酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(0D值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。
[0039]二)、利用ELISA试剂盒检测上述细胞上清中AKT的含量，操作同上。
[0040]三)、利用试剂盒检测NF-K B的变化。
[0041 ] 二、实验结果:
[0042]一)、IL-1I对细胞的增殖作用
[0043]UIL-1I浓度的筛选结果:
[0044]从图1可知，8ug/mL的IL-1l促肠癌细胞的增殖作用最显著。
[0045]IL-1I抗体浓度的筛选:从图2可知，1ug抗体孵育4h结合IL-1I的能力最强。
[0046]2、IL_11对细胞增殖的作用:
[0047]从图3可知，在IL-1I刺激细胞的48h，细胞数量达到最大值，之后出现生长稳定期，60h之后，细胞开始衰亡。IL-1I抗体阻断后，IL-1I促细胞的增殖作用不显著。由此可知，IL-11对肠癌细胞有促进增殖的作用。
[0048]二)IL-11对PI3K细胞信号通路中PTEN、AKT、NF-KB的作用结果
[0049]1、1.PTEN的检测结果
[0050]从图4可知，IL-11抑制PTEN的生成，而当IL-11抗体阻断后，PTEN的产生急剧上升，两组数据之间差异显著。而由于抑制剂的作用靶点不在PTEN，所以对PTEN的产生并无促进作用。
[0051]2、AKT的检测结果
[0052]从图5可知，IL-1l促进AKT的生成，而当IL-1l抗体阻断后，AKT的产生急剧下降，两组数据之间差异显著。抑制剂对信号通路的激活产生抑制作用，所以AKT含量下降。
[0053]3、NF_ K B的检测结果:
[0054]从图6可知，IL-1l抗体阻断后NF-KB的p65亚基一直处于胞浆中，并未向胞核转移，说明NF- K B并未变化，当用IL-1I刺激后12h时，p65亚基开始向核转位，24h p65亚基向细胞核中转移增多，NF- K B随时间变化，表明IL-1I与细胞内的PI3K信号通路相关，IL-1I的存在决定细胞内PI3K信号通路的变化。
[0055]PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号通路，与细胞的增殖和调控有关。PTEN是P13K/AKT信号通路中重要的负调控蛋白，可抑制P13K/AKT信号通路的激活;AKT是P13K/AKT信号通路下游重要的功能蛋白，AKT的产生可提示PI3K/AKT信号通路的激活。PTEN和AKT是PI3K/AKT信号通路中重要的检测点。因此从以上结果可知，几-^能抑制卩^冗/^冗訂言号通路负调控蛋白PTEN的表达，上调P13K/AKT信号通路下游AKT的产生，进而促进P13K/AKT信号通路的激活，促进癌细胞的增殖，而在细胞中加入IL-1l抗体后，结合细胞中的IL-1l，减少IL-11与细胞膜表面受体的结合，使受体失活进而上调PI3K/AKT信号通路负调控蛋白PTEN的表达，抑制PI3K/AKT信号通路下游AKT的产生，从而达到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。IL-1l抗体处理组对PI3K/AKT信号通路的抑制作用强于PI3K/AKT信号通路抑制剂组，并且差异显著。
[0056]本发明在体外建立一种细胞模型，证明了IL-1l确实可以刺激肠癌细胞增殖，并且当在细胞中加入IL-1I单克隆抗体后，抗体可结合IL-1I，导致与细胞膜表面受体结合的IL-11离去，受体失活导致细胞增殖变缓，并且会引起与增殖有关的PI3K信号通路的变化，抑制信号通路，效果比信号通路抑制剂强，是天然的抗IL-1l靶点的药物。
[0057]本研究通过在体外建立的肠癌细胞模型上，用正常细胞分泌的IL-1I的量(2-101^/11^)作为癌细胞的用量，在细胞生长的时间段里，选取最有代表性的011、611、1211、2411、36h、48h作为时间点，检测IL-1I对细胞增殖的作用，这6个时间点，是绘制生长曲线的对数生长期，这个时期细胞以对数形成进行增长，在这个时间检测IL-1l不同剂量对细胞增殖的作用最科学，研究得出在IL-1l浓度为8ug/mL和10ug/mL对细胞的促增殖作用是一致的，所以选用8ug/mL的IL-1l浓度作为细胞模型的刺激用量，在测定完IL-1l浓度后，用8ug/mL作为标准，测定了 IL-1l单克隆抗体与IL-1l的结合浓度，发明得出用1ug抗体可以最大限度的结合IL-1I，因此，研究采用的IL-1I单克隆抗体的体积为1uL;用已确定的浓度(8ug/mL)的IL-1I去刺激细胞，从Oh开始到细胞衰老死亡的时间72h，做细胞的生长曲线，得出与正常细胞相比，IL-1l刺激后肠癌细胞增殖显著加快，48h是细胞生长的最高点，在本发明中得出48h正常细胞为6万个/mL,而IL-1I刺激后48h细胞为8万个/mL,显著高于正常细胞。