共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体地说，是共载盐霉素与阿霉素纳米脂质体，其制备 方法及其在肝癌治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 根据美国肿瘤协会（ACS)调查分析，从全世界肝癌分布区域图发现，不论是男性 还是女性，中国是世界肝癌发病率最高的国家，目前治疗肝癌的主要手段是手术和放疗，但 是治愈效果均不理想。因此，开展药物对肝癌的治疗的研究是非常迫切的。
[0003] 肿瘤干细胞（CSCs)是能产生肿瘤细胞的一个亚群，在肿瘤的发生、转移、复发中 起着关键作用。因此，在肿瘤的治疗过程中对肿瘤干细胞的作用是非常关键的。尽管目前 研究者们对此提出了很多策略，肿瘤干细胞的消除仍然是很困难的。传统的化疗药物如多 柔比星（阿霉素）和紫杉醇可以杀死多数肿瘤细胞，但是对肿瘤干细胞的作用极弱甚至耐 药，从而导致肿瘤中肿瘤干细胞比例的升高。研究人员通过高通量筛选等方法鉴定出几种 旧的药物（如全反式维甲酸、二甲双胍、盐霉素、硫利达嗪、姜黄素）具有对抗肿瘤干细胞的 作用。盐霉素，是一种环醚类的离子载体抗生素，可以作用于多种肿瘤干细胞。实际上，根 据最新非肿瘤干细胞向肿瘤干细胞转化的依据，同时清除非肿瘤干细胞和肿瘤干细胞可以 最大程度的提高肿瘤患者的预后。
[0004] 盐霉素，是一种脂溶性药物，难溶于水，在体液循环中难以达到治疗浓度；而阿霉 素具有较大的心脏毒性及对正常细胞的毒副作用，降低剂量又很难达到治疗效果，因此，盐 霉素与阿霉素的联用也存在上述问题，迫切需要解决。
[0005] 纳米给药系统可为传统化疗药物和抗肿瘤干细胞药物的共同递送提供便利。为了 达到此目的，已经有多种纳米药物诞生，脂质体（liposome)因其具有独特的类似生物双分 子层脂质膜结构，具有良好的生物相容性，可以包载亲水性药物和疏水性药物，将其作为多 种药物尤其抗肿瘤药物的载体已得到广泛应用。脂质体作为抗肿瘤药物载体可以解决药物 的溶解性问题，稳定性问题和体内快速降解问题，通过调节脂质材料的比例可以控制药物 的包封率和释放速率，从而制备出具有抗肿瘤活性的，可控的长循环脂质体，为肿瘤的进一 步治疗奠定良好的制剂学基础。载药脂质体，可以以一种脂质体同时包载两种药物或是两 种单独的纳米脂质体药物的形式存在。这些共同递送传统化疗药物和抗肿瘤干细胞药物的 纳米给药系统在清除实体肿瘤和肿瘤干细胞的肿瘤治疗中均取得了优越的效果。
[0006] 单独载阿霉素纳米脂质体技术已比较成熟（R. Sadasivan, R. Morgan, C. Fabian, R. Stephens. Reversal of multidrug resistance in HL-60 cells by verapamil and 1iposome-encapsulated doxorubicinCancer Letters,Volume 57， Issue 2， 1 Mayl991，Pages 165-171)，而载盐霉素纳米脂质体的文献鲜有报道。且目前尚无文献报道 共载盐霉素与阿霉素的纳米脂质体、其制备方法和对肝癌干细胞和肝癌细胞的治疗作用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种共包载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体及其制备方法 和该纳米脂质体在治疗肝癌中的应用。
[0008] 本发明选择盐霉素钠-阿霉素联合给药基于以下两点原因：（1)两种药物分别作 用于肿瘤干细胞和肿瘤细胞。已报道盐霉素可以作用于多种肿瘤干细胞，而阿霉素是传统 的作用于肿瘤细胞的化疗药物。（2)盐酸阿霉素通过脱盐酸，可以转化为阿霉素，脂溶性增 加。盐霉素钠为脂溶性药物，盐霉素钠与阿霉素作为脂溶性药物共同包载于同一纳米脂质 体，更利于实现两种药物的协同释放。我们旨在通过纳米脂质体共包载盐霉素和阿霉素提 尚对肝癌干细胞和肝癌细胞的治疗作用。
[0009] 本发明选择一线化疗药物-阿霉素和抗肝癌干细胞特异性药物-盐霉素，将其分 别及共同包载入可生物降解、安全无毒的纳米脂质体中用于肝癌的靶向治疗。载阿霉素 (D0X)纳米脂质体（DLN)用于消除肿瘤内已分化的肝癌细胞，载盐霉素（SAL)的纳米脂质体 (SLN)用于消除肝癌干细胞，通过两种药物的脂质体联用SDLN与SLN+DLN实现同时杀伤肝 癌细胞与肝癌干细胞，以期实现肝癌的彻底治愈。
[0010] 本发明的技术方案包括：
[0011] 体外验证盐霉素与阿霉素对肝癌干细胞与肝癌细胞的特异性，筛选两种药物针对 肝癌细胞与肝癌干细胞的协同比例；本发明首次共包载不同剂量比例的盐霉素和阿霉素于 同一纳米脂质体中，实现两种药物以协同作用；
[0012] 共载盐霉素和阿霉素脂质体的制备；
[0013] 载药纳米脂质体的体外抗肝癌细胞与肝癌干细胞活性分析；
[0014] 载药纳米脂质体的体内药代动力学；
[0015] 载药纳米脂质体的体内抗肝肿瘤及肝癌干细胞活性分析。
[0016] 首先，肝癌干细胞的分选与鉴定。肝癌干细胞的分选方法有无血清悬浮培养分选、 磁珠分选、流式细胞仪分选等方法，本发明选择无血清悬浮培养的方法富集分选肝癌干细 胞。肝癌干细胞的鉴定通过干细胞的表型标记物CD133以及肝癌干细胞更易诱发肿瘤的产 生对其进行鉴定。
