双重聚糖结合aav载体的方法和组合物的制作方法
【专利说明】双重聚糖结合AAV载体的方法和组合物
[0001] 优先权声明 本申请根据35U.S.C. § 119 (e)要求于2013年3月15日提交的美国临时申请序 列号61/802, 111的权益，所述美国临时申请的完整内容通过引用并入本文。
[0002] 政府支持声明 本发明根据由美国国立卫生研究院（化tional Institutes of Health)授予的授权号R〇mL089221、P〇mL112761和R01AI072176在政府支持下进行。美国政府在本发明中拥有 一定权利。 发明领域
[0003] 本发明设及来自腺伴随病毒（AAV)的经修饰的衣壳蛋白、包含其的病毒衣壳和病 毒载体及其使用方法。
[0004] 发明背景 病毒-聚糖相互作用是宿主细胞侵入的关键决定因素。细胞表面碳水化合物例如唾液 酸、神经节巧脂或硫酸类肝素由大量病毒采用，所述病毒例如流感、瘤疹病毒、SV40、多瘤病 毒、乳头状瘤病毒及其他病原体I'2。在大多数情况下，单个类别的聚糖主要充当病毒的细胞 表面附着因子，导致其他受体/辅受体的序贯或平行衔接用于细胞进入。腺伴随病毒（AAV) 是辅助依赖性细小病毒，其采用硫酸类肝素（HS)、半乳糖（Gal)或唾液酸（Sia)作为细胞表 面结合的主要受体3'4。例如，AAV血清型2和3b利用HS;AAV1、4和5W不同连接特异性结 合Sia，而AAV9采用Gal用于宿主细胞附着。不同的AAV毒株还需要与辅受体的后续相互 作用用于细胞摄取，所述辅受体例如整联蛋白aVP5或a56 1、成纤维细胞生长因子受体 (FGFR)、血小板来源的生长因子受体（PDGFR)、表皮生长因子受体（EGFR)、肝细胞生长因子 受体（HGFR)或层粘连蛋白受体3'4。
[0005] 特定AAV毒株和单个类别的碳水化合物之间的单配关系的显著例外是AAV血清型 6,其识别Sia和HS5。然而，仅Sia已显示是病毒转导必需的。结构研究目前已确定在AAV6 衣壳的VP3亚基中与R488、K528和K533结合的K531残基构成服葡萄氨基葡聚糖的静电 识别的连续基本片（patch)68。类似地，通过AAV2和AAV3b的服识别的结构基础是众所 周知的，并且归于位于=重对称轴处的碱性氨基酸残基的相似簇9I2。AAV1、AAV4、AAV5和 AAV6的Sia结合足迹（binding化otprint)仍有待确定。最近W来，设及通过AAV9衣壳的 Gal识别的关键氨基酸残基通过使用分子对接和定点诱变的组合进行鉴定"。需要的是具 有多重聚糖结合能力的病毒载体，W采用替代途径用于细胞进入和转导。
[0006] 本发明通过提供具有多重聚糖结合位点的经修饰的衣壳蛋白、包含运些衣壳蛋白 的AAV载体和其用作治疗载体的方法，克服了本领域中的前述缺点。
[0007]发明概述 在一个方面，本发明提供了包含一个或多个氨基酸取代的腺伴随病毒（AAV)衣壳蛋白， 其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白内。在一些实施方案中，氨基酸取代 在AAV2中的氨基酸266、氨基酸463-475和氨基酸499-502中，或者AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8或AAVIO中的相应氨基酸位置中。
[0008] 在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可W是己糖结合位点，其中所述己糖是半 乳糖（Gal)、甘露糖（Man)、葡萄糖（Glu)或岩藻糖（化C)。
[0009] 在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可W是唾液酸（Sia)结合位点，其中所述 Sia残基是N-乙酷神经氨酸（Neu5Ac)或N-径乙酷神经氨酸（Neu5Gc)。
[0010] 在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可W是二糖结合位点，其中所述二糖是W 形式Sia(a2, 3)Gal或Sia(a2, 6)Gal与半乳糖连接的唾液酸。
[0011] 在一些实施方案中，取代将来自第一AAV血清型的新的聚糖结合位点引入第二 AAV血清型的衣壳蛋白内，所述第二AAV血清型不同于所述第一AAV血清型。
[0012] 本发明还提供了包含本发明的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳。
[0013] 本文进一步提供的是包含本发明的AAV衣壳的病毒载体，W及包含在药学上可接 受的载体中的本发明的AAV衣壳蛋白、AAV衣壳和/或病毒载体的组合物。
