一种含有表皮干细胞分泌素的抗衰老护肤品及其制备方法
【专利摘要】本发明属于护肤品领域，具体涉及一种含有表皮干细胞分泌素的抗衰老护肤品及其制备方法。所述的护肤品由以下重量百分比计的组分组成：表皮干细胞分泌素0.000001?0.0005％、植物提取物2～8％、角鲨烷1～2％、EDTA?2Na 0.10～0.25％、甘油5～10％、聚谷氨酸0.05～1％、K350 0.06～0.12％、肉豆蔻酸异丙酯2～6％、鲸蜡硬脂醇0.5～2％、聚二甲基硅氧烷1～2％，余量为水；其中，所述植物提取物由海红豆、雪丽花、刺五、冬青皮和覆盆子制备而成。本发明护肤品显著改善皮肤老化，延缓衰老，降低不良反应的发生，且制备方法简单，性质稳定。
【专利说明】
一种含有表皮干细胞分泌素的抗衰老护肤品及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于护肤品领域，具体涉及一种含有表皮干细胞分泌素的抗衰老护肤品及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 皮肤衰老是由自然因素或非自然因素造成的皮肤衰老现象，表现为皱纹的出现、 皮肤的松弛、不规则性色素沉着、血管扩张、表皮角化不良、出现异常增殖、真皮弹性纤维变 性及降解产物蓄积等。皮肤衰老与细胞衰老密切相关，尤其与成纤维细胞和角质形成细胞 的衰老紧密联系。成纤维细胞在衰老的过程中胶原的分泌减少，同时细胞胶原酶的诱导能 力上调，引起胶原蛋白分解增强，从而促使皮肤弹性下降，皱纹出现。此外，角质形成细胞在 皮肤保水、保湿、屏障以及皮肤并形成等多方面具有非常重要的调节作用。角质形成细胞衰 老的过程中与皮肤修复相关的基因表达迟缓，而损伤有关基因表达增加，从而促使皮肤老 化。
[0003] 干细胞是一种尚未分化发育的种子细胞，具有无限自我更新复制能力，且能分化 成特定组织，这是干细胞用于护肤美容乃至组织再生的基础。研究表明，在衰老的动物体 内，表皮细胞代谢速度减慢，因此皮肤斑点增加，皱纹增多。表皮干细胞的主要功能是补充 表皮细胞维持皮肤细胞的平衡以及修复受损组织。促进表皮干细胞的增殖分化就能使皮肤 保持旺盛的新陈代谢。此外，干细胞的自我复制及多潜能分化还依赖于多种生长因子的协 同促进作用，研究表明，干细胞在培养过程中会分泌一些活性物质，包括生长因子、细胞因 子、活性多肽、蛋白质、生长激素、微量元素等物质，促进自身的扩增及分化的子细胞的增 殖。
[0004] 目前，已有人从干细胞培养的残液中提干细胞分泌因子(又称干细胞分泌素）用于 化妆品。邰举在科技日报发表的"全球首支干细胞化妆品将在韩上市"一文中指出2011年韩 国FCB Pharmicell公司以骨髓干细胞培养液为核心原料开发出了人体干细胞培养液化妆 品，该公司在试验中发现注入骨髓干细胞培养液的皮肤成纤维细胞中生成的胶原蛋白量是 对照组的5倍以上。中国专利申请201110452259.6公开了一种用于皮肤美容修复的复合生 物制剂及制备方法，该复合生物制剂含有脐带血干细胞活性成分和胎盘活性成分，具有促 进产妇表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛斑的目的，但所述的复合生物制剂是 按照常规的护肤品生产方法制备而成的，即将脐带血干细胞活性物、胎盘活性物按比例与 常规化妆品的赋形物混合按照常规的护肤品生产方法制成霜类化妆品等。众所周知，干细 胞美容产品中的活性成分很容易在常温下失活，要保持它的活性，就必须有特定条件下制 备和保存。因此，此类干细胞美容产品的效果有待商榷。此外，异源性的干细胞提取物应用 于人容易引起过敏反应等不良反应。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能有效地对皮肤进行修复且不会引起过敏反应的含 有表皮干细胞分泌素的抗衰老护肤品及其制备方法。所述的抗衰老护肤品活性成分能较好 地保存，从而充分发挥其促进皮肤增生能力，提高皮肤弹性，改善肤质的效果，不存在异源 性等原因引起的过敏反应等现象，且制备方法简单，性质稳定。
