一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法及应用和该构建方法的筛选方法

一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法及应用和该构建方法的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法，步骤如下：⑴利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量；⑵确定最佳的给药培养方式；⑶确定最佳的给药物质、给药剂量；⑷确定黄嘌呤的最佳给药时间；⑸对该构建方法所获得的高尿酸秀丽隐杆线虫模型进行系列实验评价，获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。本方法利用与人类基因具有高保守性，且尿酸代谢途径与人类很相似的模式生物—秀丽隐杆线虫建立了高尿酸血症动物模型，该模型具有典型的病理表征、稳定、可靠，且各项数量指标具有统计学意义，为痛风及高尿酸症的大规模、高通量药物筛选提供了有力的工具。
【专利说明】
一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法及应用和该构建方 法的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明属于人类慢性疾病动物模型技术领域，涉及一种人类慢性疾病动物模型的 建立方法，尤其是一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法及应用和该构建方法的筛选方 法。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的改善和饮食结构的改变，近年来，高尿酸血症的发病率在世 界范围内都有显著上升趋势。高尿酸血症自身不仅给人类的健康带来很大的威胁，还会产 生各种并发症，如心脑血管疾病和动脉粥样硬化等。因此加强对高尿酸血症的防控及相关 药物的研发已成为一项紧迫任务。但现有高尿酸血症动物模型的不足已成为高尿酸血症病 理研究和新药研发的主要障碍。因此，建立科学、合理、相似性高、重复性好、可靠性强和可 控易行的高尿酸血症动物模型具有重要的现实意义。
[0003] 建立高尿酸血症动物模型，是筛选安全、高效的降尿酸药物的前提和基础。目前， 已经建立的高尿酸血症模型的动物主要有小鼠、大鼠、鸡、鹌鹑等。大鼠、小鼠一方面是实验 室的常用动物，操作、饲养都较为方便，与人类种属差异小。但另一方面，小鼠、大鼠的尿酸 的代谢途径与人类大为不同，存在尿酸酶，而人类没有，使得造模有一定的不确定性而受到 限制。鸡和鹌鹑，尿酸合成和代谢与人类极为相似，体内无尿酸酶，不能将尿酸氧化，但与人 类不同属，且普通实验室饲养也不方便。
[0004] 另外，在建立高尿酸血症模型时，不同的给药方式也会产生很大的影响。目前建立 模型的给药方式上主要有五种:饲喂、灌胃、腹腔注射、皮下注射及基因敲除。禽类以饲喂给 药，大鼠及小鼠前四种方式均可造模，基因敲除研究仅限于小鼠。不同的给药方式各有优缺 点:饲喂动物进食量的不均会使体内血尿酸水平不稳定，但持续时间较长;灌胃可以避免血 尿酸水平不稳定;注射给药操作简便，但是高尿酸状态维持时间短，不宜做发病机制的研 究;几种方式联合给药往往效果较好，构造的高尿酸血症模型具有持续性、稳定性等特点； 基因敲除建立的模型小鼠存活时间短、造价高。
[0005] 理想的高尿酸模型应具备：（1)尿酸代谢与人类一致，无尿酸酶；（2)血尿酸升高较 快，造模稳定；（3)高尿酸状态可以维持足够的时间；（4)对其它器官如肾脏无损伤。综合来 看，目如尚无一种尚效、稳定、可靠的尚尿酸血症动物t旲型。
[0006] 秀丽隐杆线虫的成虫虽然只有1-1.5mm，但却具有表皮系统、咽食系统、神经系统、 排便系统、免疫调节系统和生殖系统等完整的结构。秀丽隐杆线虫的神经元细胞虽然简单， 但其功能与其它动物一样，有各种神经递质，调控秀丽隐杆线虫对不适宜温度、机械刺激等 不良环境的适应。此外，秀丽隐杆线虫共有19717个基因，6条染色体，其中包括5对常染色体 和1对性染色体。基因中内含子较少，基因组小，只有97Mb，是基因最小的多细胞真核生物。 秀丽隐杆线虫基因与人类基因具有高保守性，使得秀丽隐杆线虫成为研究人类疾病的理想 模型。
[0007] 目前，秀丽隐杆线虫已经广泛用于致病病原菌模型、检测毒性及疾病模型方面研 究。研究表明，目前的秀丽隐杆线虫模拟人类疾病模型主要分为四类，代谢综合征疾病的秀 丽隐杆线虫模型、抑郁秀丽隐杆线虫模型及神经系统疾病模型和肌肉萎缩模型。
[0008] 秀丽隐杆线虫体内的尿酸代谢途径(如图1)与人类的尿酸代谢途径虽然略有不同 (如图2)，但基本相似。秀丽隐杆线虫也是先从小分子物质合成核苷酸的碱基，然后再进行 核苷酸的循环，与人类不同的是鸟嘌呤不能直接代谢为黄嘌呤，腺嘌呤不能直接代谢为次 黄嘌呤进而转化为黄嘌呤，所以秀丽隐杆线虫体内尿酸的前体物质只有次黄嘌呤和黄嘌 呤，而人体内尿酸的前体物质有四种，分别为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤。但秀丽隐 杆线虫和人类都没有尿酸酶，嘌呤代谢的最终产物都是以尿酸的形式排出体外，这为利用 秀丽隐杆线虫建立与人类尿酸代谢途径相类似的高尿酸动物模型提供了可能。
[0009]通过检索，尚未见有利用秀丽隐杆线虫建立高尿酸血症模型的相关报道。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型 的构建方法及应用和该构建方法的筛选方法，该构建方法利用经典模式生物-秀丽隐杆线 虫，且该方法获得的模型具有典型的病理表征、稳定、可靠、科学、合理、相似性高、重复性 好、可靠性强和可控易行等优势，且各项数量指标具有统计学意义，不仅为痛风及高尿酸症 的大规模、高通量药物筛选提供了有力的工具。
[0011] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
[0012] -种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法，步骤如下：
[0013] 利用秀丽隐杆线虫，采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25-0.45mg/mL、液体给药， 20-25Γ条件下培养18-32h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模 型。
[0014] 而且，步骤如下：
[0015] 利用秀丽隐杆线虫，采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25mg/mL、液体给药，20°C条 件下培养18h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0016] 如上所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法在降尿酸药物筛选中的应用。
[0017 ]如上所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法所构建的秀丽隐杆线虫高尿酸 模型在降尿酸药物筛选中的应用。
[0018] 如上所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，步骤如下：
[0019] ⑴利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量；
[0020] ⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养，通 过比较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响，确定最佳的给药培养方式；
[0021] ⑶对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌 呤和腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间，以秀丽隐杆线虫为单位，测定秀丽隐 杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳的给药物质、给药剂量；
[0022] 所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.6511^/1^;所述不同的作用时间为 0,6，10，18,24,32,48h;
[0023] ⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下，测定最佳给药物质在不同 给药时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定 最佳给药物质的最佳给药时间；
[0024] 所述不同给药时间为0，18，24，32，48h;