[0014] 本发明另外提供了将核酸引入细胞内的方法，其包括使细胞与本发明的病毒载体 接触。细胞可W在主体中，并且在一些实施方案中，主体可W是人主体。
[0015] 本发明的运些及其他方面在下文阐述的本发明的说明书中更详细地描述。
[0016] 附图简述 图1. 44￥1、44￥2、44￥6、44￥8和44￥9￥?3单体的结构比对。（曰）44￥1(紫蓝色)、4八￥2 (深蓝色)、AAV6 (浅品红色)、AAV8 (绿色）和AAV9 (褐色）的VP3单体的重叠，其中标记了 环I-IX，并且指出了对称轴。（b)在AAV9上的半乳糖结合位点W及在AAV1、AAV2、AAV6和 AAV8上的等价残基的覆盖的特写视图。氨基酸残基通过（a)中的色码进行标记。坐标得自 VP单体（PDB登录 #:AAV1-3NG9、AAV2-1LP3、AAV6-30AH、AAV8-2QA0、AAV9-3UX1)的X射线 晶体学结构。结果比对使用PyMOL执行且显现。
[0017] 图2.G-突变体利用Gal作为新型受体W在体外转导细胞。（a)AAVl、1G9和AAV9 对中国仓鼠卵巢（CH0)细胞系的转导效率。在4°C下W1000vg/细胞的M0I的AAV-CBA-蛋 光素酶感染60分钟之前，使Pro5和Lec2细胞预冷至4°C共30分钟。在通过用冰冷的PBS的 =次洗涂去除未结合的病毒粒子之后，将受感染细胞在37°C溫箱中培养24小时。执行发光 分析，W定量来自细胞裂解产物的蛋光素酶转基因表达效率。（b)AAV2i8、2i8G9和AAV9对 Pro5和Lec2细胞的转导效率。（c)AAV6、6G9和AAV9对Pro5和Lec2细胞的转导效率。（d) AAV8、8G9和AAV9对Pro5和Lec2细胞的转导效率。结果呈现为平均值±S.e.m. (n=4)。 统计学显著性使用单尾斯氏f检验进行评价（n.s.，不显著；*p< 0. 05 ;**p< 0. 01)。 [001引图3.双重聚糖结合AAV2G9嵌合体及其亲本株AAV2和AAV9的S维模型。（A)具 有分别W紫色和澄色着色的现有服和"移植"Gal结合位点的完整AAV2G9衣壳的S维结构 模型。（B-D)在AAV2 (B)、AAV9 (C)和AAV2G9 (D)衣壳的S重对称轴处的VP3S聚体的 S维表面模型的图示。设及服结合（AAV2VP1编号：3487、1(527、1(532、1?585、1?588)和6曰1 结合（AAV9VP1 编号：D271、N272、Y446、M70、A472、V473、W503)的残基如（A)中突出显 示。黑色=角形指示=重对称轴。
[001引图4.双重聚糖结合AAV2G9嵌合体的体外表征。U-C)用FITC-E化和可溶性肝素 抑制AAV2U)、AAV9 (筑和AAV2G9 (C)对CH0Lec2 细胞的转导。在用AAV2、AAV9 或AAV2G9 包装CBA-蛋光素酶报道转基因盒感染之前，使CH0Lec2细胞在4°C下预冷，且与FITC-E化、 可溶性肝素或两者一起溫育。转导效率在感染后24小时作为W相对光单位（RLU)表示的 蛋光素酶活性进行测量。转基因表达的百分比通过使转导效率针对来自对照的RLU标准化 进行计算。结果呈现为平均值±s.e.m. (n=4)。（Z?-巧用FITC-E化和可溶性肝素竞争抑 制AAV2 (化、AAV9 (巧和AAV2G9 (巧在CHOLec2细胞上的细胞表面结合。不同AAV颗粒 与在4°C下预冷的细胞结合，并且通过用冰冷的PBS洗涂去除未结合的病毒粒子。在病毒基 因组提取后，使用qPCR定量结合的病毒粒子。通过使结合病毒粒子的数目针对相应对照的 那种标准化，来测定结合的病毒粒子的百分比。结果呈现为平均值±s.e.m.(n=5)。统计 学显著性使用单尾斯氏f检验进行分析（*P< 0.05;**p< 0.01)。
[0020] 图5.在感染后0小时（hpi)，在Lec2细胞表面上的结合病毒粒子的免疫巧光。 CH0Lec2细胞在12mm盖玻片上W5xl04细胞/盖玻片的密度铺平板过夜。在4°C下预冷 30分钟后，Lec2细胞用AAV2、AAV2G9和AAV9W1000vg/细胞的M0I在4°C下感染30分 钟。在去除未结合的病毒粒子之后，将细胞用在IxPBS中的2%多聚甲醒固定。使用单克隆 抗体（A20用于AAV2/AAV2G9和ADK9用于AAV9)检测完整病毒粒子，作为来自在免疫巧光 洗涂缓冲液（IFWB)中1:10稀释的相应杂交瘤培养物的培养基上清液获得。AlexaFluor 59少山羊抗小鼠IgGW在IFWB中1:1000的稀释度用作免疫巧光检测的二抗。盖玻片随后 固定到在具有DAPI的Prolong?Gold抗稱色试剂中的玻璃载玻片上。使用配备63x油浸 物镜和专口检测系统的Zeiss? 710共聚焦激光扫描显微镜获取巧光显微照片。图像处理 使用LSM*观察器和Image 软件来进行。白色比例尺指示10化。