[0006] 本发明通过如下技术方案以实现上述目的：
[0007] -种含有表皮干细胞分泌素的抗衰老护肤品，其特征在于，所述护肤品由以下重 量百分比计的组分组成:表皮干细胞分泌素0.000001-0.0005%、植物提取物2~8%、角鲨 烷1~2%401厶-2恥0.10~0.25%、甘油5~10%、聚谷氨酸0.05~1%、6瓜>顿1(350 0.06~ 0.12%、肉豆蔻酸异丙酯2~6%、鲸蜡硬脂醇0.5~2%、聚二甲基硅氧烷1~2%，余量为水。
[0008] 优选地，所述的抗衰老护肤品，其特征在于，所述护肤品由以下重量百分比计的组 分组成:表皮干细胞分泌素0 . 〇〇〇 125 %、植物提取物6 %、角鲨烷1 %、EDTA-2Na 0.15 %、甘 油8%、聚谷氨酸0.50%、卻、;>4免1(350 0.10%、肉豆蔻酸异丙酯4%、鲸錯硬脂醇1%、聚二甲 基硅氧烷2 %，余量为水。
[0009] 进一步地，所述表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合 物。
[0010] 进一步地，所述植物提取物由以下重量百分计的原料制备而得:海红豆16~28 %、 雪丽花14~30%、刺五加12~28%、冬青皮14~26%和覆盆子10~22%。
[0011] 优选地，所述植物提取物由以下重量百分计的原料制备而得:海红豆22%、雪丽花 22%、刺五加20%、冬青皮20%和覆盆子16%。
[0012] 进一步地，所述表皮干细胞分泌素的制备方法包括以下步骤：
[0013] ⑴人表皮干细胞的获取
[0014]取手术切除或刮取口腔上皮组织，将组织转入含有青霉素、链霉素和硫酸庆大霉 素的D-PBSA(磷酸盐缓冲液）中，干冰或液氮冷冻条件下运回实验室。反复漂洗2-3次，加入 胰蛋白酶37°C消化30min，将口腔上皮组织剪碎，用70-100um细胞过滤器过滤上皮细胞，收 集滤液。1200r/min条件下离心5min，弃上清，用Defined Keratinocyte-SFM培养基轻柔吹 打，得细胞悬液，利用胶原快速贴附法分离纯化人表皮干细胞；
[0015] (2)人表皮干细胞的培养
[0016]将步骤（1)得到的人表皮干细胞接种在含有100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素 Defined Keratinocyte-SFM培养基中，37 °C、5 % C02培养箱孵育12-24h，弃培养基，重新加 入新鲜的含有青霉素和链霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培养基，培养l-3d，弃培养基，加 入Def ined Keratinocyte-SFM培养基继续培养。待人表皮干细胞接近90 %融合时，传代培 养；
[0017] ⑶表皮干细胞分泌素的制备
[0018] 将人表皮干细胞扩增1-5代，收集培养上清液，将上清液用0.22M1的无菌过滤器过 滤，合并每一代的滤液即得表皮干细胞分泌素。
[0019] 进一步地，所述植物提取物的制备方法包括以下步骤：
[0020] 分别按比例取各味药材，洗去杂质，干燥后粉碎，过50~60目筛，合并粗粉，加入药 材粗粉总重量8~12倍量体积分数为50~70%的乙醇，微波提取4~6分钟，微波功率为400 ~500W，提取温度为40~60°C，将提取液过滤，按同样条件重复提取1次，合并提取液，减压 浓缩至60°C下测相对密度为1.05~1.15的浸膏，制得植物提取物。
[0021] 此外，本发明还提供所述的抗衰老护肤品的制备方法，其包括以下步骤：
[0022] 步骤1:将表皮干细胞分泌素、赋形剂、注射用水混合均匀，进行真空冷冻干燥，得 冻干粉备用；
[0023] 步骤2:将EDTA-2Na、聚谷氨酸和水混匀，加热至80°C，均质6~lOmin，搅拌至溶解 完全，得物料A;
[0024] 步骤3:将甘油、角鲨烷、肉豆蔻酸异丙酯、鲸蜡硬脂醇和聚二甲基硅氧烷混匀，加 热至80~90°C，均质10~15min，搅拌至溶解完全，得物料B;向物料A中缓慢加入物料B，搅拌 均匀，开始降温；