IL-1I抗体(1uL)阻断后，IL-1l促细胞的增殖作用不显著，48h胞生长的最高点时，正常细胞为6万个/mL，IL-ll抗体阻断后为2万个/mL，差异显著，说明IL-1l抗体能降低IL-1l对肠癌细胞增殖的刺激。
[0058]IL-1l能刺激肠癌细胞增殖，必定与细胞内参与调控细胞增殖的信号通路有关，研究对重要的PI3K信号通路进行研究。近年来研究表明，P13K/Akt信号通路在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用，它可以调控肿瘤细胞的增殖与凋亡，是细胞内重要的信号通路，也是研究的重要靶点。在PI3K信号通路上有2个公认的研究靶点蛋白，PTEN、AKT，他们是国内外学者研究PI3K信号通路必需检测的靶点蛋白，他们直接反应信号通路的激活与抑制，研究通过用E-1l刺激肠癌细胞后，在0h-12h，细胞生长初期的黄金时间里，检测E-1l对细胞通路中PTEN和AKT的作用，得出IL-1l抑制PTEN的生成，促进AKT的生成，PTEN是PI3K的负调控蛋白，正常细胞在12h产生PTEN为4.35ug/mL，IL-11刺激后为3.76ug/mL，PTEN下降表明PI3K信号通路前半段激活，AKT是PI3K信号通路的下游靶点，正常细胞在12h产生AKT为3.8呢/1^，几-11刺激后为6呢/1111^1(1'的表达升高反应？131(下半段信号通路的激活，而当IL-1I抗体阻断后，PTEN的产生急剧上升，正常细胞在12h产生PTEN为4.35ug/mL，IL-1I抗体阻断组为7ug/mL; AKT的产生急剧下降，正常细胞在12h产生AKT为3.8ug/mL，IL-1I抗体阻断组为2ug/mL，表明IL-1l抗体阻断后，细胞内信号通路受到抑制。
[0059]当对信号通路的末端NF- K B进行检测时，发现NF- K B也有相应的变化。NF- K B是细胞信号由细胞膜传递到细胞核的关键靶点，是信号通路的末端，当信号通路变化时，NF-K B也会出现相应的变化，我们对细胞内信号传递最为活跃的四点时间点12h、24h、36h、48h进行检测，检测NF- K B的P65亚基(NF- K B的公认检测亚基)随时间变化的结果。用IL-1I刺激后12h时，p65亚基开始向核转位，24h p65亚基向细胞核中转移增多，48h完全转移到细胞核中，信号通路末端激活，得出IL-1l能促进细胞内PI3K信号通路的激活;IL-1l抗体阻断后NF-KB的p65亚基一直处于胞浆中，从0h-48h并未向胞核转移，说明信号通路的末端受到抑制，信号通路并未激活，得出IL-1l抗体能抑制细胞内PI3K信号通路的活化。
【主权项】
1.1卜11单克隆抗体在抑制？131(/^1^信号通路中的应用。2.根据权利要求1所述的IL-1l单克隆抗体在抑制P13K/Akt信号通路中的应用，其特征在于，所述IL-1I单克隆抗体的浓度为8ug/mL。3.根据权利要求1所述的IL-1l单克隆抗体在抑制P13K/Akt信号通路中的应用，其特征在于，所述IL-1I单克隆抗体的用量为10ug。
【专利摘要】本发明公开了一种IL-11单克隆抗体在抑制P13K/Akt信号通路中的应用，IL-11单克隆抗体的浓度为8ug/mL；IL-11单克隆抗体的用量为10ug。本发明寻找到了一种安全有效的P13K/Akt信号通路抑制剂(IL-11单克隆抗体)，该抑制剂能特异性的结合细胞分泌的IL-11，诱导PTEN的转录，上调PTEN的表达，抑制P13K/Akt信号通路下游的AKT的表达，达到抑制整条信号通路的作用。该抑制剂是天然抗体，因而减少毒副作用，安全有效。
【IPC分类】A61P35/00, A61K39/395
【公开号】CN105497893
【申请号】CN201510937827
【发明人】曹涤非, 黄国庆, 吴琼, 赵金海, 薛佳莹, 王雷, 王东凯, 孙尧, 李瑶
【申请人】黑龙江省科学院高技术研究院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月10日