[0021] 图6.通过AAV2衣壳或AAV9衣壳竞争抑制AAV2G9对Lec2细胞的转导。在 用AAV2G9-CBA-LUC颗粒（M0I1000vg/细胞）感染之前，使Lec2细胞与U)AAV2或（筑 AAV9-CBA-tdTomatoW范围为500 - 100, 000vg/细胞的感染复数（M0I) -起预溫育2小 时。通过使蛋光素酶转基因表达水平针对未经处理的对照的那种标准化，来计算AAV2G9转 导的抑制百分比。结果呈现为平均值±s.e.m. (n=4)。统计学显著性使用单尾斯氏f检 验进行分析（*P< 0.05;**p< 0.01)。
[002引图7.在感染后的所示时间点，与亲本AAV2和AAV9相比较，AAV2G9对Lec2细胞 的转导效率概况的动力学。如所述的，用AAV2、AAV2G9或AAV9-CBA-蛋光素酶载体W1000 vg/细胞的M0I感染预冷的Lec2细胞。在感染后的所示时间点（18、24、28、42和54小时)， 细胞在发光分析之前进行裂解。蛋光素酶转基因表达通过W相对光单位（RLU)表示的细胞 裂解产物的蛋光素酶活性进行测量（11=5)。统计学显著性使用单尾斯氏^#验进行评价（* P< 0. 05;**p< 0. 01)。
[0023] 图8.AAV2G9在体内介导快速发作和增强的转基因表达。U)包装CBA-蛋光素酶 转基因盒的AAV2、AAV2G9和AAV9载体的体内转基因表达动力学。BALB/c小鼠（n=4 )通过 尾静脉WlxlQiivg/动物的剂量施用AAV载体，并且使用Xenogen?Lumina成像系统，在注 射后3、7和18天时收集生物发光图像。用在彩虹色标上的生物发光显示了代表性活动物 图像（Ixl05-lxl06光子/秒/cm^球面度)。AAV2G9维持AAV2的肝向性，但证实比两种亲 本AAV毒株更快速和强大的蛋光素酶信号。（妨巧C)通过标记W不同时间间隔获得的（筑 肝区和（C)整个动物的目的区（ROIs)周围图像，执行光信号输出(表示为光子/秒/cm2/球 面度）的动力学定量（11=4)。统计学显著性使用单尾斯氏^#验进行评价（11.S.，不显著；* P< 0. 05 ;**P< 0. 01)。
[0024] 图9.AAV2G9在小鼠中的转基因表达定量和生物分布概况。U)在第3和18天 时，来自AAV2 (黑色)、AAV2G9 (灰色）或AAV9 (白色）处理动物的屯、脏和肝组织裂解产物的 蛋光素酶转基因表达的定量（n=4)。（筑在第3和18天时，得自施用AAV2 (黑色)、AAV2G9 (灰色)或AAV9 (白色)的BALB/c小鼠的肝和屯、脏裂解产物中的载体基因组的生物分布。在 所示时间点，宿主基因组DNA和病毒基因组从组织裂解产物中分离，并且使用qPCR与对于 小鼠核纤层蛋白基因和蛋光素酶转基因特异性的引物组进行定量。结果呈现为平均值± s.e.m. (n=4)。统计学显著性使用单尾斯氏f检验进行评价（n.s.，不显著；*P< 0.05; 林P< 0. 01)。
[00巧]图10.包装CBA-蛋光素酶转基因盒的AAV2i8、2i8G9和AAV9载体的体内转基因 表达动力学。BALB/c小鼠（n=4)通过尾静脉WlxlQiivg/动物的剂量施用AAV载体，并且 使用Xenogen?Lumina成像系统，在注射后3、7和18天时收集生物发光图像。用在彩虹色 标上表示的生物发光显示了代表性活动物图像（1〇 5-1〇6光子/秒/cm^球面度)。
[002引图11.在新生小鼠中的代表性AAV"G9 "毒株的CNS向性概况。使用含有由杂合 鸡P肌动蛋白（CBh)启动子驱动的GFP转基因的3. 5xl0e9AAV载体基因组，将出生后0 (P0)幼盧（n=3)单侧注射到左侧脑室内。在注射后2周时，GFP免疫组织化学掲示在鼠脑 内，关于每种AAV"G9"毒株的差异传播、区域和细胞向性。
[0027] 发明详述 本发明现在参考附图进行描述，其中显示了本发明的代表性实施方案。然而，本发明 可不同形式体现，并且不应解释为限制于本文阐述的实施方案。相反，提供运些实施方 案，W便本公开内容将是彻底和完整的，并且将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。
[0028] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普 通技术人员通常理解相同的含义。在本文中本发明的说明书中使用的术语仅用于描述特定 实施方案的目的，并且不预期限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他 参考文献通过引用全文并入本文。