[0025] 步骤4:待温度降至30°C左右时，向乳化锅中加入植物提取物、euxyl?K350和步骤1 制得的冻干粉，搅拌均匀，对板出料；
[0026]其中，步骤1所述的赋形剂为甘露醇和L-精氨酸以1:1配比制得的混合物；
[0027] 其中，步骤1的真空冷冻干燥步骤为:将表皮干细胞分泌素、赋形剂、注射用水混合 均匀后置于-70°C冻干机中，冷却至-50°C以下，预冻6h，抽真空8h，缓慢升温至-20 °C，再以5 °C/h的速度升温至25°C，保温干燥2h，即得。
[0028] 与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0029] (1)本发明提供的抗衰老护肤品的活性成分为表皮干细胞分泌素和植物提取物， 所述的表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物，因此可避免干 细胞提取物异源性导致的免疫排斥反应，降低过敏反应的发生率;此外，植物提取物中的有 效成分具有促进透皮吸收作用，使抗衰老护肤品的活性成分深入到皮肤真皮层和皮下组织 充分发挥修复皮肤，促进皮肤增生能力的功效;另外，植物提取物中的有效成分还具有蛋白 水解酶抑制作用，从而延缓表皮干细胞分泌素中的生物活性成分在真皮细胞和皮下组织细 胞内被蛋白水解酶降解的速度，提高表皮干细胞分泌素抗衰老功效。
[0030] (2)本发明在制备抗衰老护肤品的过程中，采用真空冷冻干燥技术把表皮干细胞 分泌素制成冻干粉，有利于保存表皮干细胞分泌素中的生物活性成分，从而更好地发挥抗 衰老功效。
[0031] (3)本发明提供的抗衰老护肤品能显著改善皮肤老化，降低不良反应的发生，增加 角质层含水量和油脂含量，其效果优于资生堂悠莱多活力乳液，且制备方法简单，性质稳 定，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0032] 以下通过【具体实施方式】进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
[0033] 实施例1
[0034] 本发明实施例1所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:表皮干细 胞分泌素0.000125%、植物提取物6%、角鲨烷1%40了4-2他0.15%、甘油8%、聚谷氨酸 0.50%、euxy_K350 0.10%、肉豆蔻酸异丙酯4%、鲸錯硬脂醇1%、聚二甲基硅氧烷2%，余 量为水;所述表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分计的原料制备而得:海红豆22%、雪丽花22%、刺五加20%、冬青 皮20%和覆盆子16%。
[0035]制备方法：
[0036] (1)表皮干细胞分泌素的制备：
[0037] 人表皮干细胞的获取:取手术切除或刮取口腔上皮组织，将组织转入含有青霉素、 链霉素和硫酸庆大霉素的D-PBSA(磷酸盐缓冲液）中，干冰或液氮冷冻条件下运回实验室。 反复漂洗3次，加入胰蛋白酶37°C消化30min，将口腔上皮组织剪碎，用lOOum细胞过滤器过 滤上皮细胞，收集滤液。1200r/min条件下离心5min，弃上清，用Defined Keratinocyte-SFM 培养基轻柔吹打，得细胞悬液，利用胶原快速贴附法分离纯化人表皮干细胞；
[0038]人表皮干细胞的培养:将人表皮干细胞接种在含有100U/ml青霉素和100ug/ml链 霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培养基中，37°C、5%C02培养箱孵育24h，弃培养基，重新加 入新鲜的含有青霉素和链霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培养基，培养2d，弃培养基，加入 Defined Keratinocyte-SFM培养基继续培养。待人表皮干细胞接近90%融合时，传代培养； [0039]表皮干细胞分泌素的制备:将人表皮干细胞扩增5代，收集培养上清液，将上清液 用0.22mi的无菌过滤器过滤，合并每一代的滤液即得表皮干细胞分泌素；
