IL-11单克隆抗体在抑制PI3K/Akt信号通路中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于细胞内信号通路技术领域，具体涉及一种IL-1I单克隆抗体在抑制P13K/Akt信号通路中的应用。
【背景技术】
[0002]结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，五年存活率小于5%。故有关结肠癌发生发展的分子机制的研究备受关注。结肠癌的发生为多因素、多阶段及多基因变异的过程，涉及多个原癌基因和抑癌基因介导的分子事件，近年来，随着细胞生物学和分子生物学的发展，人们认识到绝大多数癌基因的表达产物都是细胞信号传导途径中的组成成分，它们可以从多个环节干扰细胞信号传导过程，导致肿瘤细胞增殖和分化。信号传导通路的异常改变也是肿瘤细胞的重要生物学特征，与肿瘤的发生、发展和预后直接相关。
[0003]近年来研究表明，PI3K/Akt信号通路在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用。PI3K/Akt主要是通过影响其下游的多种效应分子而发挥其抗凋亡作用的。目前，通过基因干预方法敲除或小分子药物抑制PI3K/Akt及相关基因，阻断其对下游多种抗凋亡效应分子的活化。促进细胞凋亡已经成为肿瘤治疗研究的焦点。目前已经发现了该信号通路中多种激酶的小分子抑制剂(small molecule inhibitors.SMIs)。它们具有选择性的抗肿瘤活性。Wortmannin和LY294002是两种广泛应用的PI3K抑制剂。它们特异性抑制PI3KpllO亚单位的催化活性。阻断PI 3K/Akt通路的活化，能有效的增加化疗药物对癌细胞的敏感性。但由于这两种抑制剂潜在的副作用，目前还都限于体外研究。
[0004]通过对肠癌组织的研究发现，当有癌症发生时，癌旁组织中的IL-1l分泌增多，增多的IL-1l会渗入癌症组织进入癌症细胞中，在这种情况下，癌细胞会增殖迅速、并且快速分化，这对肠癌的治疗十分不利。解决癌细胞快速增殖问题是目前治疗癌症的主要方向。本发明发现的IL-1l单克隆抗体能有效的抑制癌细胞的增殖，是治疗肠癌的新突破。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种IL-1I单克隆抗体在抑制PI3K/Akt信号通路中的应用，解决了现有技术中存在的信号通路抑制剂带来副作用的问题。
[0006]本发明所采用的技术方案是，IL-1l单克隆抗体在抑制PI3K/Akt信号通路中的应用。
[0007]进一步地，IL-1I单克隆抗体的浓度为8ug/mL。
[0008]进一步地，IL-1l单克隆抗体的用量为10ug。
[0009]本发明的有益效果是:本发明寻找到了一种安全有效的PI3K/Akt信号通路抑制剂(IL-11单克隆抗体)，该抑制剂能特异性的结合癌旁细胞分泌的IL-1l，诱导PTEN的转录，上调PTEN的表达，抑制P13K/Akt信号通路下游的AKT的表达，达到抑制整条信号通路的作用。该抑制剂是天然抗体，因而减少毒副作用，安全有效。
【附图说明】
[0010]图1本发明IL-1l浓度的筛选结果；
[0011 ]图2本发明IL-1I抗体浓度的筛选结果；
[0012]图3本发明IL-1I对细胞的增殖作用；
[0013]图4本发明细胞上清中PTEN的检测结果；
[0014]图5本发明细胞上清中AKT的检测结果；
[0015]图6本发明NF-KB的检测结果，其中，A=IL-1l刺激后NF-KB p65亚基随时间变化结果4144分别代表1211、2411、3611和4811时即-1^的检测结果;8:几-11抗体阻断后即-1^P65亚基随时间变化结果，B1-B4分别代表12h、24h、36h和48h时即-1^8的检测结果;(::空细胞对照组NF-KB p65亚基随时间变化结果，C1-C4分别代表12h、24h、36h和48h时NF-KB的检测结果。
【具体实施方式】
[0016]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0017]实施例1IL-1I对肠癌细胞增殖的作用
[0018]1.1L-1I浓度的筛选
[0019]将消化后的第3—5代HT-29细胞悬液按104/ml的浓度接种于12孔培养板，每孔2ml，置37°C、5 %⑶2培养箱中培养。12h贴壁后，弃去培养液，加入终浓度为(2、5、8、1ug/ml )IL-11的DMEM完全培养基2ml，同时设立不加IL-1I的细胞对照和重复对照。继续培养，在611、1211、2411、3611、4811向细胞中加入8011恤1'1'，继续培养411后加入150111二甲基亚砜，振荡10分后，0D490检测。