[0025] (5)确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法，对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽 隐杆线虫模型进行系列实验评价，所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评 价、秀丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活 性评价，确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的 损伤性，确定最佳条件，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。 [0026] 而且，步骤如下：
[0027]⑴利用高效液相色谱法测定400-1000条秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量；
[0028]⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养，通 过比较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响，确定最佳的给药培养方式，为 液体给药；
[0029]⑶对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌 呤和腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间，以400-1000条秀丽隐杆线虫为单位， 测定秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳的给药物质、给药剂量，为黄嘌呤终浓度 0.25mg/mL；
[0030] 所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.6511^/1^;所述不同的作用时间为 0,6，10，18,24,32,48h;
[0031] ⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下，测定黄嘌呤在不同给药时 间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定黄嘌呤 的最佳给药时间，为18h;
[0032] 所述不同给药时间为0，18,24,32,48h;
[0033] (5)确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法，对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽 隐杆线虫模型进行系列实验评价，所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评 价、秀丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活 性评价，确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的 损伤性，确定最佳条件，即采用前体物质黄嘌呤、终浓度为〇. 25-0.45mg/mL、液体给药、20-25°C、18-32h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0034]而且，所述步骤⑴中秀丽隐杆线虫测定前经乙腈除蛋白处理，且乙腈的加入量为： 500条秀丽隐杆线虫加入乙腈5. OmL;
[0035] 或者，所述高效液相色谱法测定尿酸含量的条件如下：
[0036] 色谱柱：Intertsil 0DS-SP色谱柱，5μηι，4· 6mmX 250mm;
[0037] 流动相：10mmol/L的乙酸铵；
[0038] 检测器:紫外检测器；
[0039] 柱温：25°C;
[0040] 流速：lmL/min;
[0041 ]进样量：30yL;
[0042] 标准曲线绘制：
[0043] 准确称取4.Omg尿酸标准品，用质量百分数为25%的氨水超声溶解定容至10mL，得 到浓度为400yg/mL的尿酸标准母液，配制成浓度为0，12.5，30，60，90，120，150yg/mL的尿酸 标准溶液，过膜备用;准确进样30yL，根据峰面积与标准溶液进样浓度成正比的对应关系绘 制尿酸标准曲线，求得回归方程、相关系数及其线性范围。
[0044] 而且，所述步骤⑵中固体给药的培养具体如下：
[0045]秀丽隐杆线虫所用标准培养基为NGM培养基，其配制比例及程序为3g NaCl、17g琼 月旨、2.5g蛋白胨、1L双蒸水，高压蒸汽灭菌后，在无菌条件下加入lmL胆固醇的浓度为5mg/mL 的胆固醇无水乙醇溶液、1 m L浓度为1 m ο 1 / L且经高压蒸汽灭菌的M g S 0 4溶液、1 m L浓度为 lmol/L且经高压蒸汽灭菌的CaCl2溶液和25mL的lmol/L、经高压蒸汽灭菌、pH=6.0的磷酸 钾缓冲液，充分混均，倒入直径为9cm的培养皿，冷却待用；
[0046]其中，所述胆固醇无水乙醇溶液的制备过程为:胆固醇使用无水乙醇进行溶解且 经0.45μπι滤膜过滤除菌；
[0047] 线虫同期化，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500-2000r/min离心2-5min收集幼 虫，转到涂有大肠杆菌0P50的NGM培养基平板上，将平板置于20 °C培养箱中继续培养，培养 至32h后待用；
[0048] 不同浓度0，0 · 05，0 · 15，0 · 25，0 · 35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤、 培养基准备完毕后，吸取5mL药品，至一已灭菌的50mL离心管中，再倾倒NGM培养基至体积 22.5mL，再倒入平板，待其凝固后进行下一步实验;每个药品的每个浓度三个平行，此过程 需快速，以免培养基凝固；空白平板加入5mL M9缓冲液；
[0049] 平板中培养基凝固后，选择无气泡、表面光滑的平板，用移液枪吸取100yL大肠杆 菌0P50于培养基上，并涂抹均匀，涂抹时菌液距离皿壁20mm，晾干待用；
[0050] 将已经培养32h后的线虫用M9缓冲液冲洗2-3次后，定容，然后用移液枪吸取0.2-2mL滴加在涂有0P50的NGM平板中央，将平板用封口膜密封，再用保鲜膜包裹好后放入20°C 培养箱中培养24h;
[0051] 收集线虫，用M9缓冲液反复清洗2-3次，保证所有线虫全部收集，定容至lmL，放入 冰箱中或进行液相前处理；
[0052]或者，所述步骤⑵中液体给药的培养具体如下：
[0053]同期化后，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500-2000r/min离心2-5min收集幼虫， 转到涂有大肠杆菌0P50的NGM平板上，将平板置于20 °C培养箱中继续培养，培养32h;
[0054]将配制好的SM液体培养液，在无菌条件下分装入6孔培养板中，每孔3.6mL，再加入 配制好的不同浓度〇，〇. 05，0.15，0.25，0.35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤， 每孔1.2mL，每个药品每个浓度三个平行；
[0055]通过显微镜观察，选择长势相同的平板用M9缓冲液冲洗干净，转至15mL离心管中， 1500-2000r/min离心2-5min，吸取上清，并定容后摇匀分装入6孔培养板，使每孔含有虫体 500 ± 5条，用封口膜封好之后放于20 °C培养箱分别培养至0，6，10，18，24，32h，然后用移液 枪吸入15mL离心管中，1500-2000r/min离心，然后定容至lmL，放入冰箱进行保存或进行液 相前处理。
[0056]而且，所述步骤⑷的具体步骤如下：
[0057]取同期化秀丽隐杆线虫，固体培养32h，用M9冲下、清洗，收集线虫；
[0058]取六孔板，液体培养秀丽隐杆线虫，再用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h、24h、 32h，对照组为M9溶液;对照组和每个实验组的秀丽线虫数均为500 ± 5条；
[0059]对照组和每个实验组的秀丽线虫全部分别转移至涂有0P50的含有5-氟尿嘧啶的 NGM培养基上，每天准确记录秀丽线虫的死亡数目和丢失数目，直至所有受试的秀丽隐杆线 虫全部死亡，判断线虫死亡的标准是对外部刺激没有应答，如有爬到壁上死亡的，不算在其 内；
[0060] 平行试验重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0061] 而且，所述步骤(5)中秀丽隐杆线虫运动能力变化评价的具体步骤如下：
[0062] ①取同期化秀丽隐杆线虫；
[0063] ②线虫固体培养32h，用M9冲下、清洗，收集线虫；
[0064]③取六孔板，液体培养线虫，用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h，对照组为M9溶 液;对照组和每个实验组的秀丽隐杆线虫数均为500 ± 5条；
[0065]④挑取秀丽隐杆线虫于无0P50的NGM培养基上，2min后，在显微镜下观察，以线虫 头部摆过去再摆回来为一次，记录在lmin内秀丽隐杆线虫的头部摆动次数，总共挑取10条 来观察；以线虫一个波长的正弦曲线运动为一次，记录在20s内秀丽隐杆线虫的身体弯曲次 数，共挑取10条来观察；
[0066]⑤平行试验重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理；
[0067] 或者，所述步骤(5)中秀丽隐杆线虫产卵量变化评价的具体步骤如下：
[0068] ①取同期化秀丽隐杆线虫；
[0069] ②线虫固体培养32h，用M9冲下、清洗，收集线虫；
