T型钙离子通道抑制剂nnc55-0396在制备抗神经退行性疾病药物中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及一种T型巧离子通道抑制剂順巧5-0396(CAS: 357400-13-6)在制备抗 神经退行性疾病药物中的应用;属生物医学领域。
【背景技术】
[0002] 细胞自隧是生物体内一种用于清除功能异常的细胞器、错误折叠的蛋白质、被氧 化的脂类等有害大分子物质的重要途径。它的机制从低等生物酵母到高等的哺乳动物都高 度保守，对维持正常的生命活动至关重要。细胞自隧包括=种方式，即巨自隧 (macroautophagy)、微自隧（microautophagy)及伴侣分子介导的自隧（chaperone-mediated autophagy)。由于大自隧是自隧的主要途径，故本文所述及的自隧均仅指大自 隧。
[0003] 错误折叠的蛋白质若不能被有效清除，就会造成积聚，致使神经细胞功能丧失乃 至死亡，运是神经退行性疾病包括阿尔茨海默症(Alzheimer ' S disease ,AD)的主要原因。 阿尔茨海默症(AD)的主要特征是0-淀粉样蛋白（AP)的积聚。细胞内A如勺产生和清除对阿尔 茨海默症的发病显得十分重要。在阿尔茨海默症中，细胞自隧受到损伤，核内质溶酶体途径 出现异常。而自隧的药理学活化作用可W促进AP的清除，进而减轻AD症状，因此研究调控自 隧对阿尔茨海默症的早期干预有重要意义巧Ij知学等，2012)。
[0004] 化合物順C55-0396 (CAS: 357400-13-6)是药物Mibef radi 1的衍生物，是一种高选 择性的T型巧离子通道抑制剂，广泛应用于肿瘤、糖尿病等研究，也有研究发现其与胚胎神 经发育相关。但是順巧5-0396对于诱导细胞自隧，用于制备抗神经退行性疾病药物方面的 研究，经权威机构检索查新，目前国内外尚未见报道。鉴于此，研究化合物WC55-0396对诱 导细胞自隧、改善认知功能障碍，制备抗神经退行性疾病药物中的应用具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种T型巧离子通道抑制剂 NNC55-0396(CAS :357400-13-6)在制备抗神经退行性疾病药物中的应用。
[0006] 本发明所述T型巧离子通道抑制剂NNC55-0396在制备抗神经退行性疾病药物中的 应用。
[0007] 其中：所述T型巧离子通道抑制剂WC55-0396的化学结构如通式（I)所示，其化学 命名为：（ls，2s)-2-(2-(N-[3-(2-lH-苯并咪挫基）丙基]-N-甲胺基）乙基)-6-氣-1，2,3,4-四氨-1-异丙基-2-糞酪-环丙基甲酸醋;所述神经退化性疾病优选是阿尔兹海默病。
[0009] 本发明运用野生型神经胶质细胞U87MG细胞及LC3被绿色巧光蛋白（GFP)转染的神 经胶质细胞U87MG细胞(简称LC3-GFP-U87细胞），对T型巧离子通道抑制剂NNC55-0396进行 了在影响细胞自隧及其关联的认知功能障碍等疾病方面的研究，证实:所述T型巧离子通道 抑制剂WC55-0396在增强细胞自隧来改善认知功能障碍中具有明显作用，并确定所述T型 巧离子通道抑制剂NNC55-0396能有效诱导引发细胞自隧的浓度为如M。
[0010] 为了更好的理解本发明的实质及本发明所述化合物的作用，下面结合NNC55-0396 的药理实验及结果，来进一步阐述其在增强细胞自隧中的作用。
[0011] 神经胶质瘤细胞的制备：W常规方法培养野生型神经胶质细胞U87MG细胞及LC3被 绿色巧光蛋白（GFP)转染的神经胶质细胞U87MG细胞(简称LC3-GFP-U87细胞），收集生长状 态良好的且处于对数期的细胞，备用。
[0012] 采用细胞生物学和分子生物学方法进行如下实验，W观察NNC55-0396对LC3-GFP-U87细胞和野生型神经胶质细胞U87MG自隧的影响。