[0040] (2)植物提取物的制备：
[0041 ]分别按比例取各味药材，洗去杂质，干燥后粉碎，过60目筛，合并粗粉，加入药材粗 粉总重量10倍量体积分数为60 %的乙醇，微波提取5分钟，微波功率为450W，提取温度为45 °C，将提取液过滤，按同样条件重复提取1次，合并提取液，减压浓缩至60°C下测相对密度为 1.05的浸膏，制得植物提取物；
[0042] (3)抗装老护肤品的制备：
[0043] 步骤1:将表皮干细胞分泌素、赋形剂、注射用水混合均匀后置于-70°C冻干机中， 冷却至-50 °C以下，预冻6h，抽真空8h，缓慢升温至-20 °C，再以5 °C/h的速度升温至25 °C，保 温干燥2h，即得冻干粉备用；
[0044] 步骤2:将EDTA-2Na、聚谷氨酸和水混匀，加热至80°C，均质6~10min，搅拌至溶解 完全，得物料A;
[0045] 步骤3:将甘油、角鲨烷、肉豆蔻酸异丙酯、鲸蜡硬脂醇和聚二甲基硅氧烷混匀，加 热至80~90°C，均质10~15min，搅拌至溶解完全，得物料B;向物料A中缓慢加入物料B，搅拌 均匀，开始降温；
[0046] 步骤4:待温度降至30 °C左右时，向乳化锅中加入植物提取物、euxyl⑧K350和步骤1 制得的冻干粉，搅拌均匀，对板出料；
[0047]其中，步骤1所述的赋形剂为甘露醇和L-精氨酸以1:1配比制得的混合物。
[0048] 实施例2
[0049] 本发明实施例2所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:表皮干细 胞分泌素0.0005%、植物提取物8%、角鲨烷2%、EDTA-2Na 0.25%、甘油10%、聚谷氨酸 1%、euxyl?K350 0.12%、肉豆蔻酸异丙酯6%、鲸錯硬脂醇2%、聚二甲基硅氧烷2%，余量为 水;所述表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物;所述植物提 取物由以下重量百分计的原料制备而得：海红豆16%、雪丽花14%、刺五加28%、冬青皮 20 %和覆盆子22 %。
[0050] 制备方法同实施例1。
[0051 ] 实施例3
[0052]本发明实施例3所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:表皮干细 胞分泌素0.000001 %、植物提取物2%、角鲨烷1 %、EDTA-2Na 0.10 %、甘油5 %、聚谷氨酸 0.05%、e.uxyl_?K350 0.06%、肉豆蔻酸异丙酯2%、鲸錯硬脂醇0.5%、聚二甲基硅氧烷1%， 余量为水;所述表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物;所述 植物提取物由以下重量百分计的原料制备而得:海红豆28%、雪丽花30%、刺五加12%、冬 青皮20 %和覆盆子10 %。
[0053]制备方法同实施例1。
[0054] 实施例4
[0055] 本发明实施例4所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:表皮干细 胞分泌素0.00025%、植物提取物6%、角鲨烷1%4014-2他0.15%、甘油8%、聚谷氨酸 0.25 %、_euxyi?K350 0.10 %、肉豆蔻酸异丙酯4%、鲸錯硬脂醇1 %、聚二甲基硅氧烷2%，余 量为水;所述表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分计的原料制备而得:海红豆20 %、雪丽花20 %、刺五加20 %、冬青 皮26%和覆盆子14%。
[0056]制备方法同实施例1。
[0057] 实施例5
