高密度脂蛋白样肽磷脂支架（“hpps”）纳米颗粒的制作方法

高密度脂蛋白样肽磷脂支架（“hpps”）纳米颗粒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了高密度脂蛋白样肽磷脂支架(“HPPS”)纳米颗粒。本发明提供了一种非天然存在的高密度脂蛋白样肽?磷脂支架(“HPPS”)纳米颗粒。更具体地，本发明提供了一种非天然存在的肽?脂质纳米支架，包括：(a)至少一种磷脂；(b)至少一种不饱和脂质，优选不饱和固醇酯，进一步优选不饱和胆固醇酯，进一步优选胆固醇油酸酯；以及(c)至少一种肽，所述肽包括能够形成至少一个两亲性α?螺旋的氨基酸序列；其中使成分a)、b)和c)结合以形成肽?磷脂纳米支架。本发明还提供了一种包括HPPS纳米颗粒的药物剂型以及制备HPPS纳米颗粒的方法。
【专利说明】高密度脂蛋白样肽磷脂支架（"HPPS"）纳米颗粒
[00011 本申请是申请日为2008年12月12日，申请号为200880126584.X，发明名称为"高密 度脂蛋白样肽磷脂支架（"HPPS"）纳米颗粒"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种基于肽稳定化超小纳米颗粒的药物递送系统，该药物递送系统允 许用于检测和治疗(处理)癌症和其他疾病的活性剂的靶向递送。所述活性剂可以位于纳米 平台的核心或表面，而细胞表面受体配体附着于所述纳米平台的表面。
【背景技术】
[0003] 纳米平台
[0004] 纳米平台是纳米级(纳米尺度)结构，该结构被设计为一般平台以形成不同组的多 功能诊断和治疗装置。这样的纳米级装置通常具有小于l〇〇nm的尺寸，由此大小与其他生物 实体相当。它们小于人类细胞(人类细胞的直径为10,000到20,00011111)和细胞器，并且大小 类似于较大的生物大分子，如酶和受体。血红素(血红蛋白）的直径，例如为大约5nm，而围绕 细胞的脂质双层为大约6nm厚。小于50nm的纳米级装置可以容易地进入大多数细胞，而那些 小于20nm的纳米级装置可以运送出血管（NIH/NCI Cancer Nanotechnology.NZH Publication No 04-5489(2004))。结果，纳米装置可以经常以不改变那些分子的行为和生 物化学性质的方式在细胞表面上和细胞内部与生物分子容易地相互作用。因此，纳米装置 提供了通过其观察和操纵基础生物途径和过程的完整地独特优势。迄今为止报道的大多数 多功能纳米平台由合成的纳米结构制成，如树枝状高分子(树形化合物）（球状，支化聚合 物）（Quintana，A.et al.Journal of the American Chemical Society.2003 125(26): 7860-5)、聚合（Xu, H ·，Aylott，J.W.&Kopelman，R.Analyst.2002 Nov;127(ll): 147卜7， Pan,D. ,Turner, J. L.&ffooley,K. L. Chemical Communications，2400-2401 (2003))和陶瓷 (Kasili,Ρ.Μ.,Journal of the American Chemical Society.2004 126(9):2799-806, Ruoslahti，E· Cancer Cell · 2002;2(2):97-8)纳米颗粒、全氣化碳乳剂(Anderson，S·A. et al.，Magnetic Resonance in Medicine.2000Sep;44(3) :433-9)和交联脂质体（Hood, J.D.et al.,Science.2002；296(5577):2404-7,Li,L.et al., International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2004 15；58(4):1215-27)〇
[0005] 在这些合成纳米平台设计中的一个常见问题是生物相容性问题，其与短期和长期 毒性密切相关。天然纳米结构可以为该生物相容性问题提供一种解决方案。然而，由天然存 在的纳米结构制成的纳米平台是稀少的。
[0006] 对于理想的纳米平台的一些特征如下：1)均一的尺寸分布(<100nm);2)较大的有 效载荷;3)对于高结合亲和力的多效价;4)经由模块性和多功能性的平台技术;5)稳定和长 期的循环时间；以及6)生物相容的、生物可降解的和无毒的。虽然一些现有的合成纳米平台 符合这些标准中的一些，但是这些纳米平台设计中的一个常见问题是生物相容性问题，其 与短期和长期毒性密切相关。天然纳米结构可以为生物相容性问题提供一种解决方案。然 而，由天然存在的纳米结构制成的纳米平台是少见的。在一个实例中，来自5工豆花叶病毒和 兽棚病毒的空RNA病毒胶囊用作潜在的纳米装置(Raja K.S.et al.，Biomacromolecules 2003;4(3):472-6)。前提是装配入功能性病毒胶囊的60个拷贝的外壳蛋白提供了宽范围的 化学功能性，其可以用于将归巢(寻革E，homing)分子-如单克隆抗体或癌细胞-特异性受体 拮抗剂和报道分子-如磁共振成像(MRI)对比剂(造影剂)附着至胶囊表面，并且用于将治疗 剂加载到胶囊内。不幸的是，即使人体对植物来源的病毒具有相当的容忍性;与这些纳米装 置相关的免疫结果还是不期望的。
[0007] 在另一实例中，脂蛋白纳米平台用于活性剂的靶向递送(PCT申请公开号W0 2006/ 073419(【公开日】：2006年7月13日））。
[0008] 靶向递送
[0009] 虽然特定病理的结果在整个受折磨的人的身体中经常是明显的，但是通常，潜在 的病理学可以仅影响单一器官或组织。然而，少见的是，药物或其它治疗将仅靶向患病的器 官或组织。更常见地，治疗导致不期望的副作用，例如，由于遍及患者身体的广泛的毒性作 用。期望的是选择性靶向器官或组织，例如，用于与靶器官或组织相关的疾病的治疗。还期 望的是选择性靶向身体内相对正常组织的癌组织。
[0010] 大多数治疗物质通过循环被递送至靶器官或组织。衬在血管的内表面的内皮是在 靶器官或组织中循环治疗物质所遇到的第一细胞类型。这些细胞提供了用于将治疗选择性 引导至器官或组织的靶标。
[0011] 内皮在不同组织中可以具有不同的形态和生物化学标记物。淋巴系统的血管，例 如，表达各种粘附蛋白，其用于指导淋巴细胞归巢。例如，存在于淋巴结中的内皮细胞表达 作为用于L-选择蛋白的配体的细胞表面标记物，而集合淋巴小结小静脉中的内皮细胞表达 用于 〇4扮整联蛋白的配体。这些配体涉及特定淋巴细胞归巢到它们各自的淋巴器官。因此， 将药物连接到L-选择蛋白或连接到α 4β7整联蛋白可以提供用于将所述药物分别靶向到患病 的淋巴结或集合淋巴小结的方式，只要这些分子不结合到在显著数量的其他器官或组织中 存在的类似配体。淋巴细胞循环的一些观察表明存在器官和组织特异性内皮标记物。类似 地，特定类型的肿瘤细胞归巢或转移到特定器官或组织进一步表明存在器官和组织特异性 标记物。
[0012] 需要靶向递送至特定组织，包括癌组织，以消除与非特异性递送相关的不期望的 副作用。
[0013] 认识到对于特异性地靶向期望的组织的递送载体的迫切需求，本申请的发明人开 发了一种基于独特的肽稳定化超小纳米颗粒的药物递送系统，其多功能性使其可用于各种 应用。

【发明内容】

[0014] 根据本发明的一个方面，提供了一种非天然存在的肽-脂质纳米支架，其包括至少 一种磷脂、至少一种不饱和脂质（优选不饱和固醇酯、进一步优选不饱和胆固醇酯、进一步 优选胆固醇油酸酯)和至少一种肽，所述肽包括能够形成至少一个两亲性螺旋的氨基酸 序列；其中使前述成分关联以形成肽-磷脂纳米支架。在特别的实施方式中，所述肽选自由 类别A、H、L和Μ两亲性α-螺旋、其片段、以及包括类别A、H、L和Μ两亲性α-螺旋的反向肽序列 的肽、或其片段组成的组。
[0015] 优选地，所述肽-脂质纳米支架进一步包括至少一种归巢分子。在一个方面，所述 归巢分子可以共价连接至所述至少一种肽(优选地在氨基酸处，特别是赖氨酸，在两亲性α_ 螺旋的亲水面与疏水面之间的过渡处或附近)和所述至少一种脂质之一。在另一方面，所 述肽-脂质纳米支架包括至少一种活性剂。
[0016] 在一个方面，所述至少一种归巢分子为至少一种活性细胞表面受体配体。
[0017]根据另外的方面，提供了一种包括本文描述的非天然存在的肽-脂质的药物剂型 (配方）。
[0018] 根据另外的方面，提供了一种制备本文描述的非天然存在的肽-脂质纳米支架的 方法，包括在适合于形成所述肽-脂质纳米支架的条件下合并(组合，结合)其成分。