[0013] 1.绿色巧光蛋白-自隧过程特征蛋白GFP-LC3方法检测细胞生长情况，W判断 NNC55-0396对细胞自隧的影响
[0014] 将处于对数生长期的LC3-GFP-U87细胞接种于96孔板中，经扣M的順巧5-0396作用 24小时后，用巧光倒置显微镜观察LC3蛋白的变化，结果发现实验组较对照组出现大量巧光 斑点，说明细胞产生自隧小体，LC3聚集在自隧小体内，形成巧光斑点，证明了自隧的发生 (见图1)。
[0015] 2.蛋白质印迹法(Western Blot)分析S种浓度分别为1咖，5础和IOiiM的順C55-0396作用于U87MG细胞24小时(雷帕霉素作为阳性对照)后的蛋白表达量
[0016] 根据蛋白水平的表达量变化，发现扣M和IOiiM两种浓度剂量的順巧5-0396显著上 调了LC3 n的表达量，证实了自隧的发生，并确定NNC55-0396能有效诱导引发细胞自隧的浓 度为如M(见图2)。
[0017] 上述实验数据W平均值±标准误差表示，经t检验，P<0.05,表示有明显性差异。
[0018] 通过上述经统计学处理的实验数据及其结果，可W得到W下结论：
[0019]本发明所述的化合物順C55-0396能显著诱导引发细胞自隧，实验结果证实T型巧 离子通道抑制剂NNC55-0396有望在制备抗神经退化性疾病药物中具有应用，为新型抗神经 变性病药物开发提供基础。预示NNC55-0396有望成为选择性诱导细胞自隧W及有效治疗阿 尔兹海默病的有潜力药物，具有广阔的科研和临床开发前景。
【附图说明】
[0020] 图1: 5測的NNC55-0396溶液处理LC3-GFP-U87细胞24小时诱导细胞发生自隧照片。
[0021] 其中:A图为溶剂处理的对照组，B图为如M的NNC55-0396溶液处理的实验组。
[0022] 图2:1測，5測和101^]\1的順〔55-0396分别处理1]87]\16细胞24小时，检测显示化合物浓 度为如M和IOiiM时，细胞中LC3 n的表达上调，细胞发生自隧。
【具体实施方式】
[0023] 本发明所述化合物順C55-0396购于Sigma Al化icheU87MG细胞和LC3-GFP-U87细 胞购自中科院上海生化与细胞所细胞库。
[0024] 实施例1
[0025] 自隧小体的定量实验
[0026] 将自隧报告细胞LC3-GFP-U87细胞消化计数后，取ImL密度为50，000个/mL的LC3-GFP-U87细胞悬液接种至直径Icm玻底共聚焦培养皿中（玻片直0.2(3111)，在37°0含5%0)2的 条件下培养24小时后，加入ImL浓度为扣M的順巧5-0396溶液在37°C含5 % C〇2的条件下继续 培养。处理24小时后，弃培养液，加入2%多聚甲醒对细胞进行固定。然后使用巧光倒置显微 镜，W488nm激发，535nm发射通道，最佳信号模式对细胞进行巧光观察并拍照。
[0027] 对随机视野中细胞中的明亮点状巧光（自隧小体)进行计数，W单个细胞中的平均 点状巧光数将NNC55-0396诱发自隧的能力进行量化。每个样本进行3次生物学重复。
[0028] 结果:经順巧5-0396作用24小时后，用巧光倒置显微镜观察LC3蛋白的变化，发现 实验组较对照组的细胞出现大量巧光斑点（见图1 )，说明细胞产生自隧小体，LC3聚集在自 隧小体内，形成巧光斑点，证明了自隧的发生。
[0029] 实施例2
[0030] 免疫印迹实验
[0031] 将3mL密度为1 X lOVmL的U87MG细胞接种至直径60mm的细胞培养皿中。在37°C含 5%C02的条件下培养24h后，将此细胞分别与浓度分别为化M，5iiM和IOiiM的順C55-0396、雷 帕霉素（阳性对照）、DMS0，在37°C含5%C〇2的条件下作用2地。