[0070]③取六孔板，液体培养线虫，用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h，对照组为M9溶 液;对照组和每个实验组的秀丽线虫数均为500 ± 5条；
[0071]④分别各挑取15条秀丽隐杆线虫于15个无0P50的NGM培养基上，每天把秀丽隐杆 线虫转移到新的无0P50的NGM培养基上，在显微镜下数虫卵数，直到产卵结束为止；
[0072]⑤平行试验重复两次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0073]而且，所述步骤(5)中模型稳定性评价的具体步骤如下：
[0074]将空白组和实验组的秀丽隐杆线虫在20°C下进行固体培养，并保证充足的食物， 分别培养6、12、18、24、301!后，用19冲洗秀丽线虫，收集，进行液相前处理，分别测定秀丽隐 杆线虫体内尿酸的含量；
[0075]其中，空白组为未建模前的秀丽线虫，实验组为建模后培养不同时间的秀丽隐杆 线虫；
[0076]平行试验至少重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理；
[0077]或者，所述步骤(5)中别嘌呤醇评价的具体步骤如下：
[0078]将建立模型前后的秀丽隐杆线虫分别给予别嘌呤醇终浓度0.05、0.15、0.5mg/mL， 在NGM培养基上培养12h后，收集秀丽隐杆线虫，高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的 尿酸含量;其中，空白组为未建模前的秀丽隐杆线虫，模型组为建模后的秀丽隐杆线虫，平 行试验至少重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0079] 而且，所述步骤(5)中黄嘌呤氧化酶活性评价的具体步骤如下：
[0080] ①取同期化秀丽隐杆线虫；
[0081]②将L1期幼虫等量转入固体培养基中培养32h后，使每个平板上的线虫数量相等， 且数量为500 ±5条；
[0082]③取六孔板，每孔加入1.2mL，0.25mg/mL的黄嘌呤，进行液体培养，将配制好的SM 液体培养液，在无菌条件下分装入6孔培养板中，每孔3.6mL，三个平行；
[0083]通过显微镜观察，选择长势相同的平板用M9缓冲液冲洗干净，转至15mL离心管中， 1500-2000r/min离心2-5min，吸取上清，并定容后摇匀分装入6孔培养板，使每孔含有虫体 500 ± 5条，用封口膜封好之后放于20°C培养箱培养18h建模，得建模后线虫；
[0084] ④将建模后线虫从孔板中吸出，M9清洗三次，冰浴条件下，充分匀浆，制成匀浆液， 冷冻离心机3000-5000r/min，离心5-15min，取上清液进行测定；
[0085] ⑤按照南京建成生物工程研究所的黄嘌呤氧化酶试剂盒说明书上的操作规程操 作。
[0086] 本发明取得的优点和积极效果是：
[0087] 1.本发明方法利用与人类基因具有高保守性，且尿酸代谢途径与人类很相似的模 式生物一秀丽隐杆线虫建立了高尿酸血症动物模型，该模型具有典型的病理表征、稳定、可 靠、科学、合理、相似性高、重复性好、可靠性强和可控易行等优势，且各项数量指标具有统 计学意义，不仅为痛风及高尿酸症的大规模、高通量药物筛选提供了有力的工具，而且也为 高尿酸血症及通风的病理机制研究提供了良药的实验模型，还为其他代谢性疾病动物模型 的建立提供了有益参考，建立的高尿酸血症动物模型具有重要的现实意义。
[0088] 2.本方法利用与人类尿酸代谢相似的秀丽隐杆线虫作为模式生物，不仅提高了秀 丽隐杆线虫在医药领域的价值，而且造模无差异性，建立的高尿酸症模型为高尿酸症的大 规模、高通量药物筛选提供准确的工具，以发现更多的安全、高效的治疗药物，可为人类的 健康带来福音。
[0089] 3 .本方法最终确定采用前体物质黄噪呤可建立低损伤性、高效、稳定、可靠实用 的，并能够反应人类高尿酸本质的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0090] 4.本发明秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法可以应用在降尿酸药物筛选中，同 时，本发明秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法所构建的秀丽隐杆线虫高尿酸模型也可以 应用在降尿酸药物筛选中。
【附图说明】
[0091] 图1为本发明中秀丽隐杆线虫的尿酸代谢图；
[0092] 图2为人体的尿酸代谢图；
[0093] 图3为本发明中高效液相色谱法检测尿酸标品的液相色谱图；
[0094]图4为本发明中尿酸标准曲线；
[0095]图5为本发明中尿酸样品的HPLC色谱图；
[0096] 图6为本发明中不同给药方式的比较图；
[0097] 图7为本发明中不同浓度的次黄嘌呤、尿酸、腺嘌呤、黄嘌呤四种造模剂对秀丽隐 杆线虫体内尿酸含量的影响图；
[0098] (土SD) (*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，***p〈0 · 001 vs ·空白组）；
[0099] (土SD)(*p〈0.05，**p〈0.01，***p〈0.001vs.0group);
[0100] 图8为本发明中次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤、腺嘌呤四种造模剂不同造模时间对秀丽 隐杆线虫体内尿酸含量的影响图；
[0101] (土SD) (*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，***p〈0 · OOlvs ·空白组）；
[0102] (土SD)(*p〈0.05，**p〈0.01，***p〈0.001vs.0group);
[0103] 图9为本发明中黄嘌呤的给药时间对秀丽隐杆线虫的存活率的影响图；
[0104] (土SD) (*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，***p〈0 · OOlvs ·空白组）；
[0105] (土SD)(*p〈0.05，**p〈0.01，***p〈0.001vs.0group);
[0106] 图10为本发明中黄嘌呤不同的给药时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响图；
[0107] (土SD) (*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，***p〈0 · OOlvs ·空白组）；
[0108] (土SD)(*p〈0.05，**p〈0.01，***p〈0.001vs.0group);
[0109] 图11为本发明中造模前后秀丽隐杆线虫体内尿酸含量随时间的变化图；
[0110] (土SD) (*p〈0 · 05vs · 0组，***p〈0 · OOlvs · -18h组）；
[0111] (土SD) (*p〈0 · 05vs · Ogroup，***p〈0 · OOlvs · _18group);
[0112] 图12为本发明中不同浓度的别嘌呤醇对模型秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响 图；
[0113] (土SD) (**p〈0 ·Olvs ·模型组，***p〈0 ·OOlvs ·空白组）；（土SD) (**p〈0 ·Olvs .model group,***p<0.OOlvs.normal control group)；
[0114] 图13为本发明中造模前后秀丽隐杆线虫存活率的变化图；
[0115]图14为本发明中造模前后对秀丽隐杆线虫头部摆动的影响图（土SD);
[0116]图15为本发明中造模前后对秀丽隐杆线虫身体弯曲的影响图（±SD);
[0117]图16为本发明中造模前后秀丽隐杆线虫产卵量的变化图（土S.D)。
【具体实施方式】
[0118]下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0119] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的 方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0120] 本发明中所述的秀丽隐杆线虫的培养物为尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(0P50)。
[0121 ]本发明中秀丽隐杆线虫所用培养基为标准NGM培养基。
[0122] 1本发明中所使用的相关材料可以如下：
[0123] 1.1材料:秀丽隐杆线虫。
[0124] 1.2溶液配制
[0125] 尿酸：准确称取15 · Omg尿酸，加入微量（50-300yL)的DMS0促溶，取15mL蒸馏水，超 声水浴溶解，再分别稀释至所需浓度。
[0?26] 次黄噪呤:准确称取次黄噪呤15. Omg，加入10mL蒸馏水，超声30min，再分别稀释至 所需浓度。
[0127] 黄嘌呤:准确称取15. Omg黄嘌呤，加入微量(50-300yL)的氨水促溶，然后取15mL蒸 馏水超声水浴溶解，再分别稀释至所需浓度，调pH至7.5左右。
[0128] 腺嘌呤:准确称取腺嘌呤15.Omg，取15mL蒸馏水超声溶解，再分别稀释至所需浓 度。
[0129]尿酸标准储备液:准确称取尿酸标品4. Omg，取10mL质量百分数为25%的氨水，溶 解。