[0058]本发明实施例5所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:表皮干细 胞分泌素0.00005 %、植物提取物8%、角鲨烷2 %、EDTA-2Na 0.25 %、甘油10 %、聚谷氨酸 0.75 %、eu?cyl?K350 0.12 %、肉豆蔻酸异丙酯6 %、鲸蜡硬脂醇2 %、聚二甲基硅氧烷2 %，余 量为水;所述表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分计的原料制备而得:海红豆28%、雪丽花30%、刺五加12%、冬青 14%和覆盆子16%。
[0059]制备方法同实施例1。
[0060] 对比例1
[0061] 本发明对比例1所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:表皮干细 胞分泌素0.000125%、角鲨烷1 %、EDTA-2Na 0.15 %、甘油8%、聚谷氨酸0.50%、euxy?K350 0.10%、肉豆蔻酸异丙酯4%、鲸蜡硬脂醇1 %、聚二甲基硅氧烷2%，余量为水;所述表皮干 细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物。（与实施例1相比缺乏植物提 取物这一组分）
[0062]制备方法参考实施例1。
[0063] 对比例2
[0064] 本发明对比例2所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:植物提取 物6%、角鲨烷 1 %、EDTA-2Na 0.15%、甘油8%、聚谷氨酸0.50%、euxy靡K350 0.10%、肉豆 蔻酸异丙酯4%、鲸蜡硬脂醇1%、聚二甲基硅氧烷2%，余量为水;所述植物提取物由以下重 量百分计的原料制备而得：海红豆22%、雪丽花22%、刺五加20%、冬青皮20 %和覆盆子 16%。（与实施例1相比缺乏表皮干细胞分泌素这一组分）
[0065]制备方法参考实施例1。
[0066] 对比例3
[0067] 本发明对比例3所述的抗衰老护肤品由以下重量百分比计的组分组成:表皮干细 胞分泌素0.000125%、植物提取物6%、角鲨烷1%40了4-2他0.15%、甘油8%、聚谷氨酸 0.50%、eu:xy_i?K350 0.10%、肉豆蔻酸异丙酯4%、鲸錯硬脂醇1%、聚二甲基硅氧烷2%，余 量为水;所述表皮干细胞分泌素为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分计的原料制备而得:雪丽花30%、刺五加28%、冬青皮20%和覆盆 子22%。（与实施例1相比所述的植物提取物缺乏海红豆这一组分）
[0068]制备方法参考实施例1。
[0069 ]试验例一、本发明抗衰老护肤品抗皮肤老化临床观察
[0070] 1 ?试验方法
[0071] 筛选540例皮肤出现老化的女性受试志愿者，年龄28-50岁，平均年龄35岁，入选标 准:皮肤干燥，弹性降低，出现皱纹、色素沉着、肤色灰暗等皮肤老化现象;在整个试验期间 愿意避免日晒，或接触阳光时面部使用SPF 2 30的防晒产品；在整个试验期间不使用其他抗 装老广品〇
[0072] 540例女性受试志愿者随机分为9组，分别为对照组、实施例1 -5组、对比例1 -3组， 每组60例，其中，对照组受试者使用Shiseido Urara Multy-Vitalizing Emulsion(资生堂 悠莱多活力乳液），早、晚洁面后取适量的乳液涂抹在面部;实施例1-5组和对比例1-3组受 试者分别使用本发明实施例1-5、对比例1-3制得的抗衰老护肤品，早、晚洁面后取适量的护 肤品涂抹在面部，各组整个试验时间为90d，记录试验期间发生的不良反应，并对受试者进 行效果评价。
[0073] 皮肤老化评估:通过观察受试者的5个受试区的皱纹来评价(眉间纹、前额皱纹、鱼 尾纹、鼻唇沟、唇周皱纹），评判标准:没有皱纹;轻度:有2-3条浅皱纹，长度< 1.5cm;中度： 有2-6条浅皱纹，长度< 3cm;重度:有数条主皱纹，长度达4cm，同时伴有浅皱纹。