[0019] 根据另外的方面，提供了一种非天然存在的肽-脂质纳米支架，包括至少一种磷 月旨、至少一种不饱和固醇酯（优选不饱和胆固醇酯、进一步优选胆固醇油酸酯）、至少一种 肽、至少一种归巢分子和至少一种包括双链RNA的活性剂;其中所述活性细胞表面受体配体 共价连接至所述至少一种肽，并且使前述成分关联以形成肽-磷脂纳米支架。在一个方面， 所述双链RNA为siRNA。
【附图说明】
[0020] 图1本发明的基于肽-稳定化超小纳米颗粒的药物递送系统的实施方式的示意图。
[0021] 图2用于并入HPPS纳米颗粒中以用于诊断和/或治疗应用的化合物。
[0022] 图3用于制备EGFp-(DiR-BOA)-HPPS(类型1 EGFR-靶向的HPPS)的合成方案。
[0023] 图4用于制备(DiR-BOA)HPPS(类型2 EGFR-靶向的HPPS)的合成方案。
[0024] 图5未靶向的DiR-BOA加载的HPPS的FPLC、DLS和CD。
[0025] 图6 EGFp(DIR-BOA)-HPPS的FPLC分布和TEM。
[0026] 图7 DiR-BOA加载对HPPS大小的影响。A:制剂#1和#2的FPLC分布;B:从FPLC收集的 部分。C:HPPS大小与货物有效载荷之间的关联(R = 0.91)。
[0027]图 8 (a) FPLC 分布和(b)与 4F 和-4F 形成的（D iR-BOA) HPPS的 TEM。
[0028] 图9 EGFp(DiR-BOA)-HPPS的共聚焦成像研究。
[0029] 图10通过流式细胞术的EGFp (D iR-BOA) -HPPS的时间-依赖性摄取。
[0030]图 11 EGFp(DiR-B0A)HPPS 的抑制研究。
[0031]图 12 EGFp(DiR-B0A)-HPPS的体内成像研究。
[0032] 图13通过流式细胞术的EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS在A549与H520细胞中的时间依 赖性摄取。
[0033] 图14在具有不同水平的EGFR表达的细胞系中EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS的时间-依 赖性摄取的流式细胞术研究。
[0034]图 15 通过 EGFp 的 EGFp(DiR-B0A)HPPS 和 EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS 的摄取抑制的流 式细胞术研究。
[0035] 图16通过MTT和流式细胞术研究的EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS的初步毒性研究。a) 通过MTT分析研究的细胞存活能力显示在甚至6倍的HPPS对照处(在所有先前的体外研究中 使用的标准剂量)没有毒性;b)通过流式细胞术研究的细胞存活能力显示在6倍的HPPS对照 处没有毒性;C)通过流式细胞术研究的HPPS细胞摄取显示在2倍的HPPS对照处(标准剂量） 摄取饱和。
[0036]图17具有EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS(i.v.)的MT1肿瘤异种移植物的体内成像。箭 头指示肿瘤。
[0037]图18在具有人类肺原发肿瘤异种移植物的小鼠中EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS的体 内成像，表明EGFR-靶向特异性。
[0038]图19利用KB (叶酸受体阳性)和HT1080 (叶酸受体阴性)癌细胞中的叶酸受体-靶向 的HPPS的共聚焦成像研究。注意:绿色来自DiR-BOA荧光，而蓝色来自DAPI核染色）。
[0039]图20多成分荧光标记。HPPS颗粒的每种成分(肽、磷脂、核心货物)可以用荧光标签 标记用于详细的颗粒表征和颗粒降解的评估。
[0040] 图21(&)1(11六(11131?-81)和1^1^7细胞的31?-81受体含量的蛋白质印迹分析。
[0041 ] (b)(DiR-B0A)HPPS对于SR-B1受体的特异性。共聚焦图像显示（DiR-BOA)HPPS在 SR-B1阳性细胞（ldlA(mSR-Bl))中的强摄取，但是在SR-B1阴性细胞(LDLA7)中不存在。此 外，过量的HDL有效地抑制ldlA(mSR-Bl)细胞中的（DiR-BOA)HPPS摄取，但是对于LDLA7中 的摄取没有影响。
[0042]图 22 利用 FITC-脂质（DiR-BOA)HPPS 和 FITC-(-4F)(DiR-B0A)HPPS 和 ldlA(mSR-Bl) 细胞的共聚焦成像研究。
[0043]图 23 利用 FITC-(-4F)(DiR-B0A)HPPS 和 ldlA(mSR-Bl)细胞的共聚焦成像研究。 [0044] 图24流式细胞术研究用于评估SR-ΒΓ和SR-ΒΓ细胞系中（DiR-BOA)HPPS的摄取。 [0045]图25流式细胞术研究用于评估SR-ΒΓ细胞系中（DiR-BOA)HPPS浓度-依赖性的摄 取。
[0046]图26流式细胞术研究用于评估SR-ΒΓ细胞系中（DiR-BOA)HPPS摄取的HDL浓度-依 赖性的抑制。
[0047]图27流式细胞术研究用于评估SR-ΒΓ和SR-ΒΓ细胞系中（DiR-BOA)HPPS的差异摄 取和SR-ΒΓ细胞系中（DiR-BOA)HPPS摄取被HDL的抑制。
[0048]图 28 流式细胞术用于评估（-4F)(DiR-B0A)HPPS 与（4F)(DiR-B0A)HPPS 被 ldlA (mSR-Bl)细胞的摄取。
[0049]图29在具有人类KB(SR-B1 + )肿瘤异种移植物的裸鼠上进行体内成像以研究-4F (DiR-BOA)HPPS 的定位。
[0050]图 30(a)进行共聚焦研究以评估（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS 和（-4F)(DiR-B0A)HPPS 在A549和H520细胞中的差异摄取。
[00511图30(b)A549和H520细胞的表面受体分布的蛋白质印迹分析。
[0052]图 31 使用流式细胞术来评估(DiR-BOA)HPPS 和 EGF(DiR-B0A)HPPS(1.0yM)被 H520、 A549和EGFR-GFP-A549细胞的摄取。
[0053]图32在转染有EGFR-绿色荧光蛋白（GFP)的融合基因的LDLA7细胞中进行EGF-HPPS 研究。该实验去除SR-B1可能对EGF-HPPS的细胞摄取具有的任何贡献。在用（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS孵育3小时后，EGFR-GFP-LDLA7细胞呈现出细胞溶质内的DiR-BOA的强信号，表明 EGF-HPPS通过EGFR的急切摄取。对于EGFR的GFP信号在外质膜上被可视化。
[0054]图 33 进行共聚焦研究以评估 HDL 对（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS 在 EGFR-GFP-LDLA7 细 胞中的摄取的作用。
[0055] 图34用EGF(DiR-BOA)HPPS孵育的EGFR-GFP-A549和H520细胞的共聚焦成像。
[0056] 图35进行共聚焦研究以评估HDL对(_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS在A549和H520细胞中 的摄取的作用。
[0057]图36在具有双肿瘤(A549和H520)的裸鼠上进行体内成像以确定（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的靶向能力。
[0058] 图37(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的体内确认。体内成像(A)和生物分布(B)显示HPPS 的改善的递送特异性和效能。C)HPPS匹配HDL的长循环时间（tl/2~HhhD^PPS荧光信号 (DiRBOA)在肿瘤组织中的积聚匹配肿瘤细胞荧光(转染有红色荧光蛋白）。
[0059] 图38 KB肿瘤和H520肿瘤中（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS的细胞摄取。白色条代表每mg 组织的荧光单位，而黑色条代表每百万个细胞的荧光单位。数据反映了来自两个具有肿瘤 的小鼠的平均值。
【具体实施方式】