[0130]别嘌呤醇:取20.0 mg别嘌呤醇，加水热水浴(37-60 °C)溶解，定容至10mL，稀释至所 需浓度。
[0131] 1.3试剂盒
[0132] 黄嘌呤氧化酶试剂盒:南京建成生物工程研究所。
[0133] 总超氧化物歧化酶试剂盒:南京建成生物工程研究所。
[0134] 1.4仪器设备
[0135] 美国高速冷冻离心机CR3i，Thermo公司；美国超低温冰箱Forma-700，Themo;美国 高效液相色谱仪Agilent 1200,安捷伦科技有限公司；日本生物显微镜CX41，0LYMPUS公司； 日本荧光倒置显微镜，尼康。
[0136] -种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法，步骤如下：
[0137] 利用秀丽隐杆线虫，采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25-0.45mg/mL、液体给药， 20-25Γ条件下培养18-32h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模 型。
[0138] 较优地，步骤如下：
[0139] 利用秀丽隐杆线虫，采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25mg/mL、液体给药，20°C条 件下培养18h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0140] 上述秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，步骤如下：
[0141]⑴利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量；
[0142] ⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养，通 过比较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响，确定最佳的给药培养方式；
[0143] ⑶对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌 呤和腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间，以秀丽隐杆线虫为单位，测定秀丽隐 杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳的给药物质、给药剂量；
[0144] 所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.6511^/1^;所述不同的作用时间为 0,6，10，18,24,32,48h;
[0145] ⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下，测定最佳给药物质在不同 给药时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定 最佳给药物质的最佳给药时间；
[0146] 所述不同给药时间为0，18，24，32，48h;
[0147] (5)确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法，对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽 隐杆线虫模型进行系列实验评价，所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评 价、秀丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活 性评价，确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的 损伤性，确定最佳条件，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0148] 具体地，上述秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，步骤如下：
[0149] ⑴利用高效液相色谱法测定400-1000条秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量；
[0150] ⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养，通 过比较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响，确定最佳的给药培养方式，为 液体给药；
[0151] ⑶对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌 呤和腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间，以400-1000条秀丽隐杆线虫为单位， 测定秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳的给药物质、给药剂量，为黄嘌呤终浓度 0.25mg/mL；
[0152] 所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.6511^/1^;所述不同的作用时间为 0,6，10，18,24,32,48h;
[0153] ⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下，测定黄嘌呤在不同给药时 间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定黄嘌呤 的最佳给药时间，为18h;
[0154] 所述不同给药时间为0，18，24，32，48h;
[0155] (5)确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法，对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽 隐杆线虫模型进行系列实验评价，所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评 价、秀丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活 性评价，确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的 损伤性，确定最佳条件，即采用前体物质黄嘌呤、终浓度为〇. 25-0.45mg/mL、液体给药、20-25°C、18-32h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0156] 具体地，上述秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，步骤如下：
[0157] 1.高效液相色谱法测定尿酸含量
[0158] 高效液相色谱法条件
[0159] 色谱柱：Intertsil 0DS-SP色谱柱（5μηι，4· 6mmX 250mm);
[0160] 流动相：10mmol/L的乙酸铵
[0161] 检测器:紫外检测器 [0162]柱温：25°C;
[0163] 流速：lmL/min;
[0164] 进样量：30yL。
[0165] 标准曲线绘制
[0166] 准确称取4. Omg尿酸标准品，用质量百分数为25 %的氨水超声溶解定容至10mL，得 到浓度为400yg/mL的尿酸标准母液，配制成浓度为0，12.5，30，60，90，120，150yg/mL的尿酸 标准溶液，过膜备用。准确进样30yL，根据峰面积与标准溶液进样浓度成正比的对应关系绘 制尿酸标准曲线，求得回归方程、相关系数及其线性范围。
[0167] 样品处理
[0168] 移液枪吸取M9溶液，将预处理平板上的线虫全部冲下，1500-2000r/min离心2-5min，弃去上清液。
[0169] 如上述反复清洗3次，保留底部沉淀线虫。
[0170] 将线虫经过研磨器研磨破碎，将研浆液控制在3-4mL，于15mL离心管中。
[0171]向研浆液中加入6mL氨水进行超声波处理30min以上，加入4mL乙腈，涡旋振荡 8min，静置 20min，3000-5000r/min 离心 5-lOmin。
[0172] 弃掉沉淀，取上清液进行旋转蒸发，旋转蒸发后用氨水复溶，并超声促进尿酸溶 解，最后定容至2mL，_20°C保存或直接进样测定。
[0173] 2.秀丽隐杆线虫的固体培养
[0174] 实验室一般用固体培养秀丽隐杆线虫，挑取生长状况良好的几条线虫放入涂有大 肠杆菌0P50的NGM培养基上，20°C培养。选择培养基平板时，要选择无气泡、表面光滑的平 板，如果有缝隙，线虫就会爬进培养基，影响实验的准确性。
[0175] 本发明对一般的固体培养方式进行了改进，培养和给药同时进行，具体步骤如下：
[0176] 线虫同期化，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500r/min离心2min收集幼虫，转到涂 有大肠杆菌0P50的NGM平板上，将平板置于20°C培养箱中继续培养，培养至32h后待用。