[0074] 安全性评估:主要评价使用产品后受试者出现轻微不适、红斑、干燥、瘙痒和刺痛 等不良反应的发生情况。
[0075] 在第90d对受试者采用无创性仪器检测受试部位的含水量、油脂含量，进行统计分 析。
[0076] 2 ?试验结果
[0077]表1试验结束后各组受试者的皮肤老化评估
[0079]~表2试验期间各组受试者的不良反应评价
[0081 ]表3各组受试者的试验期间的角质层含水量和油脂含量评价
[0084] 注：与0d 比较，*P<0 ? 05，林 P<0 ? 01。
[0085] Shiseido Urara Multy-Vitalizing Emulsion为日本资生堂悠莱多活力乳液，是 含有表皮生长因子的新一代抗衰老产品，专为中国女性配制的产品，其包含了三重氨基酸 修复成分，保湿、亮白、活化肌肤，促进胶原蛋白的合成;可有效改善皮肤的干燥、暗哑和皱 纹等问题，同时保护皮肤，阻隔外界有害物质，使皮肤年轻、亮白、光泽和有弹性;含有的表 皮生长因子活性成分，令肌肤光滑、紧致。
[0086] 本研究以日本资生堂悠莱多活力乳液作为对照组，评价本发明抗衰老护肤品的效 果，结果表明，使用本发明实施例1-5制备的抗衰老护肤品，没有受试者皮肤老化达到严重 程度，而对照组有2例；同时受试者也没有出现红斑、刺痛的不良反应，而对照组有2例受试 者出现红斑，3例受试者出现刺痛;此外，使用本发明实施例1-5制备的抗衰老护肤品均可显 著增加受试者皮肤角质层含水量和油脂含量，其中以实施例1制备的抗衰老护肤品效果较 佳，其增加受试者皮肤角质层含水量达到极显著差异，以上结果表明，本发明实施例1-5制 备的抗衰老护肤品可显著改善皮肤老化，降低不良反应的发生，增加角质层含水量和油脂 含量，并以实施例1的抗衰老护肤品效果最佳，且优于对照组。本发明抗衰老护肤品能有效 的增加皮肤角质层的含水量，补水保湿，并通过增加皮脂，起到润滑皮肤的作用。对比例1和 2分别缺乏植物提取物和表皮干细胞分泌素，其改善皮肤老化的效果明显减弱，不良反应的 发生率明显增加，增加受试者皮肤角质层含水量和油脂含量效果不显著，表明本发明抗衰 老护肤品中的有效成分植物提取物和表皮干细胞分泌素两者具有相互协调，相互促进的作 用，缺乏其一均会导致抗衰老的效果降低。植物提取物中的有效成分具有促进透皮吸收作 用，使抗衰老护肤品的活性成分深入到皮肤真皮层和皮下组织充分发挥修复皮肤，促进皮 肤增生能力的功效;表皮干细胞分泌素含有多种对皮肤细胞活性有影响的生长因子、细胞 因子、活性多肽、微量元素、氨基酸等多种活性物质，有利于促进皮肤新陈代谢，延缓衰老。 海红豆具有疏风清热，燥湿止痒，润肤养颜的功效，并对蛋白水解酶具有较强的抑制作用， 对比例3中的植物提取物缺乏海红豆这一组分，使其抗衰老的效果稍优于对比例1和对比例 2,但与实施例1-5的效果比较明显减弱，表明海红豆中的有效分成分通过抑制蛋白水解酶 的活性延缓表皮干细胞分泌素在细胞内代谢分解，充分发挥表皮干细胞分泌素促进皮肤新 陈代谢，延缓衰老的作用。以上结果表明，本发明抗衰老护肤品组方中各成分搭配合理，相 互增益，对改善皮肤老化具有显著的效果，且不良反应低，安全性高。
[0087]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种含有表皮干细胞分泌素的抗衰老护肤品，其特征在于，所述护肤品由以下重量 百分比计的组分组成:表皮干细胞分泌素0.000001-0.0005%、植物提取物2~8%、角鲨烷1 ~2%40了厶-2他0.10~0.25%、甘油5~10%、聚谷氨酸0.05~1%、沈9物1(350 0.06~ 0.12%、肉豆蔻酸异丙酯2~6%、鲸蜡硬脂醇0.5~2%、聚二甲基硅氧烷1~2%，余量为水。2. 根据权利要求1所述的抗衰老护肤品，其特征在于，所述护肤品由以下重量百分比计 的组分组成：表皮干细胞分泌素0.000125%、植物提取物6%、角鲨烷1%30了4-2此 0.15 %、甘油8 %、聚谷氨酸0.50 %、ei?yl?K350 0.10 %、肉豆蔻酸异丙酯4 %、鲸蜡硬脂醇 1%、聚二甲基硅氧烷2%，余量为水。