[0060] 图1示出了本发明的实施方式。具体地，图1示出了基于肽-稳定化超小纳米颗粒的 药物递送系统，称为"HPPS"（高密度脂蛋白样肽-磷脂支架），其允许用于检测和治疗癌症和 其它疾病的活性剂的靶向递送。所述HPPS纳米颗粒包括三种成分:1)特异性两亲大小-对照 肽（scPep)和磷脂，其形成超小纳米载体(5至25nm)，2)疾病-特异性革巴向配体，其可以被直 接结合至纳米载体上的scPep、结合至纳米载体上的表面磷脂、或者疾病-特异性祀向配体 如蛋白质或其片段，其可以被并入所述纳米载体中而无需结合至scPep或磷脂（图1中未示 出），以及3)诊断或治疗剂，加载在所述纳米载体核心内或并入所述纳米载体内使得它们被 显示在纳米载体的表面上。为了形成优选的球状纳米颗粒，不饱和固醇酯也被合并在其中。 多种革G向可以通过将一些革E1向配体，如肿瘤-归巢分子(例如，叶酸），结合至暴露在肽的表 面上的可结合的氨基酸如赖氨酸残基来实现。HPPS纳米颗粒因此靶向癌症和/或特定组织 的期望的细胞表面标记物处，即，在各种类型的癌细胞或组织中选择性过度表达的分子。 在特定的实施方式中，HPPS纳米颗粒提供了活性剂，包括但不限于，诊断剂、成像剂（显像 剂，显影剂)和/或治疗剂的靶向递送。
[0061] 这样的试剂包括，但不限于，磁共振成像(MRI)剂、近红外荧光(NIRF)探针和光动 力学治疗(PDT)剂。
[0062]在特定的实施方式中，HPPS脂质核心内的胆固醇酯被亲脂性药剂代替。在另外的 实施方式中，活性剂连接至本发明的HPPS纳米颗粒的表面。
[0063]因此，MRI /NIRF探针在靶细胞中的积聚提供了一种用于MRI /NIRF可检测信号的扩 大的容易的机制并提供了结合MRI (高分辨率/解剖)和NIRF(高敏感性)的强度的机会，而经 由这些途径将PDT剂选择性地递送至肿瘤也提供了检测与治疗之间的容易的过渡。最后， HPPS纳米颗粒不期待是免疫原性的，并应当避免被网状内皮系统识别，因此HPPS平台提供 了一种与大多数合成纳米装置相关的常见问题，即生物相容性和毒性的解决方案。
[0064]术语"纳米颗粒"、"纳米平台"和"纳米支架"在本文中可互换地使用。
[0065]本发明提供了包括脂质如磷脂酰胆碱(如DMPC(优选1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）、P〇PC(l-棕榈酰-1-油酰基-磷脂酰胆碱)和EYPC(卵黄磷脂酰胆碱））、溶血磷脂 酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、和磷脂酰肌醇的HPPS纳米颗粒。
[0066]天然存在的脂蛋白颗粒每个具有特有的脱辅基蛋白、以及一定百分比的蛋白、三 酰甘油、磷脂和胆固醇。VLDL颗粒可以包含约10%蛋白、约60%三酰甘油、约18%磷脂和约 15 %胆固醇。LDL颗粒可以包含约25 %蛋白、约10 %三酰甘油、约22%磷脂和约45 %胆固醇。 HDL颗粒可以包含约50%蛋白、约3%三酰甘油、约30%磷脂和约18%胆固醇。同样地，本发 明的HPPS纳米颗粒包含不同百分比的上述组分。HPPS纳米颗粒还可以包含一个或多个三酰 甘油。HPPS纳米颗粒可以另外包含固醇、固醇酯、或其组合。在另外的实施方式中，固醇或固 醇酯选自由胆固醇、胆固醇油酸酯和不饱和胆固醇-酯组成的组。
[0067]在特定的实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含靶向在癌细胞中过度表达的受 体的细胞表面受体配体。在另外的实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含作为对于心血 管斑块中过度表达的受体的配体的细胞表面受体配体。
[0068]在另外的实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含靶向特定组织上的受体的细胞 表面受体配体。
[0069]在一些实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含在HPPS纳米颗粒的核心内的亲脂 性化合物。
[0070] 在一些实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含(部分)位于HPPS纳米颗粒的表面 上的活性剂，所述活性剂是包含亲脂性和亲水性成分的分子。
[0071] 在特定的实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含作为诊断剂、成像剂或治疗剂 的活性剂。优选地，所述成像或诊断剂为对比剂、放射性标记和/或荧光标记。
[0072]在一些实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含抗癌剂。这样的活性剂可以为化 疗剂、光动力学治疗剂、硼中子俘获治疗剂或用于放射治疗的放射性核。在实施方式中，所 述抗癌剂选自由烷基化剂(烷化剂）、蒽环类药、抗生素、芳香酶抑制剂、双磷酸盐类、环加氧 酶抑制剂、雌激素受体调节剂、叶酸拮抗剂、无机砷酸盐、微管抑制剂、修饰剂、亚硝基脲 (nitrosureas)、核苷类似物、破骨细胞抑制剂、含铂化合物、类维生素 A、拓扑异构酶1抑制 剂、激酶抑制剂(诸如，但不限于酪氨酸激酶抑制剂）、抗血管生成剂、表皮生长因子抑制剂 和组蛋白脱乙酰基酶(脱乙酰基转移酶)抑制剂组成的组。
[0073]在另外的实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含选自由抗青光眼药、抗凝剂、消 炎药、平喘药、抗生素、抗真菌药或抗病毒药组成的组中的治疗剂。
[0074]在另外的实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含选自以下的组中的治疗剂，所 述组包括，但不限于:止痛剂、麻醉剂、抗心绞痛剂、抗风湿剂、抗心律失常剂、平喘剂、抗菌 剂、抗-BPH剂、抗癌剂、抗胆碱剂、抗凝血剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻剂、抗癫 痫剂、抗真菌剂、抗痛风剂、抗驱虫剂、抗组胺剂、抗高血压剂、消炎剂、抗疟剂、抗偏头痛剂、 抗毒蕈碱剂、止恶心剂、抗肿瘤剂、抗肥胖剂、抗骨质疏松剂、抗帕金森病剂、抗原虫剂、止痒 剂、抗精神病剂、退热剂、止痉挛剂、抗甲状腺剂、抗结核剂、止咳剂、抗溃疡剂、抗尿失禁剂、 抗病毒剂、抗焦虑剂、食欲抑制剂、注意力缺陷障碍(ADD)和注意力缺陷过动症(ADHD)药、钙 通道阻滞剂、心变力剂、β-阻滞剂、细胞粘附抑制剂、中枢神经系统兴奋剂、认知增强剂、皮 质类固醇、C0X-2抑制剂、细胞因子受体活性调节剂、解充血剂、利尿剂、勃起功能异常改善 剂、必需脂肪酸、肠胃剂、遗传物质、组胺受体诘抗剂、hormonolytics、安眠药、降血糖剂、免 疫抑制剂、keratolyses、白三稀抑制剂、脂质-调节剂、大环内酯类、有丝分裂抑制剂、肌肉 松弛剂、麻醉药拮抗剂、神经安定剂、尼古丁、硝酸盐类、非必需脂肪酸、非固醇类平喘剂、营 养油、类鸦片镇痛药、副交感神经阻滞剂、镇静剂、性激素、兴奋剂、类交感神经剂、镇定剂、 血管扩张剂、维生素、以及它们的组合。
[0075] 本发明还提供了包括本发明的HPPS纳米颗粒的药物剂型。
[0076] 本发明进一步提供了制备HPPS纳米颗粒的方法。
[0077] 脂蛋白颗粒
[0078] 脂蛋白颗粒为一类天然存在的纳米结构。胆固醇和三酰甘油在体液中以脂蛋白颗 粒的形式被转运。每个颗粒包括由更极性的脂质和蛋白的壳包围的疏水性脂质的核心。这 些大分子的积聚体的蛋白成分具有两个作用：它们溶解疏水性脂质并且包含细胞-靶向信 号。脂蛋白颗粒根据增加的密度被分为：乳糜微粒、乳糜微粒残余物、极低密度脂蛋白 (VLDL)、中间-密度脂蛋白（IDL)、低-密度脂蛋白（LDL)、和高密度脂蛋白（HDL)(参见表1)。 因此，它们中的每个的大小不同，并且除了乳糜微粒和乳糜微粒残余物，它们中的大多数具 有纳米结构（〈l〇〇nm) 〇
[0079] 表1.脂蛋白的大小和类别
[0080]
[0081]低密度脂蛋白（LDL)颗粒
[0082] LDL是人血浆中胆固醇的主要载体，并经由LDLR(低密度脂蛋白受体)通过胞吞作 用将外源性胆固醇递送到细胞。LDL颗粒是通常具有约22nm直径的天然存在的纳米结构。它 包含一些1500酯化胆固醇分子和甘油三酯的脂质核心。磷脂和未酯化的胆固醇的外壳包 围该高度疏水的核心。所述外壳还包含被L D L R识别的单一拷贝的a ρ ο B -10 0 (分子量 550kDa)。
[0083]高密度脂蛋白（HDL)颗粒
[0084] 血浆HDL是作为大约一半脂质和一半蛋白质的较小的、球状、致密的脂蛋白复合 体。脂质成分由磷脂、游离胆固醇、胆固醇酯、和甘油三酯组成。蛋白质成分包括apo A-Ι(分 子量，28，000道尔顿)和apo A-Π (分子量，17，000道尔顿）。其它较小但是重要的蛋白质为 apo E和apo C，包括apo C_I、apo C-II、和apo C-III。
