DT388-anti-TFR(Fv), "Mol.Cell.Biol. 11:2200-2205(1991)(其公开内容通过引用并入本 文）。基于完全抗ITR单克隆抗体的scFv含有被该MAb识别的ITR的表位的完整抗体结合 部位（作为分子量约为26, 000的单链多肤）。scFv通过将分别来自重链和轻链的组分VH 和化可变结构域与适当地设计的肤连接来形成，所述肤桥连第一可变区的C末端和第二可 变区的N末端，顺序为VH-肤-VL或Vk肤-VH。另外的配体，诸如本说明书中描述的配体， 也可用于本发明的实践。
[0047] 在一个实施方案中，将半脫氨酸部分（moiety)添加至scFv的C末端。虽然不希 望受理论束缚，但据信，提供游离琉基的半脫氨酸可在化学缀合和非化学缀合实施方案中 增强抗体与脂质体之间的复合物的形成。在使用或不使用半脫氨酸的情况下，可在大肠杆 菌巧.coli)的包涵体中表达蛋白，随后重折叠W产生呈活性形式的抗体片段。
[0048] 除非想要在复合物的形成中使用空间上稳定的脂质体，否则制备本发明的示例 性非化学缀合的复合物中的第一步骤包括将阳离子脂质体或脂质体与选择的抗体或抗体 片段的组合混合。各种阳离子脂质体可用于本发明的复合物的制备。公开的PCT申请 W099/25320(其公开内容通过引用W其整体并入本文）描述了几种阳离子脂质体的制备。 合适的脂质体的实例包括憐脂酷胆碱（PC)、憐脂酷丝氨酸（P巧和包含二油酷=甲基憐酸 锭值0TA巧与二油酷憐脂酷乙醇胺值0P巧的混合物、D0TAP与DO阳和/或胆固醇（chol) 的混合物；双十八烷基二甲基漠化锭值DAB)和DO阳和/或chol的混合物或DDAB与DOPE 的混合物。脂质的比率可被改变W优化特定祀细胞类型对治疗性分子的摄取效率。脂质体 可包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的混合物。所需的阳离子脂质 对中性或辅助脂质的比率为约1: (0. 5-3)，优选地1: (1-2)(摩尔比）。
[0049] 适当的配体，例如，蛋白质/肤、抗体或抗体片段，是可结合祀细胞的表面，和优选 地结合在祀细胞上差异表达的受体的配体。将配体在室溫下W在约1:10至约1:50、适当地 约1:20至约1:40 (w:w)的范围内的配体（例如，蛋白质）：脂质比率（重量：重量）与阳 离子脂质体或聚合物混合。
[0050] 让配体（例如，蛋白质/肤、抗体或抗体片段）和脂质体在室溫下短暂溫育，通常 约10-15分钟，随后将混合物与选择的治疗剂或诊断剂混合。可与脂质体复合物复合的治 疗性分子或试剂的实例包括基因、高分子量DNA(基因组DNA)、质粒DNA、反义寡核巧酸、肤、 核酶、核酸（包括siRNA、miRNA和反义核酸）、小分子、病毒颗粒、免疫调节剂、用于成像的 造影剂、蛋白质和化学试剂。
[0051] 将配体（例如，蛋白质/肤、抗体或抗体片段）和脂质体组合W在约0.5:1至约 1:40(y g的试剂：nmol的总脂质），适当地约1:10至1:20(y g的试剂：nmole的总脂质） 的范围内的比率与治疗剂混合，并在室溫下短暂溫育，通常约10至15分钟。对于体内使 用，将50%葡萄糖或50%薦糖添加至5-20% (V:V)的终浓度并通过轻轻翻转混合5-10秒， 或对于更大体积，W20-30RPM旋转1-2分钟。如使用MalvernZETASIZER?3000 或MalvernZETASIZER?NANO-ZS通过动态光散射测量的，脂质体复合物的尺寸通 常在约50-500nm的范围内。参见美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号 11/520, 796,其公开内容通过引用W其整体并入本文。
[0052] 在本发明的一个实施方案中，用于形成复合物的脂质体是空间上稳定的脂质体。 空间上稳定的脂质体是已将亲水性聚合物诸如阳G、聚（2-乙基丙締酸）或聚（n-异丙基丙 締酷胺HPNIPAM)整合进其中的脂质体。当与治疗剂复合时，此类经修饰的脂质体可W是 特别有用的，因为它们被网状内皮系统从血流清除的速度通常没有未被运样修饰的可比较 的脂质体快。为了制备本发明的空间上稳定的脂质体复合物，将混合抗体或抗体片段、脂质 体和治疗剂或诊断剂的顺序从上文所示的顺序反过来。在第一步骤中，首先将上述阳离子 脂质体与上述治疗剂W在约0. 5:1至约1:40 (yg的试剂：nmol的脂质）、适当地约1:10至 1:20(yg的试剂：nmole的脂质）的范围内的比率混合。W约0. 1:1〇〇(皿〇1的阳G:nmol 的脂质体）、适当地约0. 5:50 (例如约1:40 (nmol的PEG:nmol的脂质体））的比率向该脂复 合物中添加