[0032] 将皿内培养液弃去，用4°C预冷好的PBS洗涂S遍。将PBS弃净后把皿置于冰上，加 入4mL PBS。用细胞刮刀轻轻刮取细胞并收集至15mL离屯、管中，离屯、管插入冰中。随后在4°C 下W1 SOOrpm低速离屯、收集细胞并丢弃上清液，再加入4°C预冷的PBS缓冲溶液，满旋将细胞 分散，再次离屯、。重复上述步骤一次。向得到的细胞团中加入10化L裂解液（ImL Ripa+1化L protein inhibitor cocktail+化L 0.3%PMSF)，于冰上裂解细胞20分钟，期间不时轻弹离 屯、管，使细胞得到充分的裂解。随后将细胞裂解产物移入1.5mL离屯、管，于4°C下，13000rpm 高速离屯、10分钟，收集上清即细胞蛋白裂解液。应用BCA蛋白浓度测定法对细胞裂解液中的 蛋白浓度进行定量。配置等体积的含20yg总蛋白的上样溶液，加入上样缓冲液于沸水中煮5 分钟后准备上样。
[0033] 将上述配置好的样品加入到SDS-PAGE的相应上样孔道中，在60V的电压下电泳约 30分钟至样品进入分离胶换120V继续电泳约90分钟。取出凝胶于电转缓冲液中平衡20分钟 后，于90V下电转约60分钟至胶上蛋白转印到PVDF膜上。在水平摇床上用含5%脱脂奶粉的 TBST溶液封闭此膜小时后，加入按1:1000的比例用含5%脱脂奶粉的TBST溶液稀释的LC3蛋 白一抗(CST )，于4°C解育过夜。随后在摇床上用TBST洗膜S次，每次5分钟。加入一定体积的 用5%脱脂奶粉的TBST溶液按1:5000稀释的二抗（Santa化UZ)，室溫解育1小时后，用TBST 溶液洗3次，每次5分钟。W化学发光ECL法检测膜上的条带，于暗盒中曝光经显影、定影得到 最终记录有蛋白条带的胶片。
[0034] 结果见图2。根据蛋白水平的表达量变化，发现浓度为IiiM，扣M和IOiiM的顺巧5- 0396作用于U87MG细胞24小时(雷帕霉素作为阳性对照）后，其中浓度为扣M和IOiiM的化合物 NNC55-0396均显著上调了LC3E的表达量，证实了自隧的发生，并确定NNC55-0396能有效诱 导引发细胞自隧的浓度为如M。
【主权项】
1. T型钙离子通道抑制剂NNC55-0396在制备抗神经退行性疾病药物中的应用，其中所 述NNC55-0396的化学命名为：（18,28)-2-(2-0-[3-(2-1!1-苯并咪唑基)丙基]4-甲胺基） 乙基)-6_氟-1，2，3，4-四氢-1-异丙基-2-萘酚-环丙基甲酸酯。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述神经退化性疾病是阿尔兹海默病。3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述T型钙离子通道抑制剂NNC55-0396能 有效诱导引发细胞自噬的浓度为5μΜ。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述细胞是神经胶质细胞U87MG细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种T型钙离子通道抑制剂NNC55-0396在制备抗神经退行性疾病药物中的应用。实验证实：所述化合物NNC55-0396在增强细胞自噬来改善认知功能障碍中具有明显作用，并确定NNC55-0396能有效诱导引发细胞自噬的浓度为5μM。预示该化合物有望成为选择性诱导细胞自噬以及有效治疗阿尔兹海默病的有潜力药物，本发明的应用也为研究调控自噬对神经退行性疾病的早期干预提供了理论基础。
【IPC分类】A61P25/28, A61K31/4184
【公开号】CN105534977
【申请号】CN201610024789
【发明人】闫兵, 陈茜, 穆岩, 张秋, 翟淑梅, 江翠娟
【申请人】山东大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月14日