[0085] HDL颗粒是异质的。它可以被分为较大、较小致密的HDL2或较小、更致密的HDL3。通 常，大多数血浆HDL在HDL3中被发现。HDL每个颗粒由4个载脂蛋白构成。HDL可以由apo A-I 和apo A-II构成或仅由apo A-I构成。HDL2主要仅是apo A-I，而HDL3由apo A-I和apo A-II 制成。比HDL2更少致密的HDL颗粒富含apo E。
[0086] HPPS纳米颗粒
[0087]因此，本发明提供了可以由多种不同的肽支架制成的具有不同尺寸的一系列纳米 平台。下面描述适于生产HPPS纳米颗粒的肽成分。
[0088] HPPS纳米颗粒可以靶向多种受体。此外，在一些实施方式中，HPPS疏水核心和磷脂 单层均可以被修饰以携带诊断和/或治疗剂的较大的有效载荷，使得它们成为特别多功能 的纳米平台。在一些实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒包含一个或多个归巢分子。所述 HPPS纳米颗粒还可以携带一种或多种活性剂的有效载荷。HPPS纳米颗粒还可以包含细胞死 亡传感器，使得HPPS纳米颗粒可以同时进行诊断、处理以及治疗反应监测功能。
[0089] 本发明提供了基于具有如下描述的特定性能的肽的非天然存在的纳米平台。术语 "非天然存在的"是指不是固有地存在于人体内的纳米平台。这样的非天然存在的HPPS纳米 颗粒可以包含一种或多种天然存在的脂蛋白颗粒的成分。例如，存在于天然存在的LDL和 HDL颗粒的核心中的胆固醇酯可以被活性剂替换。同样地，如在天然存在的脂蛋白颗粒中发 现的核心可以保持完整，但是活性剂被连接于HPPS纳米颗粒的表面。
[0090] 在一些实施方式中，对于HPPS纳米颗粒用于靶向递送存在几个不同的优点。在一 些实施方式中，本发明的HPPS纳米颗粒的一个优点是它们被预期与宿主免疫系统完全相 容，并且它们也是生物可降解的。它们还可以提供用于大量诊断或治疗剂的积聚的回收系 统，所述诊断或治疗剂用于利用受体介导的胞吞作用的靶向细胞。本发明的HPPS纳米颗粒 不被预期是免疫原性的，并且应当逃避被网状内皮系统(RES)识别。
[0091] 其它优点可以包括：1)本发明的HPPS纳米颗粒与生理载体具有的相似之处在于它 们均具有理想的尺寸范围，该尺寸范围足够大以避免肾清除率，但足够小以减少网状内皮 系统(RES)摄取，因此药物/探针的血清半衰期可以通过并入这些纳米颗粒中被延长;2)药 物/探针停留在脂质核心空间提供了保护以免受血清酶和水;3)HPPS纳米颗粒的阵列的可 利用性提供了具有5nm到80nm范围的大小的一系列纳米平台。
[0092]优选地，本发明的非天然存在的HPPS纳米颗粒的直径是（以增加的优选性）：5nm到 50nm，5nm至丨J40nm; 5nm至丨J30nm，5nm至丨J25nm; 5nm至丨J20nm，以及 1 Onm至丨J15nm 〇 [0093] HPPS纳米颗粒的起始物质还包含在例如所述颗粒的外层上的至少一种脂质。可用 在本发明的HPPS纳米颗粒中的脂质包括，但不限于，两亲性脂质。可用在本发明中的磷脂包 括，但不限于，磷脂酰胆碱(优选DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、P0PC(1-棕榈 酰-1-油酰基-磷脂酰胆碱)和EYPC(卵黄磷脂酰胆碱））、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷 脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇以及它们的组合。
[0094]支架肽
[0095]用于形成所述HPPS纳米颗粒的合适的支架肽包括能够形成至少一个两亲性a-螺 旋的氨基酸序列。
[0096]在优选的实施方式中，所述两亲性a-螺旋或肽的长度（以增加的优选性)在6-30个 氨基酸、8-28个氨基酸、10-24个氨基酸、11-22个氨基酸、4-21个氨基酸、16-20个氨基酸和 18个氨基酸的范围内。
[0097]用于检测和表征具有假定的两亲性螺旋结构的蛋白结构域的方法陈述在 Segrest,J.P.et al.in PROTEINS:Structure,Function,and Genetics(1990)8:103-117 中，将其内容以引用方式并入本文。Segrest等人已经鉴定了七种不同类别的两亲性螺旋并 鉴定了与每个类别相关的肽/蛋白质。在七种不同的类别中，存在四个脂质-相关两亲性螺 旋类别(A、H、L和Μ)。其中，类别A，指定的载脂蛋白类别，具有用于形成基于磷脂的颗粒的最 佳性能。
[0098] 合适的支架肽可以选自由类别A、H、L和Μα-螺旋或其片段组成的组。合适的支架肽 还可以包括类别A、H、L和Μ两亲性α-螺旋的反向肽序列或其片段，因为形成两亲性α-螺旋的 性能通过所述肽序列内氨基酸残基的相对位置确定。
[0099] 在一个实施方式中，所述支架肽具有包括脱辅基蛋白的连续氨基酸的氨基酸序 列，优先选自由apoB-100、apoB-48、apoC、apoE和apoA组成的组。
[0100] 本发明中所用的"氨基酸"，以及如在说明书和权利要求书中所用的术语，包括已 知天然存在的蛋白质氨基酸，其通过它们常见的的三字母缩写和单字母缩写被提及。通常 参见Synthetic Peptides:A User's Guide,G A Grant,editor,ff.H.Freeman&Co. ,New York, 1992,将其教导以引用方式并入本文，包括第11页到第24页陈述的正文和表。如上所 述，术语"氨基酸"还包括天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和修饰物、非-蛋白质氨基 酸、翻译后修饰的氨基酸、酶促合成的氨基酸、衍生的氨基酸、设计为模拟氨基酸的构建物 或结构等。修饰的和不常见的氨基酸通常描述在Synthetic Peptides:A User's Guide, cited above；Hruby V J,Al-〇beidi F and Kazmierski ff:Biochem J 268:249-262, 1990;and Toniolo C:Int J Peptide Protein Res 35:287-300,1990中；将其全部教导以 引用方式并入本文。
[0101] "α螺旋"在本文中用来指蛋白质的二级结构中常见的基序。α_螺旋是卷曲的构象， 类似于弹簧，其中每个骨架Ν-Η基团向早期的氨基酸四个残基的骨架C = 0基团贡献氢键。典 型地，由天然存在的氨基酸形成的α-螺旋将是右旋的，但是左旋构象也是已知的。
[0102] "两亲的"是描述具有亲水性和疏水性性能的化合物的术语。两亲性α-螺旋通常是 生物活性肽和蛋白质中通常遇到的二级结构基序，并指的是具有沿着螺旋的长轴定向的相 对的极性和非极性面的α_螺旋。
[0103] 具有许多apoA-ι的脂质结合性能的较小的两亲性螺旋肽的实例包括2F，具有两个 苯丙氨酸氨基酸残基的18-氨基酸肽序列（D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F) (Ananthaaramaiah et al JBC. 1985;260:10248-10255)。早期研究表明这个序列显不出强 脂质结合并且能够形成稳定的盘状磷脂颗粒。随后的研究继续表明两个另外的F残基的并 入(总共4F;D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F)，进一步提高所述肽的脂质结合性能 (Ananthaaramaiah et al.Arterioscler Thromb Vase Biol·2005;25:1325-1331)〇
[0104] 归巢分子
[0105] 如本文所用的，术语"归巢"或"选择性归巢"是指特定分子在给予受试者后相对特 异地结合至特定器官或组织中存在的分子。通常，选择性归巢的特征部分在于，检测比对照 器官或组织至少两倍更大的所述分子与器官或组织的选择性结合。在一些实施方式中，选 择性结合比对照器官或组织至少三倍或四倍更大。
[0106] 在肿瘤归巢分子的情况中，这样的分子结合到在特定的癌组织中选择性过度表达 的受体。过度表达是指在肿瘤组织中的表达比正常组织多至少一倍和一倍半。在实施方式 中，与非肿瘤相比，肿瘤中的表达多至少五倍。
[0107] 在本发明的实施方式中，归巢分子连接于靶向特定组织和肿瘤的本发明的HPPS纳 米颗粒的肽。"归巢分子"指的是可以促进本发明的组合物体外或体内靶向组织和/或受体 的任何材料或物质。所述靶向部分可以是合成的、半合成的、或天然存在的。所述靶向部分 可以为蛋白质、肽、寡核苷酸、或其它有机分子。在一个实施方式中，所述靶向部分可以为到 达细胞表面受体的内源性配体(或其部分）。所述靶向部分可以为抗体(该术语包括保持结 合区或高变区的抗体片段和单链抗体）。可以用作靶向部分的材料或物质包括，但不限于， 表2中列出的那些物质：