[0029] 本发明基于AAV衣壳蛋白上的"袋（pocket)"的发现，所述袋限定聚糖识别足迹。 限定该袋的特异性氨基酸已得到鉴定且在本文中得到描述，例如关于AAV9的半乳糖结合 位点。在本发明中，将该AAV9半乳糖结合足迹移植到AAV2衣壳蛋白模板内，导致在植入的 AAV2衣壳蛋白模板中引入新的聚糖结合位点。通过取代例如显示于本文表3中的相应氨基 酸，可朗尋该AAV半乳糖结合足迹引入任何其他AAV血清型内。
[0030] 因此，本发明设及聚糖识别足迹从一种AAV毒株分子移植到另一种AAV毒株上，其 通过结构建模研究进行指导，并且通过定点诱变来实现。包装报道盒的重组载体(来源于运 些新毒株）在细胞培养和动物模型中展示快速发作和增强的转基因表达。使用天然存在的 血清型/分离物作为模板，可W应用该通用策略，W生成合成双重聚糖结合AAV毒株的实验 对象组，其可W解决例如在人基因疗法临床试验中观察到的剂量依赖性免疫毒性的挑战。
[0031] 因此，在一个方面，本发明提供了包含一个或多个氨基酸取代的腺伴随病毒（AAV) 衣壳蛋白，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白内。在一些实施方案中，氨 基酸取代在AAV2中的氨基酸266、氨基酸463-475和氨基酸499-502中，或者AAV1、AAV3、 AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10或如表3中鉴定的任何其他AAV血清型中的相应氨基 酸位置中。
[0032] 在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可W是己糖结合位点，其中所述己糖为半 乳糖（Gal)、甘露糖（Man)、葡萄糖（Glu)或岩藻糖（化C)。
[0033] 在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可W是唾液酸（Sia)结合位点，其中所述 Sia残基是N-乙酷神经氨酸（Neu5Ac)或N-径乙酷神经氨酸（Neu5Gc)。
[0034] 在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可W是二糖结合位点，其中所述二糖是W 形式Sia(a2, 3)Gal或Sia(a2, 6)Gal,与半乳糖连接的唾液酸。
[0035] 在一些实施方案中，取代将来自第一AAV血清型("供体"）的衣壳蛋白的新的聚糖 结合位点引入第二AAV血清型（"模板"）的衣壳蛋白内，所述第二AAV血清型不同于所述第 一AAV血清型。
[0036] 本发明还提供了包含本发明的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳。
[0037] 本文进一步提供的是包含本发明的AAV衣壳的病毒载体，W及包含在药学上可接 受的载体中的本发明的AAV衣壳蛋白、AAV衣壳和/或病毒载体的组合物。
[0038] 本发明另外提供了将核酸引入细胞内的方法，其包括使细胞与本发明的病毒载体 接触。细胞可W在主体中，并且在一些实施方案中，主体可W是人主体。
[0039] 在一些示例性实施方案中，AAV衣壳蛋白供体可W是AAV血清型9,并且AAV衣壳 蛋白模板可W是AAV血清型1 (AAV1)、AAV血清型2 (AAV2)、AAV血清型3a(AAV3a)、AAV 血清型 3b(AAV3b)、AAV血清型 4 (AAV4)、AAV血清型 5 (AAV5)、AAV血清型 6 (AAV6)、AAV 血清型 7 (AAV7)、AAV血清型 8 (AAV8)、或AAV血清型 10 (AAVIO)。
[0040] 在一些示例性实施方案中，AAV衣壳蛋白模板可w来自AAV2,并且a)在氨基酸266 处的取代是A266S;b)在氨基酸 463-475 处的取代是SQAGASDI畑QSR463-475SX1AGX2SX3X4X5X eQXyR，其中Xi_ 7可W是任何氨基酸；和C)在氨基酸499-502处的取代是EYSW499-502EXsXgW， 其中Xgg可W是任何氨基酸。在一些实施方案中，Xi可W是V;乂2可W是P;乂3_(5可^是NMAV; 并且X,可W是G，导致序列SVAGPSNMAVQGR。在一些实施方案中，Xs可W是F，并且Xg可W 是W，导致序列EFAW。
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