[0177] 在无菌条件下，将灭菌好的NGM培养基(本发明中秀丽隐杆线虫所用标准培养基为 NGM培养基，其配制比例及程序为3g NaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨、1L双蒸水，高压蒸汽灭菌 后)在无菌条件下加入lmL胆固醇的浓度为5mg/mL的胆固醇无水乙醇溶液、lmL浓度为lmol/ L且经高压蒸汽灭菌的MgS〇4溶液、lmL浓度为lmol/L且经高压蒸汽灭菌的CaCl2溶液和25mL 的lmol/L、经高压蒸汽灭菌、pH=6.0的磷酸钾缓冲液，充分混均，倒入直径为9cm的培养皿， 冷却待用；
[0178]其中，所述胆固醇无水乙醇溶液的制备过程为:胆固醇使用无水乙醇进行溶解且 经0.45μπι滤膜过滤除菌。
[0179] 不同浓度0，0.05，0.15，0.25，0.35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤、 培养基准备完毕后，吸取5mL药品溶液，至一已灭菌的50mL离心管中，再倾倒NGM培养基至体 积22.5mL左右，再倒入平板，待其凝固后进行下一步实验。每个药品的每个浓度三个平行， 此过程需快速，以免培养基凝固。空白平板加入5mL M9缓冲液。
[0180]平板中培养基凝固后，用移液枪吸取100此大肠杆菌0P50于培养基上，并涂抹均匀 (涂抹时菌液距离皿壁20mm)，晾干待用。
[0181] 将已经培养32h后的线虫用M9缓冲液冲洗2-3次后，定容至lmL，然后用移液枪吸取 适当体积(0.2-2mL)滴加在涂有0P50的NGM平板中央，将平板用封口膜密封，再用保鲜膜包 裹好后（以防染菌)放入20 °C培养箱中培养24h。
[0182] 收集线虫，用M9缓冲液反复清洗2-3次，保证所有线虫全部收集。定容至lmL，放入 冰箱中或进行液相前处理。
[0183] 3.液体给药培养秀丽隐杆线虫
[0184] 同期化后，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500-2000r/min离心2-5min收集幼虫， 转到涂有大肠杆菌0P50的NGM平板上，将平板置于20 °C培养箱中继续培养，培养32h。
[0185] 将配制好的SM培养液，在无菌条件下分装入6孔培养板中，每孔3.6mL，再加入配制 好的不同浓度〇，0.05,0.15,0.25,0.35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤每孔 1.2mL，每个药品每个浓度三个平行。
[0186] 通过显微镜观察，选择长势相同的平板用M9缓冲液冲洗干净，转至15mL离心管中， 1500-2000r/min离心2-5min，吸取上清，并定容至lmL摇勾分装入6孔培养板，使每孔含有虫 体500 ± 5条，用封口膜封好之后放于20 °C培养箱培养0，6，10，18，24，32h然后用移液枪吸入 15mL离心管中，离心1500_2000r/min离心2_5min，然后定容至lmL，放入冰箱进行保存或进 行液相前处理。
[0187] 4.秀丽隐杆线虫寿命实验
[0188] 同期化秀丽隐杆线虫。
[0189] 固体培养经过32h，用M9冲下、清洗，收集线虫。
[0190]取六孔板，液体培养秀丽隐杆线虫，再用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h、24h、 32h，对照组为M9溶液。对照组和每个实验组的秀丽线虫数均为500±5条。
[0191] 对照组和每个实验组的秀丽线虫全部分别转移至涂有0P50的含有5-氟尿嘧啶的 NGM培养基上，每天准确记录下秀丽线虫的死亡数目和丢失数目，直至所有受试的秀丽隐杆 线虫全部死亡。判断线虫死亡的标准是对外部刺激没有应答。如有爬到壁上死亡的，不算在 其内。
[0192] 平行试验重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0193] 5.秀丽隐杆线虫的运动情况
[0194] (1)同期化秀丽隐杆线虫。
[0195] (2)固体培养经过32h，用M9冲下、清洗，收集线虫。
[0196] (3)取六孔板，液体培养线虫，用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h，对照组为M9 溶液。对照组和每个实验组的秀丽隐杆线虫数均为500±5条。
[0197] (4)挑取秀丽隐杆线虫于无0P50的NGM培养基上，2min后，在显微镜下观察，以线虫 头部摆过去再摆回来为一次，记录在lmin内秀丽隐杆线虫的头部摆动次数，总共挑取10条 来观察；以线虫一个波长的正弦曲线运动为一次，记录在20s内秀丽隐杆线虫的身体弯曲次 数，共挑取10条来观察。
[0198] (5)平行试验重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0199] 6.秀丽隐杆线虫的产卵量 [0200] (1)同期化秀丽隐杆线虫。
[0201 ] (2)固体培养经过32h，用M9冲下、清洗，收集线虫。
[0202] (3)取六孔板，液体培养线虫，用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h，对照组为M9 溶液。对照组和每个实验组的秀丽线虫数均为500±5条。
[0203] (4)分别各挑取15条秀丽隐杆线虫于15个无0P50的NGM培养基上，每天把秀丽隐杆 线虫转移到新的无0P50的NGM培养基上，在显微镜下数虫卵数，直到产卵结束为止。
[0204] (5)平行试验重复两次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0205] 7.模型稳定性评价
[0206]将空白组和实验组的秀丽隐杆线虫在20°C下进行固体培养，并保证充足的食物， 分别培养6、12、18、24、301!后，用19冲洗秀丽线虫，收集，进行液相前处理，分别测定秀丽隐 杆线虫体内尿酸的含量；
[0207]其中，空白组为未建模前的秀丽线虫，实验组为建模后培养不同时间的秀丽隐杆 线虫；
[0208]平行试验至少重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0209] 8.别嘌呤醇评价
[0210] 具体步骤如下：
[0211 ]将建立模型前后的秀丽隐杆线虫分别给予别噪呤醇终浓度0.05、0.15、0.5mg/mL， 固体培养12h后，收集秀丽隐杆线虫，高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量； 其中，空白组为未建模前的秀丽隐杆线虫，模型组为建模后的秀丽隐杆线虫，平行试验至少 重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。
[0212 ] 9.黄嘌呤氧化酶活性(XOD)的测定
[0213]实验采用南京建成生物技术研究所的黄嘌呤氧化酶试剂盒测定，原理是黄嘌呤可 催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，超氧阴离子可以与显色剂作用生成紫红色，可以根据吸光度的 变化计算黄嘌呤氧化酶活力。具体操作步骤如下：
[0214] (1)同期化秀丽隐杆线虫
[0215] (2)将L1期幼虫等量转入固体培养基中培养32h后，尽量使每个平板上的线虫数量 相等，且数量适宜(500条左右）。
[0216] 取六孔板，每孔加入1.2mL，0.25mg/mL黄嘌呤，进行液体培养，将配制好的SM液体 培养液，在无菌条件下分装入6孔培养板中，每孔3.6mL，三个平行；
[0217] 通过显微镜观察，选择长势相同的平板用M9缓冲液冲洗干净，转至15mL离心管中， 1500-2000r/min离心2-5min，吸取上清，并定容后摇匀分装入6孔培养板，使每孔含有虫体 500 ± 5条，用封口膜封好之后放于20 °C培养箱培养18h建模，得建模后线虫。
[0218] (3)将建模后线虫从孔板中吸出，M9清洗三次，冰浴条件下，充分匀浆，制成匀浆 液。冷冻离心机3000-5000r/min，离心5-15min，取上清液进行测定。
[0219] (4)按照南京建成生物工程研究所的黄嘌呤氧化酶(X0D)试剂盒说明书上的操作 规程操作。
[0220] (5)组织中黄嘌呤氧化酶的活性是每克组织蛋白在37 °C每分钟转化Ιμπιο 1的底物 所需的酶量为一个酶活力单位。
[0221] 计算公式：
[0223]式中：U代表黄嘌呤氧化酶活力(U/gpr〇t)，A：^测定管0D值，六丨是空白管0D值，m为 呈色物摩尔消光系数：12.6*1(T3，V为反应液的总体积(mL)，％*取样量(mL)，d表示光径，t 表示反应时间(min)，c表示勾楽:蛋白浓度(gprot/L)。
[0224] 本发明的相关检测结果：
[0225] 1.秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的测定
[0226] 图3为高效液相色谱法检测法尿酸标品液相色谱图，尿酸保留时间为2.941min。图 4为尿酸标准曲线，由标准曲线求得峰面积（y)对尿酸浓度（X)的线性回归方程为：y = 37.88x-401.54，相关系数R2 = 0.9982，该方程具有显著相关性。
[0227] 图5为尿酸样品的HPLC色谱图，利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内尿酸 的含量，利用乙腈除蛋白进行前处理。测定秀丽隐杆线虫体内尿酸水平为5.58yg/100条。