[0108] 表2
[0109]
[0110]
[0111] 肿瘤归巢分子
[0112] 肿瘤归巢分子选择性地结合至肿瘤组织与相同类型的正常组织。这样的分子通常 是在肿瘤组织中过度表达的细胞表面受体的配体。在肿瘤组织与正常组织中过度表达的细 胞表面受体包括，但不限于，在未分化甲状腺癌、结肠直肠癌、头和颈癌、卵巢癌、肾细胞癌、 以及乳腺和肺肿瘤中过度表达的表皮生长因子受体(EGFR);在乳头状甲状腺癌中过度表达 的转移抑素受体;在乳腺癌的重要亚类中过度表达的ErbB家族受体酪氨酸激酶;在乳腺癌 中过度表达的人类表皮生长因子受体_2(Her2/neu);在肉瘤样肾癌中过度表达的酪氨酸激 酶受体(c-Kit);在食道腺癌中过度表达的HGF受体c-Met;在乳腺癌中过度表达的CXCR4和 CCR7，；在前列腺癌中过度表达的内皮素（内皮缩血管肽)-A受体;在大多数结肠直肠癌肿瘤 中过度表达的过氧化物酶体增生物活化的受体δ(ΡΡΑΙ?-δ);在卵巢癌中过度表达的TOGFR A;在各种肺癌中过度表达的BAG-I;在胰腺癌中过度表达的可溶的II型TGF0受体;叶酸；以 及整联蛋白（如ανβ 3)。
[0113] 叶酸受体是具有对于维生素叶酸高亲和性(Kd约10-9Μ)的糖基磷脂酰肌醇-锚定的 糖蛋白（Leamon，CP.et al.，Biochemical Journal.l993May l;291(Pt.3):855_60)。叶酸 受体已经被鉴定为肿瘤-标记物，其在上皮恶性肿瘤(如卵巢癌、结肠直肠癌和乳腺癌)上相 对于正常组织以提高的水平表达（Wang, S.et al·，Journal of Controlled Release. 1998Apr 30;53( 1-3) :39-48)。已经表明当叶酸经由其g-羧基部分共价连接至单 一分子或分子的集合时，其对于细胞表面受体的亲和力仍然基本不变。在胞吞作用和囊泡 转运后，许多物质被释放到细胞胞质中。未连接的叶酸受体可以随后再循环到细胞表面;因 此，每个叶酸受体可以将许多叶酸结合物带入细胞中。
[0114] 器官或组织归巢分子
[0115] 本发明提供了选择性归巢到多种器官或组织的分子的应用，所述器官或组织包括 肺、皮肤、血液、胰腺、视网膜、前列腺、卵巢、淋巴结、肾上腺、肝脏、乳腺、消化系统或肾脏组 织。例如，本发明提供了使用肺归巢肽，如包含GFE基序的那些，包括肽CGFECVRQCPERC和 CGFELETC;皮肤归巢肽如CVALCREACGEGC;胰腺归巢肽如肽SWCEPGWCR;以及视网膜归巢肽如 包含RDV基序的那些，包括肽CSCFRDVCC和CRDVVSVIC。
[0116] 本发明还提供了通过给予包括归巢到具有或怀疑有病状的受试者的选择的器官 或组织的分子的HPPS，利用本发明的器官归巢分子来诊断或治疗肺、皮肤、胰腺、视网膜、前 列腺、卵巢、淋巴结、肾上腺、肝脏或肠的病状的方法。例如，肺、皮肤、胰腺、视网膜、前列腺、 卵巢、淋巴结、肾上腺、肝脏或肠的病状可以通过给予具有所述病状的受试者包含连接到治 疗剂的适当的器官归巢分子的HPPS纳米颗粒。类似地，通过给予受试者包含连接到可检测 的药剂的适当的器官归巢分子的HPPS纳米颗粒鉴定选择的器官或组织或诊断选择的器官 中的病状的方法。
[0117] 本发明的HPPS纳米颗粒可以与器官和组织归巢分子一起使用以使部分靶向到选 择的器官或组织。本发明中使用的归巢分子包括归巢到各种正常器官或组织的肽，所述器 官包括肺、皮肤、胰腺、视网膜、前列腺、卵巢、淋巴结、肾上腺、肝脏或肠，以及归巢到具有 肿瘤的器官，包括具有肺肿瘤的肺和具有胰腺肿瘤的胰腺。例如，本发明包括使用肺归巢 肽，包括肽CGFECVRQCPERC和CGFELETC，其每一个包含三肽GFE基序，以及肽GIGEVEVC。本发 明还包括使用皮肤归巢肽如肽CVALCREACGEGC;胰腺归巢肽，如肽SWCEPGWCR和视网膜归巢 肽如肽CSCFRDVCC和CRDVVSVI C，其每一个包含三肽RDV基序。也提供了归巢到前列腺、卵巢、 淋巴结、肾上腺、肝脏和肠的肽的实例(参见下面的表3)。在一个实施方式中，归巢分子可以 为EGFR-特异性肽，如全长EGF蛋白（EGF)或其片段。
[0118] 为了方便，术语"肽"在本文中概括地用来指代肽、多肽、蛋白质和蛋白质的片段， 并且包括，例如，单链肽。本发明中使用的其它分子包括类肽、肽模拟物等。关于本发明的器 官或组织归巢肽，肽模拟物，其包含化学修饰的肽、包含非天然存在的氨基酸的肽样分子、 类肽等，具有肽模拟物来源地器官归巢肽的结合活性（参见，例如，"Burger ' s Medicinal Chemistry and Drug Discovery"5th ed. ,vols. lto 3(ed.M.E.Wolff；ffiley Interscience 1995)，将其通过引用方式并入本文中）。肽模拟物相对于肽提供了多个优 点，包括肽模拟物在给予受试者时，例如在通过消化道期间是稳定的，因此，可用于口服给 药。
[0119] 用于鉴定肽模拟物的方法在本领域中是熟知的，并且包括，例如，筛查包含潜在的 肽模拟物的文库的数据库。例如，Cambridge Structural Database包含多于300，000个具 有已知的晶体结构的化合物的收集物(Allen et al.，Acta Crystallogr.Section B，35: 2331 (1979))。该结构存放处在新的晶体结构被测定时持续更新，并且可以筛查具有合适的 形状的化合物，例如，与器官或组织归巢分子相同形状的化合物，以及潜在的几何和化学互 补于由器官或组织归巢分子束缚的靶分子的化合物。当没有归巢肽或靶分子(其结合器官 或组织归巢分子）的晶体结构可获得时，可以利用，例如程序⑶NCORD(Rusinko et al.， J · Chem. Inf · Comput · Sci · 29 : 251 (1989))产生结构。另一数据库，Avai lable Chemicals Directory(Molecular Design Limited, Informations Systems；San Leandro Calif.), 包含约100,000个商业上可获得的化合物，并且还可以被检索以鉴定器官或组织归巢分子 的潜在肽模拟物。
[0120] 分子的选择性归巢到选择的器官或组织可以是由于通过器官或组织中的细胞上 存在的特定细胞靶分子的分子如细胞表面蛋白的选择性识别。归巢的选择性取决于在仅仅 一种或几种不同的细胞类型上表达的特定靶分子，使得所述分子归巢到仅仅一个或几个器 官或组织。在这方面，大多数不同的细胞类型，特别是对于器官或组织独特的细胞类型，可 以表达独特的靶分子。
[0121]已经被鉴定为可用于归巢到特定器官或组织的肽基序的实例包括表3中列出的那 止匕 -、〇
[0122]表3
[0123]
[0124] 本发明包括肺归巢肽的应用，如CGFECVRQCPERC和CGFELETC，其分享GFE基序； CTLRDRNC;以及CIGEVEVC，其包含类似于CGFELETC中存在的ELE基序的EVE基序。
[0125] 优选地，本发明还可以使用皮肤归巢肽如CVALCREACGEGC。本发明进一步提供了具 有胰腺归巢肽如SWCEPGWCR的HPPS纳米颗粒。视网膜归巢肽如CSCFRDVCC和CRDVVSVIC也可 以与本发明的HPPS纳米颗粒一起使用。前列腺归巢肽如SMSIARL和VSFLEYR也可以与本发明 的HPPS纳米颗粒一起使用。还提供了卵巢归巢肽如RVGLVAR和EVRSRLS。本发明还可以使用 肾上腺归巢肽如分享LPR基序的LMLPRAD和LPRYLLS，或分享基序LAGG的肽R(Y/F)LLAGG和 RYPLAGG。此外，淋巴结归巢肽，如AGCSVTVCG可以与本发明一起使用。本发明还可以使用肠 归巢肽如YSGKWGK和YSGKWGW。
[0126] 心血管斑块归巢分子
[0127] 动脉粥样硬化斑块已知过度表达一些受体，如CX3CL1。本发明因此包括对于在这 样的斑块上过度表达的受体的配体。
[0128] 感染的组织归巢分子
[0129] 感染有各种感染性试剂如病毒、寄生虫、和/或细菌(如，HIV、疟疾…等）的组织通 常表达(或过度表达)细胞表面标记物/受体(如，蛋白质）。因此本发明的归巢分子包括对于 在这样的感染的组织上表达的所述细胞表面标记物/受体的配体。
[0130] 活性剂
[0131 ] 将活性剂修饰和包装入LDL的方法由Krieger，M.在Methods Enzymol. (1986)128: 608-13中描述，在这方面将其内容以引用方式并入本文。类似的方法可以与本发明一起使 用。