[0020]2.1L-1l对细胞增殖的作用
[0021 ]细胞悬液按104/ml的浓度接种于12孔培养板，每孔2ml，置37°C、5 % CO2培养箱中培养。12h贴壁后，弃去培养液，加入终浓度为8ug/ml IL-1I的DMEM完全培养基2ml，同时设立不加IL-1I的细胞对照和重复对照。继续培养，从第6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h向细胞中加入80ulMTT，继续培养4h后加入150ul 二甲基亚砜，振荡10分后，0D490检测。
[0022]3.1L-1l抗体浓度的筛选
[0023]几-11按8呢/1^浓度用?!19.6的碳酸盐缓冲液包被，每孔10(^，4°(3孵育过夜后，用
0.5%的脱脂乳封闭，每孔30(^，371孵育21!后，洗涤备用。取出包被好的检测板，每孔加入4呢、81^、10呢、151^单抗，37°(3孵育211、411、611、811，洗涤3次后每孔加入1:10000稀释的!11^标记的羊抗鼠IgG 100yL，37°C孵育lh，洗涤3次后进行TMB显色，37°C孵育lOmin，终止显色后，测定样品在450nm处的的吸光值。
[0024]4.抗体阻断后IL-1l对细胞增殖的作用
[0025]细胞悬液按104/ml的浓度接种于12孔培养板，每孔2ml，置37°C、5% CO2培养箱中培养。12h贴壁后，弃去培养液，加入终浓度为(8ug/ml )IL-11的DMEM完全培养基2ml，4h后加入体积为1ul (lug/uL) IL-1I抗体孵育4h，同时设立不加IL-1I抗体的细胞对照和重复对照。继续培养，从第611、1211、2411、3611、4811、6011、7211向细胞中加入80111^1'1'，继续培养411后加入150ul 二甲基亚砜，振荡10分后，0D490检测。
[0026]实施例2 IL-11对PI3K细胞信号通路中PTEN、AKT、NF-KB的作用
[0027]细胞悬液按5xl04/ml的浓度接种于12孔培养板(带爬片)，每孔2ml，置37°C、5%C02培养箱中培养。12h贴壁后，弃去培养液，实验分为两组，一组加入终浓度为(8ug/ml) IL-1I的DMEM完全培养基2ml，4h后加入体积为1ul IL-1I抗体孵育4h，另一组只加终浓度为(8ug/ml) IL-1I的DMEM完全培养基2ml，同时设立信号抑制剂对照组和重复组。继续培养，从第4h、6h、8h、12h收取细胞上清，用ELISA试剂盒检测PTEN、AKT;12h、24h、36h、48h收取细胞按说明书的操作步骤检测NF- K B的变化。
[0028]实施例3检测上述细胞上清中PTEN的含量
[0029]一、方法:
[0030]—)利用ELISA试剂盒检测上述细胞上清中PTEN的含量。
[0031]1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液10ul，余孔分别加标准品或待测样品10ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37°C反应120分钟。
[0032]2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液10ul (取Iul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37°C，60分钟。
[0033]3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。
[0034]4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)10ul，37°C，60分钟。
[0035]5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。
[0036]6.依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光显色(30分钟以内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
[0037]7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
[0038]8.用