[0017] 其次，通过体外细胞实验验证盐霉素与阿霉素对肝癌干细胞与肝癌细胞的特异 性，筛选两种药物针对肝癌细胞与肝癌干细胞的协同比例。本发明采用CCK-8法测定经不 同药物、不同浓度处理后的细胞存活率，从而评价药物的细胞毒性。细胞的生存曲线经对 数模拟后，计算细胞的IC50来定量比较其细胞毒性大小。其次，本发明结合协同处理软件 Concusyn软件分析筛选不同比例盐霉素与阿霉素对肝癌细胞与肝癌干细胞的协同作用比 例。
[0018] 上述所述盐霉素浓度范围为1-1000 μ M，阿霉素浓度范围为0. 1-100 μ Μ ;盐霉素 与阿霉素间的比例范围为40:1-1:40 (摩尔比）；肝癌细胞与肝癌干细胞为肝癌细胞系及具 有干细胞特征的肝癌细胞，本发明中使用肝癌HepG2细胞作为肝癌细胞与由肝癌HepG2细胞 分选得到的IfepG2-TS作为肝癌干细胞。
[0019] 本发明的第一方面，提供一种共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体，由药物、磷 月旨、胆固醇类化合物及水化介质制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类物质的摩尔比为（1~ 10) : (60 ~100) : (0 ~40) 〇
[0020] 所述的药物为盐霉素类化合物和阿霉素类药物，盐霉素类药物包括盐霉素及其盐 类如盐霉素钠，阿霉素类药物包括阿霉素及其与酸所构成的盐类如盐酸阿霉素，盐霉素类 药物与阿霉素类药物的摩尔比为40:1~1:40,其比例可以根据实际需要任意调整，其摩尔 比优选为1:10~10:1，最优选为1:1。
[0021] 所述的磷脂可选用天然磷脂或合成磷脂中的一种或多种，其中天然磷脂为大豆 磷脂、卵磷脂中的一种或多种；合成磷脂为氢化大豆卵磷脂（HSPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)、1，2-二油酰基磷脂酰胆碱（D0PC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG) 中的一种或两种以上。
[0022] 所述的胆固醇类化合物为普通胆固醇。
[0023] 所述的水化介质可选用pH = 7. 4的HEPES缓冲液或PBS缓冲液，其作用为乳化 磷脂和胆固醇，从而得到纳米脂质体。
[0024] 本发明的第二方面，提供上述共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体的制备方法，采 用薄膜分散法，具体方法如下：
[0025] (A)配置水化介质；称取磷脂，胆固醇溶于有机溶剂；称取盐霉素类药物和阿霉素 类药物与三乙胺溶于甲醇；
[0026] (B)将药物与脂质混合均匀，连接旋转蒸发仪，转速为60-lOOrpm，水浴温度为 50-70°C，待脂质和药物成均匀薄膜后，水化介质于50-70°C进行水化30-60min，充氮气，对 纳米脂质体进行粒径均一，除去未包载的游离药物，即制备得到共载盐霉素和阿霉素的纳 米脂质体。
[0027] 优选的，上述共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体的制备方法，采用薄膜分散法，具 体方法如下：
[0028] 1)配置水化介质pH = 7. 4的HEPES缓冲液或PBS缓冲液；称取一定比例的氢化大 豆卵磷脂（HSPC)，胆固醇（CH0L)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG-2K) 溶于有机溶剂；称取一定量盐霉素钠，盐酸阿霉素与三乙胺溶于甲醇。
[0029] 2)将药物与脂质混合均匀，连接旋转蒸发仪，转速为60-100rpm，水浴温度为 50-70°C，待脂质和药物成均匀薄膜后，水化介质于50-70°C进行水化30-60min，充氮气，对 纳米脂质体进行粒径均一，除去未包载的盐霉素和阿霉素，即制备得共载盐霉素和阿霉素 的纳米脂质体。
[0030] 上述步骤㈧中的有机溶剂可选用甲醇或三氯甲烷（氯仿）。
[0031] 上述步骤（B)中完成共载盐霉素和阿霉素纳米脂质体的制备后，采用超声、依次 经过模孔直径为400, 200nm，100nm聚碳酸酯膜、微射流等方法对载药纳米脂质体进行粒径 均一，得到粒径约为l〇〇nm的载药纳米脂质体。
[0032] 上述步骤（B)中除去未包载游离药物的方法可以采用透析法或超速离心法。
[0033] 本发明的第三方面，提供上述任一共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体在制备治疗 肝癌药物中的应用。
[0034] 所述的共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体靶向已分化的肝癌细胞和肝癌干细胞。
[0035] 本发明采用CCK-8法测定肝癌细胞与肝癌干细胞在经不同浓度的载药纳米脂质 体联用处理后的细胞存活率，来评价载药纳米脂质体对肝癌细胞与肝癌干细胞的细胞