[0132] 亲脂性化合物
[0133] 各种活性剂可以经由本发明的HPPS纳米颗粒递送。在实施方式中，活性剂位于 HPPS纳米颗粒的核心中，其通常是亲脂的。亲脂性化合物由此能够经由本发明的HPPS纳米 颗粒递送。本发明的HPPS纳米颗粒可以与固有地亲脂的或可以通过化学修饰成为亲脂的活 性剂一起使用，在下面更详细地讨论。
[0134] 术语"亲脂性化合物"或"亲脂性药物"定义为处于其非离子化的形式时在脂质或 脂肪中比在水中更可溶的化合物或药物。亲脂性化合物的实例包括，但不限于，乙酰苯胺、 苯胺、氨基喹啉、二苯甲基化合物、苯并二氮草类、苯并咲喃、大麻酯(大麻素）、环肽、二苯丙 氮，草类、毛地黄糖苷、麦角生物碱类、类黄酮、咪唑、喹啉、大环内脂、萘、鸦片(或吗啡喃）、噁 嗪、噁唑、苯烷基胺、哌啶、多环芳香烃、吡咯烷、吡咯烷酮、均二苯代乙烯（1，2_苯乙烯， 芪）、磺酰脲、砜、三唑、莨菪烷、以及长春花生物碱。
[0135] 多种测试可以用于确定亲脂性。常见的测试方案是测量辛醇-水分配系数(Pow， κ?)，其是通过确定辛-1-醇与水之间的平衡分布来测量亲脂性。亲脂性药物是那些优先分 配入辛醇成分中的药物。
[0136] 可以被并入本发明的靶向的药物递送复合体的药物活性亲脂性药物包括用于治 疗癌症和青光眼的药物、免疫活性剂、抗肿瘤剂、抗胆碱能和类胆碱剂、抗蕈毒碱和蕈毒碱 剂、抗肾上腺素能药和抗心律失常药、抗高血压剂、消炎药、抗生素药、抗真菌药、类固醇类、 抗组胺药、平喘药、镇静剂、抗癫痫药、麻醉剂、安眠药、抗精神病剂、神经安定药、抗抑郁剂、 抗焦虑药、抗惊厥剂、神经元阻断剂、抗麻醉剂、止痛剂、抗增生剂、抗病毒药、激素类、和营 养剂。
[0137] 抗癌药的实例包括，但不限于紫杉醇(红豆杉醇）、二十二碳六烯酸(DHA)-紫杉醇 结合物、环磷酰胺、桦木酸、和阿霉素(参见，例如授予Strelchenok的美国专利第6，197，809 号)。
[0138] 抗青光眼药的实例包括，但不限于，β-阻滞剂如噻吗洛尔-碱、倍他索洛尔、阿替洛 尔、左布诺洛尔、肾上腺素、二新戊酰、oxono Ιο 1、乙酰唑胺-碱和醋甲唑胺。
[0139] 消炎药的实例包括，但不限于，留族药物如可的松和地塞米松以及非留族消炎药 (NSAID)如吡罗昔康、吲哚美辛、萘普生、苯基丁氮酮、布洛芬和双氯芬酸。平喘药的实例包 括但不限于泼尼松龙和泼尼松(也参见美国专利第6，057，347号）。
[0140] 抗生素药的实例包括但不限于氯霉素。抗真菌药的实例包括但不限于制霉菌素、 两性霉素 B、和咪康唑。抗病毒药的实例包括但不限于Acyclovir?(Glaxo Wellcome，U.K.)。
[0141] 类固醇的实例包括但不限于睾丸激素、雌激素、和孕酮。抗过敏药的实例包括但不 限于非尼拉敏衍生物。镇静剂的实例包括但不限于地西泮和异丙酚。
[0142] 通常不是亲脂性的被递送的化合物可以通过将它们融合或共价偶联到一个或多 个亲脂性分子以产生两亲化合物而用在本发明中。例如，这样的亲脂性分子优选地包含至 少一个长烃链(>C 1Q)，其或者通过顺式-双键弯曲或者通过至少一个侧链支化。这样的分子 包括，但不限于，胆固醇油酸酯、油酸酯、胆固醇月桂酸酯或植醇。也可以使用固醇和脂肪 酸。
[0143] 核酸，如siRNA，以及核酸和肽适体，可以通过复合核酸与阳离子脂质以形成亲脂 性复合体来作为"亲脂性"化合物递送，所述复合体可以随后被并入颗粒的核心，或相反与 本发明的磷脂结合。核酸还可以经由与脂质锚的共价键而被并入HPPS纳米颗粒，如下指出 的。
[0144] 具有脂质锚的药剂
[0145] 除了为亲脂性的并且可以被加载入本发明的HPPS纳米颗粒的核心的活性剂外，本 发明还包括可以加载到本发明的HPPS的表面上的活性剂。这样的活性剂可以是具有脂质锚 的亲水性的。本发明的HPPS纳米颗粒也可以被修饰成包括亲脂性螯合剂，这样的亲脂性螯 合剂是熟知的。例如，亲脂性螯合剂，DTPA Bis(硬脂酰胺），可以利用标准技术被并入到 HPPS纳米颗粒中。同样地，1，1_双十八烷基_3,3,3,3_四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(Dil)可 以被用作已知插入LDL磷脂单层的脂质-锚定的、基于羰花青的光学探针，并且可用在本发 明的HPPS纳米颗粒中。
[0146] 类似地，近红外（"NIR"）探针如三羰花青染料，其是NIR荧光团，可以被修饰以包括 允许这样的探针被锚定到本发明的HPPS纳米颗粒的脂质-螯合锚。可以使用任何这样的脂 质-螯合锚，例如，胆固醇月桂酸酯部分可以被连接到NIR探针以将它们锚定到本发明的 HPPS纳米颗粒。（Zheng et al.，Bioorg.&Med.Chem Lett.l2:1485-1488(2002)〇
[0147]如上说明的，胆固醇部分也可以用于锚定HPPS纳米颗粒内的siRNA(和另外的适 体)和其它活性剂。已经确定，胆固醇-结合的siRNA可以在体内沉默基因表达，并且这些结 合物结合到LDL和HDL颗粒（Wolfrum，C.et al .Nature Biotech.published online 16 September 2007)。用于活性剂的合适的锚包括油酸酯(盐)和不饱和的胆固醇酯部分。这样 的锚可以利用本领域技术人员已知的合成方法共价连接至活性剂。在一个实施方式中，所 述锚可以经由酯键共价连接至活性剂。
[0148]成像/诊断剂
[0149]在一个实施方式中，活性剂可以是可检测的试剂(药剂），如放射性核素或成像剂， 其允许所选器官或组织的检测或可视化。因此，本发明提供了包括肺、皮肤、血液、胰腺、视 网膜、前列腺、卵巢、淋巴结、肾上腺、肝脏或肠归巢分子的HPPS纳米颗粒。选择的可检测试 剂的类型将取决于应用。例如，为了受试者中肺的体内诊断性成像研究，肺归巢分子可以被 连接到包含在给予受试者后对于受试者外部可检测的试剂的HPPS纳米颗粒。为了检测这样 的内部器官或组织，例如，前列腺，发射放射性核素如铟-113、铟-115或锝-99的γ射线可以 与连接到前列腺归巢分子的HPPS纳米颗粒结合，并且在给予受试者后，可以利用固体闪烁 检测器被可视化。可替换地，对于受试者的外表面处或附近的器官或组织，例如，视网膜，可 以使用荧光素-标记的视网膜归巢分子，使得视网膜的内皮结构可以利用检眼镜和适当的 光学系统被可视化。
[0150] 选择性归巢到器官或组织中的病理损害的分子类似地可以用在本发明的HPPS纳 米颗粒中以递送适当的可检测试剂，使得损害的大小和分布可以被可视化。例如，当器官或 组织归巢分子归巢到正常器官或组织，但是不归巢到器官或组织中的病理损害时，可以通 过鉴定器官或组织中的异常或非典型图像，例如，损害区中可检测试剂的缺乏，来检测病理 损害的存在。
[0151] 可检测的试剂还可以是方便体外检测的试剂。例如，包含归巢分子和酶的HPPS纳 米颗粒(其在存在适当的底物时产生可见信号）可以检测归巢分子针对的器官或组织或细 胞的存在。可以包含例如碱性磷酸酶或荧光素酶等的这样的HPPS纳米颗粒可以用在如免疫 组织化学的方法中。这样的HPPS纳米颗粒还可以用于检测例如，在靶分子的纯化期间在样 品中，结合了器官归巢分子的靶分子的存在。
[0152] 另外的诊断剂包括对比剂、放射性标记和荧光标记。优选的对比剂为光学对比剂、 MRI对比剂、超声对比剂、X-射线对比剂和放射性核素。
[0153] 治疗剂
[0154] 治疗剂可以为在选择的器官或组织的部位处发挥其功能的任何生物学上有用的 试剂(药剂），如先前提及的活性剂和亲脂性化合物。例如，治疗剂可以为小的有机分子，其 在由于连接的器官归巢分子结合到靶细胞后，被细胞内在化，在那里它可以影响其功能。治 疗剂可以为编码涉及所选的器官或组织中，如希望的，刺激或抑制细胞存活、细胞增殖或细 胞死亡的蛋白质的核酸分子。例如，编码蛋白质如Bcl_2(其抑制凋亡）的核酸分子可以用 于促进细胞存活，而编码蛋白质如Bax(其刺激凋亡）的核酸分子可以用于促进靶细胞的细 胞死亡。
[0155] 刺激细胞死亡的特别有用的治疗剂是蓖麻毒素，其，当连接到包含本发明的器官 归巢分子的HPPS时，可以用于治疗高增殖性障碍，如，癌症。包含本发明的器官归巢分子和 抗生素，如氨苄西林或抗病毒剂，如病毒唑的HPPS纳米颗粒，例如，可以用于治疗选择的器 官或组织中的细菌或病毒感染。
[0156] 治疗剂还可以抑制或促进生物分子的产生或活性，其表达或缺乏与病状相关。因 此，蛋白酶抑制剂可以为这样的治疗剂，其在连接到包含器官归巢分子的HPPS时，可以抑制 选择的器官或组织，如胰腺处的蛋白酶活性。基因或其功能等价物如cDNA(其可以补充或恢 复选择的器官或组织中的蛋白质的产生）也可以为用于改善病状的严重性的治疗剂。治疗 剂还可以为反义核酸分子，其表达抑制有害蛋白质的产生，或者可以为编码显性阴性蛋白 质或其片段的核酸分子，其可以抑制有害蛋白质的活性。如上所述，核酸，以及核酸和肽适 体，可以通过复合核酸与阳离子脂质以形成亲脂性复合体来作为"亲脂性"化合物递送，所 述复合体随后可以被并入颗粒的核心，或相反与本发明的磷脂结合。胆固醇部分或其它脂 质锚还可以用于将这些和其它活性剂锚定在HPPS纳米颗粒的核心内。