[0228] 2.秀丽隐杆线虫给药方式的确定
[0229] 秀丽隐杆线虫同期化后，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500r/min离心2min收集 幼虫，转到涂有大肠杆菌0P50的NGM平板上，将平板置于20°C培养箱中继续培养，培养32h。 分别将同等药品配入SM液体培养基、NGM固体培养基中，每个药品每个浓度三个平行，并分 别接入大肠杆菌。将已经培养32h后的秀丽隐杆线虫用M9缓冲液冲洗2-3次后，定容至一定 体积后加入培养基中（500条左右），放入20°C培养箱中培养24h。
[0230] 图6为不同给药方式的比较，秀丽隐杆线虫固体给药方式和液体给药方式的空白 对照组无显著差异(P>〇.05)。秀丽隐杆线虫在液体培养方式给药时，尿酸含量较空白组升 高5.39yg/500条，而固体培养给药时，尿酸含量较空白组仅升高2.08yg/500条，所以，本实 验采用液体培养的方式建立秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0231] 3.最适造模药物、浓度及时间的确定
[0232] 按照固体给药方式研究不同浓度(0.05，0.15，0.25mg/mL)和给药不同时间（6、12、 18、24、30h)的四种造模剂次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量 的影响，以500条秀丽隐杆线虫为单位。
[0233] 图7为不同浓度的次黄嘌呤、尿酸、腺嘌呤、黄嘌呤四种造模剂对秀丽隐杆线虫体 内尿酸含量的影响。图8为次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤、腺嘌呤四种造模剂不同造模时间对秀丽 隐杆线虫体内尿酸含量的影响。
[0234] 由图7和图8,比较四种给药物质，次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤三种药物给予秀丽隐杆 线虫后，体内的尿酸含量都有一定程度的升高，而腺嘌呤药物基本无变化，统计学上无显著 差异(p>0.05)。而黄嘌呤浓度0.25mg/mL组和黄嘌呤给药18h组、给药24h组、给药32h组较空 白组比其它物质在不同浓度和给药不同时间的情况下升高秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量 都多，且与空白组有极显著差异(P〈〇.001)。
[0235] 由图7、图8可以看出，次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤在浓度为0.25mg/mL时，秀丽隐杆线 虫体内的尿酸升高明显，较空白组分别升高10. 〇2yg，11.42yg，19.20yg，统计分析，次黄嘌 呤和尿酸(〇. 25mg/mL)组较空白组差异显著(p〈0.05)，黄嘌呤组(0.25mg/mL)组较空白组差 异极显著(p〈〇.〇〇l)。
[0236] 由结果可知，给予秀丽隐杆线虫次黄噪呤、尿酸、黄噪呤的最佳浓度均为0.25mg/ mL，但是，这三种物质中0.25mg/mL黄噪呤使秀丽隐杆线虫体内尿酸升高最为明显，所以后 续实验〇. 25mg/mL黄噪呤来建立秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
[0237] 考虑到药物本身对秀丽隐杆线虫生长的影响，可能并不是作用时间越长，尿酸升 高越多越好，需要选择一个合适的给药时间，既不能对秀丽隐杆线虫造成较大伤害，又可以 使秀丽隐杆线虫达到高尿酸状态。寿命实验是评价药物毒性的经典实验。
[0238] 图9为黄嘌呤的给药时间对秀丽隐杆线虫的存活率的影响。图10为黄嘌呤不同的 给药时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响。
[0239] 由图9可知，空白组最长寿命39d，给药18h、24h、32h的最长寿命较空白组分别减少 ld，3d和7d。可见，黄嘌呤对秀丽隐杆线虫有一定程度的伤害。空白组在21d、给药18h组15d、 24h组13d、32h组10d，秀丽隐杆线虫的存活率在50%以上。
[0240] 由图10可知，各组平均寿命均有一定程度的降低，给药18h组较空白组降低1.68d， 给药24h组平均寿命较空白组降低4.85d，给药32h组较空白组平均寿命降低8.69d。统计分 析，给药18h与空白组比较，平均寿命无显著差异(p>0.05)，而给药24h和给药32h均有极显 著差异(P〈〇.〇l)。所以，给药24h和32h均会对秀丽隐杆线虫造成较大伤害，而给药18h组虽 然对秀丽隐杆线虫有一定的伤害，但还未达到显著水平。
[0241] 结果表明，黄嘌呤药物对秀丽隐杆线虫有一定的影响，随给药时间的延长，寿命影 响加剧。但是在18h，秀丽隐杆线虫体内已经到达高尿酸状态，与空白组有极显著差异，为避 免药物本身可能对秀丽隐杆线虫造成较大的影响，又使尿酸显著升高，所以最合适时间选 择给药18h。
[0242] 4.模型持久性评价
[0243] 研究造模后秀丽隐杆线虫体内尿酸含量随时间的变化，测定造模前后秀丽隐杆线 虫体内尿酸含量随时间变化情况，其结果如图11所示。
[0244] -18h表示利用黄嘌呤0 · 25mg/mL开始建立秀丽隐杆线虫高尿酸模型，Oh代表模型 组，由图11可以看出，Oh秀丽隐杆线虫体内尿酸含量显著升高(升高约52.48%)，统计分析 差异极显著(P〈〇.001)。模型组在12h，模型秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量基本维持稳定的 高尿酸状态，12h后，秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量呈下降趋势。24h秀丽隐杆线虫体内尿酸 含量较空白组变为有显著差异(P〈〇.05)，表明高尿酸虽然有所下降，但与未给药的秀丽隐 杆线虫体内的尿酸含量还是有显著差异的。所以，秀丽隐杆线虫高尿酸模型可以维持12h。
[0245] 有些模型维持时间特别短，如腹腔注射氧嗪酸钾建立的小鼠高尿酸模型，仅能维 持5h，为筛选和治疗尚尿酸血症未能提供足够的时间。本实验建立的秀刚隐杆线虫尚尿酸 模型基本稳定，可维持12h左右，而为药物筛选和机理研究提供了可能性。
[0246] 5.不同浓度的别嘌呤醇对模型秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响
[0247]建立模型后的秀丽隐杆线虫分别给予别噪呤醇终浓度0.05、0.15、0.5mg/mL，固体 培养12h后，收集秀丽隐杆线虫，HPLC测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量。空白组为未建模 前的秀丽隐杆线虫，模型组为建模后的秀丽隐杆线虫，平行试验至少重复三次，实验结果用 SPSS软件进行统计处理。
[0248]其结果如图12所示。模型组秀丽隐杆线虫体内尿酸含量较空白组显著升高，约 52.4%，统计学有极显著意义(p〈0.001)。给予别噪呤醇0.05、0.15mg/mL后，秀丽隐杆线虫 体内尿酸含量较空白组有极显著差异(P〈〇.〇〇l)。给予别嘌呤醇〇.25mg/mL后，秀丽隐杆线 虫体内尿酸含量较模型组有显著下降，约15.0%，统计学有显著差异(p〈0.01)，而别嘌呤醇 (0.2511^/111〇组秀丽隐杆线虫较空白组有显著差异(口〈0.05)，说明用0.2511^/1111^别噪呤醇对 秀丽隐杆线虫进行治疗后，秀丽隐杆线虫体内尿酸有显著下降，但还未达到正常水平。 [0249] 6.造模前后秀丽隐杆线虫存活率和平均寿命的考察
[0250]将对照组和每个实验组的秀丽隐杆线虫全部分别转移至涂有0P50的含有5-氟尿 嘧啶的NGM培养基上，每天准确记录下秀丽隐杆线虫的死亡数目和丢失数目，直至所有受试 的秀丽隐杆线虫全部死亡。判断秀丽隐杆线虫死亡的标准是对外部刺激没有应答。如有爬 到壁上死亡的，不算在其内。平行试验重复三次，研究造模前后秀丽隐杆线虫存活率和平均 寿命的变化情况，实验结果用SPSS软件进行统计处理。结果如表1和图13所示。
[0251] 表1造模前后秀丽隐杆线虫的平均寿命表（土 SD)
[0252]
[0253] 由表1可知，模型组秀丽隐杆线虫的平均寿命与空白组无显著差异(p>0.05)。结果 表明，建立秀丽隐杆线虫高尿酸模型使用的造模剂黄噪呤(〇. 25mg/mL，18h)并未对秀丽隐 杆线虫造成显著伤害。
[0254] 由图13可知，模型组秀丽隐杆线虫的存活率与空白组无显著差异(p>0.05)。结果 表明，建立秀丽隐杆线虫高尿酸模型使用的造模剂黄噪呤(0.25mg/mL，18h)并未对秀丽隐 杆线虫造成显著伤害。
[0255] 7.造模前后秀丽隐杆线虫运动情况的考察
[0256] 挑取秀丽隐杆线虫于无0P50的NGM培养基上，2min后，在显微镜下观察，以秀丽隐 杆线虫头部摆过去再摆回来为一次，记录在lmin内秀丽隐杆线虫的头部摆动次数，总共挑 取10条来观察；以秀丽隐杆线虫一个波长的正弦曲线运动为一次，记录在20s内秀丽隐杆线 虫的身体弯曲次数，共挑取10条来观察。平行试验重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计 处理。
[0257] 造模前后对秀丽隐杆线虫头部摆动的影响、身体弯曲的影响如表2、图14、图15所 不。
[0258]表2造模前后秀丽隐杆线虫的头部摆动频率和身体弯曲频率表（土 SD)
[0259]