3. 根据权利要求1或2任一所述的抗衰老护肤品，其特征在于，所述表皮干细胞分泌素 为人的表皮干细胞分泌的多种活性因子的混合物。4. 根据权利要求1或2任一所述的抗衰老护肤品，其特征在于，所述植物提取物由以下 重量百分计的原料制备而得:海红豆16~28%、雪丽花14~30%、刺五加12~28%、冬青皮 14~26%和覆盆子10~22%。5. 根据权利要求4所述的抗衰老护肤品，其特征在于，所述植物提取物由以下重量百分 计的原料制备而得:海红豆22%、雪丽花22%、刺五加20%、冬青皮20%和覆盆子16%。6. 根据权利要求1所述的抗衰老护肤品，其特征在于，所述表皮干细胞分泌素的制备方 法包括以下步骤： (1) 人表皮干细胞的获取 取手术切除或刮取口腔上皮组织，将组织转入含有青霉素、链霉素和硫酸庆大霉素的 D-PBSA(磷酸盐缓冲液）中，干冰或液氮冷冻条件下运回实验室。反复漂洗2-3次，加入胰蛋 白酶37 °C消化30min，将口腔上皮组织剪碎，用70-100um细胞过滤器过滤上皮细胞，收集滤 液。1200r/min条件下离心5min，弃上清，用Defined Keratinocyte-SFM培养基轻柔吹打，得 细胞悬液，利用胶原快速贴附法分离纯化人表皮干细胞； (2) 人表皮干细胞的培养 将步骤（1)得到的人表皮干细胞接种在含有1 〇〇U/ml青霉素和100ug/ml链霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培养基中，37°C、5%C02培养箱孵育12-24h，弃培养基，重新加入新鲜的 含有青霉素和链霉素 Defined Keratinocyte-SFM培养基，培养l-3d，弃培养基，加入 Defined Keratinocyte-SFM培养基继续培养。待人表皮干细胞接近90%融合时，传代培养； (2)表皮干细胞分泌素的制备 将人表皮干细胞扩增1-5代，收集培养上清液，将上清液用0.22μπι的无菌过滤器过滤， 合并每一代的滤液即得表皮干细胞分泌素。7. 根据权利要求1所述的抗衰老护肤品，其特征在于，所述植物提取物的制备方法包括 以下步骤： 分别按比例取各味药材，洗去杂质，干燥后粉碎，过50~60目筛，合并粗粉，加入药材粗 粉总重量8~12倍量体积分数为50~70 %的乙醇，微波提取4~6分钟，微波功率为400~ 500W，提取温度为40~60°C，将提取液过滤，按同样条件重复提取1次，合并提取液，减压浓 缩至60°C下测相对密度为1.05~1.15的浸膏，制得植物提取物。8. -种制备如权利要求1 -7任一所述的抗衰老护肤品的方法，其特征在于，包括以下步 骤： 步骤1:将表皮干细胞分泌素、赋形剂、注射用水混合均匀，进行真空冷冻干燥，得冻干 粉备用； 步骤2:将EDTA-2Na、聚谷氨酸和水混匀，加热至80°C，均质6~lOmin，搅拌至溶解完全， 得物料A; 步骤3:将甘油、角鲨烷、肉豆蔻酸异丙酯、鲸蜡硬脂醇和聚二甲基硅氧烷混匀，加热至 80~90°C，均质10~15min，搅拌至溶解完全，得物料B;向物料A中缓慢加入物料B，搅拌均 匀，开始降温； 步骤4:待温度降至30°C左右时，向乳化锅中加入植物提取物、eiKyl@K350和步骤1制得 的冻干粉，搅拌均匀，对板出料。9. 根据权利要求8所述的抗衰老护肤品的制备方法，其特征在于，步骤1所述的赋形剂 为甘露醇和L-精氨酸以1:1配比制得的混合物。10. 根据权利要求8所述的抗衰老护肤品的制备方法，其特征在于，步骤1的真空冷冻干 燥步骤为：将表皮干细胞分泌素、赋形剂、注射用水混合均匀后置于_70°C冻干机中，冷却 至-50°C以下，预冻6h，抽真空8h，缓慢升温至-20°C，再以5°C/h的速度升温至25°C，保温干 燥2h，即得。
【文档编号】A61Q19/08GK105853341SQ201610316104
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】陈松彬, 易萍, 张爱萍, 倪彦艳, 刘杰森
【申请人】广东科玮生物技术股份有限公司