[0157] 光动力学治疗(PDT)剂
[0158] PDT是涉及光和光敏剂的组合的有希望的癌症治疗。每个因素本身是无害的，但是 当组合在一起时，它们可以产生杀死肿瘤细胞的致死性活性氧物质（Dougherty，T.J. et al.Journal of the National Cancer Institute.90,889-905(1998))。单态氧(^02)是与 多种生物分子和集合反应的有力的、相当不加区别的氧化剂。通常公认是roT诱导的肿瘤 坏死的关键试剂（Niedre ,M. et al · Photochemistry&Photobiology · 75,382-391 (2002))。 的扩散范围限于细胞介质内的大约45nm(Moan，J · Photochem. Photobiol · 53，549-553 (1991))。因此，02的主要产生的部位决定哪个亚细胞结构可以被到达和攻击，换句话说，如 果光敏剂优先位于肿瘤细胞内，则PDT诱导的细胞损害是高度肿瘤特异性的。
[0159]优选的光动力学治疗剂为卟啉、扑啉异构体、和扩展的卟啉。
[0160]在实施方式中，光动力学治疗剂选自由叔丁基硅萘酞菁二油酸酯（SiNc-BOA)、叔 丁基硅酞菁二油酸酯（SiPc-BOA)、和焦脱镁叶绿酸-胆固醇酯(Pyro-CE)组成的组。SiNc-B0A、SiPc_B0A、和Pyro-CE是产生用于光动力学治疗的毒性氧物质的光敏剂化合物。
[0161] 用于荧光成像的近红外(NIR)染料和TOT剂
[0162] NIR荧光成像（NIRF)是非放射性的、高度敏感的、和便宜的癌症检测模式 (ffeissleder,R.et al.Nature Medicine 9,123-128(2003),Frangioni,J.V.Current Opinion in Chemical Biology 7,626-634(2003))，其允许基于肿瘤和健康组织的焚光之 间的差异检测肿瘤和健康组织的非侵入性区别。NIR染料目前作为用于癌症检测的NIRF探 针和作为用于通过PDT的癌症治疗的光敏剂吸引相当大的兴趣。NIR染料的吸引力在于在 600nm到900nm之间的光谱窗口中的组织光学性能。对于这样的波长，组织吸收系数较低；因 此光的传播主要由散射事件控制，并且几厘米的穿透深度是可达到的。因此，NIR染料的独 特能力能够使表面下的肿瘤，包括乳腺癌荧光成像和Η)Τ治疗。
[0163] NIRF和TOT模式的目前的限制是它们由于将染料递送至肿瘤的相对非特异性性质 而缺乏足够的肿瘤与组织对比，其已经导致对于NIRF的假阴性和对于PDI的不足的肿瘤与 正常组织治疗比率。因此，祀向"肿瘤标记"的试剂，即，在癌细胞中选择性积聚的分子，是特 别有吸引力的。本发明提供了将NIRF/PDT试剂锁定在核心内的肿瘤-靶向HPPS纳米颗粒，使 得实现更高的探针/蛋白质摩尔比率和肿瘤特异性。
[0164] 磁共振成像剂
[0165] 现在已经确立MRI是目前可利用的各种诊断形式中优秀的方法，因为其通过体内 取样水质子的量、流量、和环境提供了绘制软组织中的结构和功能的有力方式。通过使用对 比剂可以增大固有的对比。靶向的MRI试剂，虽然概念上非常有吸引力，但是仅存在于一些 潜在有用的实例中。因为敏感性限制，目前有效的识别需要非常高容量的靶标，如血纤蛋 白，其以足够的量存在以致可以用简单靶向的Gd(钆)螯合剂看见，或者可以用与Gd簇、聚合 物或铁颗粒连接的到达血流的靶标。这是目前非常有限的靶标集。此外，胞内MRI成像是特 别有挑战性的，因为用于MRI检测限所需的MRI剂的最小浓度大大高于（约ImM)胞外靶向阈 值（40μLν?)〇(Aime，S·et al.Journal of Magnetic Resonance Imaging.2002 16(4): 394-406, Nunn,A.D.et al.Quarterly Journal of Nuclear Medicine.1997 41(2):155-62)。一个值得注意的尝试被Wiener et al·在1995年报道（Wiener ,E.C.et al · Investigative Radiology · 1997 Dec ,-32( 12): 748-54)。利用基于叶酸-结合的DTPA的 树枝状高分子，它们实现由与叶酸受体的存在相关的肿瘤细胞的摄取。注射后24h，它们还 获得17 %的MRI对比增强。本发明提供了递送MRI和NIRF/PDT剂的HPPS纳米颗粒。
[0166] 在本发明的一些实施方式中，MRI对比剂为氧化铁或镧系元素的碱(镧系元素碱， lanthanide base)，如,L(Gd3+)金属。
[0167] 在神经系统中活跃的试剂
[0168] 在神经系统上活跃的药物也可以经由本发明的HPPS纳米颗粒被递送。这样的药物 包括抗精神病药、兴奋剂、镇静剂、麻醉剂、鸦片剂、镇定剂、抗抑郁剂、如MAO抑制剂、三环物 和四环物、选择性血清素再摄取抑制剂和安非他酮。在神经系统中活跃的药物还包括神经 肽。由于低代谢稳定性、被肝脏的高清除率和血脑屏障的存在，肽药物的递送通过它们到脑 的不良生物利用率被限制。本发明的HPPS纳米颗粒能够将这样的药物递送至中枢神经系 统。
[0169] 药物组合物
[0170] 当给予受试者时，本发明的纳米平台作为药物组合物给予，所述药物组合物包含， 例如，HPPS纳米颗粒和药用载体。药用载体在本领域中是熟知的，并且包括，例如水溶液如 水或生理缓冲盐水或其它溶剂或载体(媒介)如乙二醇、甘油、油如橄榄油或可注射的有机 酯类。
[0171]药用载体可以包含生理上可接受的化合物，所述化合物起作用，从而例如稳定或 增加复合体的吸收。这样的生理上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物如葡萄糖、蔗糖 或右旋糖，抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白或其它稳定剂或赋形 剂。本领域技术人员将已知药用载体的选择，包括其中任何生理上可接受的化合物，取决 于，例如给予药物组合物的途径。所述药物组合物还可以包含这样的HPPS纳米颗粒，所述 HPPS纳米颗粒进一步包括癌治疗剂、或希望的其它活性剂，包括亲脂性化合物、具有脂质锚 的试剂、成像/诊断剂、治疗剂、光动力学治疗（PDT)剂、用于荧光成像和PDT剂的近红外 (NIR)染料、磁共振成像剂、以及在神经系统中活跃的试剂。
[0172] 如上所述，本发明的纳米平台可以在生理或药用载体中提供，或可以以用于随后 应用的冻干形式提供。组合物在打算用于肠胃外给予等时可选地是无菌的，但是在打算用 于一些局部应用时不需要总是无菌的。可以使用任何药用载体，包括但不限于含水载体。用 于肠胃外注射的含水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃 外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳化的林格氏或固定油。静脉内 载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等等。也可以存 在防腐剂和其它添加剂，如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等。
[0173] 本领域技术人员将已知包含本发明的HPPS纳米颗粒的药物组合物可以通过多种 途径给予受试者，例如，口服或肠胃外，如静脉内。所述药物组合物可以通过注射或通过插 管给予。
[0174] 在进行如本文披露的诊断、成像或治疗方法中，必须给予受试者治疗有效量的本 发明的HPPS纳米颗粒。"治疗有效量"是产生期望的效果的HPPS纳米颗粒的量。有效量将取 决于，例如活性剂和计划的用途。例如，与用于治疗目的(其中期望杀死细胞)给予的放射性 同位素标记的分子的量相比，对于成像可以需要较少量的放射性同位素标记的HPPS纳米颗 粒。用于具体目的的特定HPPS纳米颗粒的治疗有效量可以利用本领域中熟知的方法来确 定。