[0260]由图14可以看出，模型组的头部摆动频率与空白组无显著差异(p>0.05)，所以，利 用造模剂黄嘌呤给药18h对模型秀丽隐杆线虫的头部摆动不会造成显著影响。
[0261] 由图15可以看出，模型组组的身体弯曲频率与空白组无显著差异(p>0.05)，所以， 利用造模剂黄嘌呤给药18h对模型秀丽隐杆线虫的身体弯曲不会造成显著影响。
[0262] 实验结果表明，利用造模剂黄嘌呤(0.25mg/mL，18h)造模并不会对秀丽隐杆线虫 造成显著伤害，从而证明了模型的可靠性。
[0263] 8.造模前后秀丽隐杆线虫产卵量的考察
[0264] 取六孔板，液体培养秀丽隐杆线虫，用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h，对照组 为M9溶液。对照组和每个实验组的秀丽隐杆线虫数均为500±5条。分别各挑取15条秀丽隐 杆线虫于15个无0P50的NGM培养基上，每天把秀丽隐杆线虫转移到新的无0P50的NGM培养基 上，在显微镜下数虫卵数，直到产卵结束为止，平行试验重复两次，实验结果用SPSS软件进 行统计处理。
[0265] 造模前后秀丽隐杆线虫产卵量的变化结果如表3、图16所示。
[0266] 表3造模前后秀丽隐杆线虫产卵情况的变化表（土 S.D)
[0267] 结果表明，造模前后秀丽隐杆线虫的产卵量无显著改变(p>0.05)。所以，利用造模 剂黄嘌呤(〇.25mg/mL，18h)造模对秀丽隐杆线虫的产卵情况不会造成显著影响。
[0268] 研究造模前后线虫体内黄嘌呤氧化酶活性的变化，其结果如表4所示。
[0269] 表4造模前后线虫体内黄嘌呤氧化酶活性的变化表（土S.D)
[0270]
[0271] X0D活力定义为每克匀浆蛋白在37°C每分钟转化lwnol的底物所需要的酶量为一 个酶活力单位。由表4可知，模型组黄嘌呤氧化酶活力较空白组有极显著升高(p〈0.001)。结 果表明，用造模剂黄嘌呤可以建立线虫高尿酸模型的原因是使线虫体内的黄嘌呤氧化酶活 性显著提高了。在嘌呤代谢中，黄嘌呤氧化酶是调控速度与进程的关键酶。黄嘌呤氧化酶的 活性提高了，有利于黄嘌呤向着尿酸的方向转化，使线虫体内尿酸含量升高。另一方面，黄 嘌呤向着尿酸方向转化也有利于次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，进而再氧化为尿酸，使体内嘌呤 代谢的速度加快，从而使线虫体内尿酸含量会显著升高。
[0272]由上面检测结果可以看出，采用前体物质黄嘌呤(0.25mg/mL，18h)可建立低损伤 性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。本研究不仅为高尿酸血症病理研究和新 药研发增加了新的研究工具，而且为其他代谢性疾病动物模型的建立提供了有益参考。 [0273]由此可见，本发明秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法可以应用在降尿酸药物筛 选中；本发明方法秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法所构建的秀丽隐杆线虫高尿酸模型 也可以应用在降尿酸药物筛选中。
【主权项】
1. 一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法，其特征在于:步骤如下： 利用秀丽隐杆线虫，采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25-0.45mg/mL、液体给药，20-25 °C条件下培养18-32h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。2. 根据权利要求1所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法，其特征在于：步骤如 下： 利用秀丽隐杆线虫，采用前体物质黄嘌呤、终浓度为〇.25mg/mL、液体给药，20°C条件下 培养18h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。3. 如权利要求1或2所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法在降尿酸药物筛选中 的应用。4. 如权利要求1或2所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法所构建的秀丽隐杆线 虫高尿酸模型在降尿酸药物筛选中的应用。5. 如权利要求1或2所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，其特征在 于:步骤如下： ⑴利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量； ⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养，通过比 较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响，确定最佳的给药培养方式； (3)对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和 腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间，以秀丽隐杆线虫为单位，测定秀丽隐杆线 虫体内尿酸含量的变化，确定最佳的给药物质、给药剂量； 所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.6511^/1^;所述不同的作用时间为0,6， 10,18,24,32,48h； ⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下，测定最佳给药物质在不同给药 时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳 给药物质的最佳给药时间； 所述不同给药时间为〇，18，24，32，48h; (5)确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法，对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽隐杆 线虫模型进行系列实验评价，所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评价、秀 丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活性评 价，确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的损伤 性，确定最佳条件，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。6. 根据权利要求5所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，其特征在 于:步骤如下： ⑴利用高效液相色谱法测定400-1000条秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量； ⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养，通过比 较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响，确定最佳的给药培养方式，为液体 给药； (3)对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和 腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间，以400-1000条秀丽隐杆线虫为单位，测定 秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳的给药物质、给药剂量，为黄嘌呤终浓度 0.25mg/mL； 所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.6511^/1^;所述不同的作用时间为0,6， 10,18,24,32,48h； ⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下，测定黄嘌呤在不同给药时间对 秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定黄嘌呤的最 佳给药时间，为18h; 所述不同给药时间为〇，18，24，32，48h; (5)确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法，对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽隐杆 线虫模型进行系列实验评价，所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评价、秀 丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活性评 价，确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的损伤 性，确定最佳条件，即采用前体物质黄嘌呤、终浓度为〇. 25-0.45mg/mL、液体给药、20-25°C、 18-32h，即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。7.根据权利要求5或6所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，其特征 在于:所述步骤⑴中秀丽隐杆线虫测定前经乙腈除蛋白处理，且乙腈的加入量为：500条秀 丽隐杆线虫加入乙腈5.OmL; 或者，所述高效液相色谱法测定尿酸含量的条件如下： 色谱柱：Intertsil 0DS-SP色谱柱，5ym，4.6mmX250mm; 流动相：10mm〇l/L的乙酸铵； 检测器:紫外检测器； 柱温：25°C; 流速：lmL/min; 进样量:30yL; 标准曲线绘制:准确称取4.Omg尿酸标准品，用质量百分数为25%的氨水超声溶解定容 至10mL，得到浓度为400yg/mL的尿酸标准母液，配制成浓度为0，12.5，30，60，90，120，150μ g/mL的尿酸标准溶液，过膜备用;准确进样30yL，根据峰面积与标准溶液进样浓度成正比的 对应关系绘制尿酸标准曲线，求得回归方程、相关系数及其线性范围； 或者，所述步骤⑵中固体给药的培养具体如下： 秀丽隐杆线虫所用标准培养基为NGM培养基，其配制比例及程序为3g NaCl、17g琼脂、 2.5g蛋白胨、1L双蒸水，高压蒸汽灭菌后，在无菌条件下加入lmL胆固醇的浓度为5mg/mL的 胆固醇无水乙醇溶液、lmL浓度为lmol/L且经高压蒸汽灭菌的MgS〇4溶液、lmL浓度为lmol/L 且经高压蒸汽灭菌的CaCl2溶液和25mL的lmol/L、经高压蒸汽灭菌、pH = 6.0的磷酸钾缓冲 液，充分混均，倒入直径为9cm的培养皿，冷却待用； 其中，所述胆固醇无水乙醇溶液的制备过程为：胆固醇使用无水乙醇进行溶解且经 0.45μπι滤膜过滤除菌； 线虫同期化，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500-2000r/min离心2-5min收集幼虫，转 到涂有大肠杆菌0P50的NGM培养基平板上，将平板置于20°C培养箱中继续培养，培养至32h 后待用； 不同浓度〇，0.05,0.15,0.25,0.35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤、培养 基准备完毕后，吸取5 m L药品，至一已灭菌的5 0 m L离心管中，再倾倒N G Μ培养基至体积 22.5mL，再倒入平板，待其凝固后进行下一步实验;每个药品的每个浓度三个平行，此过程 需快速，以免培养基凝固；空白平板加入5mL M9缓冲液； 平板中培养基凝固后，选择无气泡、表面光滑的平板，用移液枪吸取l〇〇yL大肠杆菌 0P50于培养基上，并涂抹均匀，涂抹时菌液距离皿壁20mm，晾干待用； 将已经培养32h后的线虫用M9缓冲液冲洗2-3次后，定容，然后用移液枪吸取0.2-2mL滴 加在涂有0P50的NGM平板中央，将平板用封口膜密封，再用保鲜膜包裹好后放入20 °C培养箱 中培养24h; 收集线虫，用M9缓冲液反复清洗2-3次，保证所有线虫全部收集，定容至lmL，放入冰箱 中或进行液相前处理； 或者，所述步骤⑵中液体给药的培养具体如下： 同期化后，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500-2000r/min离心2-5min收集幼虫，转到 涂有大肠杆菌0P50的NGM平板上，将平板置于20 °C培养箱中继续培养，培养32h; 将配制好的SM液体培养液，在无菌条件下分装入6孔培养板中，每孔3.6mL，再加入配制 好的不同浓度〇，〇. 05，0.15，0.25，0.35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤，每孔 1.2mL，每个药品每个浓度三个平行； 通过显微镜观察，选择长势相同的平板用M9缓冲液冲洗干净，转至15mL离心管中， 1500-2000r/min离心2-5min，吸取上清，并定容后摇匀分装入6孔培养板，使每孔含有虫体 500 ± 5条，用封口膜封好之后放于20 °C培养箱分别培养至0，6，10，18，24，32h，然后用移液 枪吸入15mL离心管中，1500-2000r/min离心，然后定容至lmL，放入冰箱进行保存或进行液 相前处理。8.根据权利要求5或6所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，其特征 在于:所述步骤⑷的具体步骤如下： 取同期化秀丽隐杆线虫，固体培养32h，用M9冲下、清洗，收集线虫； 取六孔板，液体培养秀丽隐杆线虫，再用0.25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h、24h、32h， 对照组为M9溶液;对照组和每个实验组的秀丽线虫数均为500 ± 5条； 对照组和每个实验组的秀丽线虫全部分别转移至涂有0P50的含有5-氟尿嘧啶的NGM培 养基上，每天准确记录秀丽线虫的死亡数目和丢失数目，直至所有受试的秀丽隐杆线虫全 部死亡，判断线虫死亡的标准是对外部刺激没有应答，如有爬到壁上死亡的，不算在其内； 平行试验重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理； 或者，所述步骤(5)中秀丽隐杆线虫运动能力变化评价的具体步骤如下： ① 取同期化秀丽隐杆线虫； ② 线虫固体培养32h，用M9冲下、清洗，收集线虫； ③ 取六孔板，液体培养线虫，用〇. 25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h，对照组为M9溶液； 对照组和每个实验组的秀丽隐杆线虫数均为500 ± 5条； ④ 挑取秀丽隐杆线虫于无0P50的NGM培养基上，2min后，在显微镜下观察，以线虫头部 摆过去再摆回来为一次，记录在lmin内秀丽隐杆线虫的头部摆动次数，总共挑取10条来观 察；以线虫一个波长的正弦曲线运动为一次，记录在20s内秀丽隐杆线虫的身体弯曲次数， 共挑取10条来观察； ⑤平行试验重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理； 或者，所述步骤(5)中秀丽隐杆线虫产卵量变化评价的具体步骤如下： ① 取同期化秀丽隐杆线虫； ② 线虫固体培养32h，用M9冲下、清洗，收集线虫； ③ 取六孔板，液体培养线虫，用〇. 25mg/mL黄嘌呤对其分别给药18h，对照组为M9溶液； 对照组和每个实验组的秀丽线虫数均为500 ± 5条； ④ 分别各挑取15条秀丽隐杆线虫于15个无0P50的NGM培养基上，每天把秀丽隐杆线虫 转移到新的无0P50的NGM培养基上，在显微镜下数虫卵数，直到产卵结束为止； ⑤ 平行试验重复两次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。9. 根据权利要求5或6所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，其特征 在于:所述步骤(5)中模型稳定性评价的具体步骤如下： 将空白组和实验组的秀丽隐杆线虫在20°C下进行固体培养，并保证充足的食物，分别 培养6、12、18、24、301!后，用19冲洗秀丽线虫，收集，进行液相前处理，分别测定秀丽隐杆线 虫体内尿酸的含量； 其中，空白组为未建模前的秀丽线虫，实验组为建模后培养不同时间的秀丽隐杆线虫； 平行试验至少重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理； 或者，所述步骤(5)中别嘌呤醇评价的具体步骤如下： 将建立模型前后的秀丽隐杆线虫分别给予别嘌呤醇终浓度0.05、0.15、0.5mg/mL，在 NGM培养基上培养12h后，收集秀丽隐杆线虫，高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿 酸含量;其中，空白组为未建模前的秀丽隐杆线虫，模型组为建模后的秀丽隐杆线虫，平行 试验至少重复三次，实验结果用SPSS软件进行统计处理。10. 根据权利要求5或6所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，其特 征在于:所述步骤(5)中黄嘌呤氧化酶活性评价的具体步骤如下： ① 取同期化秀丽隐杆线虫； ② 将L1期幼虫等量转入固体培养基中培养32h后，使每个平板上的线虫数量相等，且数 量为500 ±5条； ③ 取六孔板，每孔加入1.2mL，0.25mg/mL的黄嘌呤，进行液体培养，将配制好的SM液体 培养液，在无菌条件下分装入6孔培养板中，每孔3.6mL，三个平行； 通过显微镜观察，选择长势相同的平板用M9缓冲液冲洗干净，转至15mL离心管中， 1500-2000r/min离心2-5min，吸取上清，并定容后摇匀分装入6孔培养板，使每孔含有虫体 500 ± 5条，用封口膜封好之后放于20°C培养箱培养18h建模，得建模后线虫； ④ 将建模后线虫从孔板中吸出，M9清洗三次，冰浴条件下，充分匀浆，制成匀浆液，冷冻 离心机3000-5000r/min，离心5-15min，取上清液进行测定； ⑤ 按照南京建成生物工程研究所的黄嘌呤氧化酶试剂盒说明书上的操作规程操作。
【文档编号】A61K49/00GK105833295SQ201610318064
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】李贞景, 王昌禄, 李志 , 熊春福, 陈勉华, 李风娟, 武淑芬
【申请人】天津科技大学