[0175] 原则上，作为本发明的HPPS纳米颗粒的部分的器官归巢分子可以具有固有的生物 学性能，使得所述分子的给予提供直接的生物学效应。例如，器官归巢分子可以充分地类似 于对于靶分子的天然存在的配体，以便所述器官归巢分子模拟天然配体的活性。这样的器 官归巢分子可以用作具有天然配体的活性的治疗剂。例如，当所述器官归巢分子模拟结合 通过选择的器官或组织表达的受体的生长因子的活性时，如模拟表皮生长因子的活性的皮 肤归巢分子，所述器官归巢分子的给予可以导致所述器官或组织的细胞增殖。本发明的器 官归巢分子的这样的固有的生物学活性可以通过使选择的器官或组织的细胞与所述归巢 分子接触并检验细胞的生物学效应的证据，例如，细胞增殖或当固有活性是毒性作用时细 胞死亡来鉴定。
[0176] 此外，作为本发明的HPPS纳米颗粒的部分的器官归巢分子可以具有结合特定靶分 子的固有活性，使得相应的配体不能结合受体。已知，例如，各种类型的癌细胞转移到特定 器官或组织，显示癌细胞表达结合其转移的器官中靶分子的配体。因此，例如，给予具有转 移到肺的肿瘤的受试者肺归巢分子可以提供防止潜在的转移性癌细胞变成在肺中建立的 方式。然而，通常，本发明的器官归巢分子特别用于将HPPS纳米颗粒靶向选择的器官或组 织。因此，本发明提供了通过给予具有病状的受试者本发明的HPPS纳米颗粒来治疗选择的 器官或组织中病状的方法。
[0177] 肺的特定疾病，例如，可以通过给予受试者包括肺归巢分子和治疗剂的HPPS纳米 颗粒来治疗。因为肺归巢分子可以定位于肺的毛细管和肺泡，与这些区域相关的疾病特别 适用于用包含肺归巢分子的结合物治疗。例如，细菌性肺炎通常起源于肺的肺泡和毛细管 (Rubin and Farber,Pathology 2nd ed.，（Lippincott Co. ,1994))。因此，具有肺归巢分 子和合适的抗生素的HPPS纳米颗粒可以给予受试者以经由本发明的HPPS纳米颗粒来治疗 肺炎。类似地，由于CFTR中的缺陷，囊性纤维化造成肺中的病理损害。因此，给予具有肺归巢 分子和编码CFTR的核酸分子的HPPS纳米颗粒提供了作为体内基因治疗处理方法的用于使 所述核酸分子到达肺的方式。
[0178] 本发明还提供了通过给予具有病状的受试者包含皮肤归巢分子和治疗剂的HPPS 纳米颗粒来治疗皮肤的病状的方法。例如，烧伤受害者可以被给予包含皮肤归巢分子和表 皮生长因子或血小板衍生的生长因子的HPPS纳米颗粒，使得所述生长因子被定位于皮肤， 在此处它可以加速表皮和下面的真皮的再生或修复。此外，通过给予受试者包含皮肤归巢 分子和抗生素的HPPS纳米颗粒，本发明的方法可以用于治疗由细菌感染引起的皮肤病状， 特别是在整个皮下组织和真皮扩散的感染或者定位在这些组织中的感染。
[0179] 本发明还提供了通过给予具有病状的受试者包含胰腺归巢分子和治疗剂的HPPS 纳米颗粒来治疗胰腺的病状的方法。尤其是，由于本发明的胰腺归巢分子可以定位于外分 泌胰腺，因此与外分泌胰腺相关的病状可以被治疗，并且在一些情况中，可能会不利地影响 内分泌胰腺。本发明的方法还可以特别用于治疗急性胰腺炎，其是由损害所述器官的分泌 的蛋白酶造成的外分泌胰腺的炎性状况。包含胰腺归巢分子和蛋白酶抑制剂的HPPS纳米颗 粒可以用于抑制蛋白酶介导的组织破坏，由此减轻病状的严重性。可用于这样的HPPS纳米 颗粒中的适当的蛋白酶抑制剂是抑制与胰腺炎相关的酶的那些抑制剂，包括，例如，胰岛 素、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶和胰脂肪酶的抑制剂。本发明的方法还可以用于通 过给予受试者包含连接到归巢到胰腺的分子的治疗剂的HPPS纳米颗粒来治疗具有胰腺癌 的受试者，例如，导管腺癌。
[0180] 本发明的方法还可以用于通过给予具有病状的受试者包含视网膜归巢分子和治 疗剂的HPPS纳米颗粒来治疗眼，尤其是视网膜的病状。例如，增生性视网膜病与对于由于例 如糖尿病的视网膜局部缺血的应答的视网膜的心血管形成相关。因此，给予包含连接到刺 激凋亡的基因，例如Bax的视网膜归巢分子的结合物可以用于治疗增生性视网膜病。类似 地，本发明的方法可以用于利用如本文披露的适当的器官或组织归巢分子来诊断或治疗前 列腺、血液、卵巢、乳腺、淋巴结、肾上腺、肝脏、或肠病状。
[0181] 本发明进一步提供了用于治疗受到多种感染物如病毒、寄生虫、和/或细菌（如 HIV、疟疾…等)感染的组织的方法。与HPPS纳米支架一起使用的归巢分子将通常包括到达 感染组织中表达(或过度表达)的细胞表面标记物/受体(例如，蛋白质）的配体。
[0182] 本发明进一步提供了将亲脂性化合物、诊断剂或药物递送到受试者、靶组织、或器 官的方法，包括以下步骤:制备HPPS的药物剂型，所述剂型包括与脂质结合的亲脂性药物， 所述脂质的量为根据本发明的方法足以与所述亲脂性药物形成复合体的量；以及给予所述 靶组织治疗有效量的药物剂型。本发明的药物剂型可以静脉内、动脉内、鼻内给予，诸如通 过气溶胶给予、雾化、吸入、或喷洒、气管内、关节内、经口、经皮、皮下、直肠、或局部。
[0183] "有效的"或"治疗有效的"量是指(在某种程度上)缓解患者中的疾病或状况中的 一种或多种症状的量。此外，"治疗有效量"是指将与疾病相关或是疾病成因的生理或生物 化学参数部分或完全返回到正常的量。此外，有效量可以为足以实现某个其它计划的目的 的量，如放射性成像剂或其它诊断剂递送到器官或组织。
[0184] 此外，本发明提供了一种鉴定选择的器官或组织或诊断选择的器官或组织中的病 状的方法，包括以下步骤:制备包含适当的靶向部分和与脂质结合的诊断剂的HPPS的药物 剂型，所述脂质的量足以根据本发明的方法与所述诊断剂形成颗粒，以及给予受试者到达 所述靶器官或组织的药物剂型。
[0185] "诊断剂"是指可以与用于使患者的内部区域成像和/或诊断患者中疾病的存在或 缺乏的方法结合使用的任何试剂。示例性的诊断剂包括，例如，用于与患者的超声成像、磁 共振成像或计算机断层成像结合使用的放射性和荧光标签以及对比剂。诊断剂还可以包 括用于促进患者中疾病或其它状况的诊断的任何其它试剂，不管是否采用成像方法。
[0186] 本发明还提供了一种治疗经受选自由以下组成的组中的障碍的受试者的方法:皮 肤癌、牛皮癣、痤疮、湿疹、红斑痤疮、光化性角化病、脂溢性皮炎、和先天性角化障碍，其中 根据本发明的方法的任何组合物通过局部应用而给予需要这样的治疗的受试者。
[0187] 本发明的HPPS纳米颗粒可以，如上所述，用于局部应用。因此，本发明进一步提供 了一种治疗皮肤的一种或多种状况的方法，所述状况选自由干性皮肤、光损害皮肤、老年 斑、老化皮肤、增加的角质层柔软性、皱纹、细纹、光化性斑点、皮肤变色、以及鱼鳞癣组成的 组，所述方法包括将根据本发明的任何组合物施加至具有所述一种或多种状况的皮肤，其 中要被递送的所述化合物是用于治疗这样的状况的已知化合物，以其用于治疗这样的状况 的已知的量递送。如本文中所用的，术语"局部应用"是指将本发明的组合物施加或涂布到 皮肤的表面上。
[0188] 要在本发明的局部组合物中递送的化合物可以包括皮肤活性成分。这样的皮肤活 性成分的非限制性实例包括维生素 B3化合物，如授予Oblong等人的1997年10月30日公开的 PCT申请W097/39733中描述的那些，将其全部内容以引用方式并入本文中；类黄酮化合物； 羟基酸如水杨酸;表皮脱落或脱皮剂如两性离子表面活性剂;防晒油如2-乙基己基-P-甲氧 基肉桂酸酯、4，4 叔丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、奥克立林、苯基苯并咪唑磺酸;防晒乳如氧 化锌和二氧化钛;消炎剂;抗氧化剂/自由基清除剂如生育酚及其酯;金属螯合剂，尤其是铁 螯合剂;类维生素 A如视黄醇、棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、及视黄醛;N-乙酰 基-L-半胱氨酸及其衍生物;羟基酸如乙醇酸;酮酸如丙酮酸;苯并呋喃衍生物;脱毛剂(如 巯基化合物）；皮肤光亮剂(如，熊果苷、曲酸、对苯二酚、抗坏血酸及衍生物如抗坏血酸磷酸 盐，胎盘提取物等）；抗脂肪团剂(如咖啡因、茶碱）；湿润剂;抗微生物剂;抗雄激素剂；以及 护肤剂。也可以使用上面提及的皮肤活性物的任何的混合物。这些活性成分的更详细的描 述在授予Blank等人的美国专利第5,605,894号中发现。优选的皮肤活性成分包括羟基酸如 水杨酸、防晒油、抗氧化剂及其混合物。可以通过施加旨在置于皮肤上的润肤液、乳剂、凝 胶、乳化液、喷雾、调理物、化妆品、唇膏、粉底、指甲油或类似物形式的本发明的组合物来 实施局部应用，用于一些美容、预防性、治疗性或其它益处。
[0189] 用于制备本发明的HPPS纳米颗粒的方法
[0190] 纳米平台核心负载
[0191] 本发明提供了制备本发明的HPPS纳米颗粒的方法。用于将药剂并入LDL和HDL颗粒 中的现有技术方法在授予Zheng等人的PCT申请公开号WO 2006/073419(【公开日】：2006年7月 13日；PCT申请号PCT/US2005/011289)中概述，将其内容以引用方式并入本文中。
[0192] 在优选的实施方式中，通过在有机溶剂如，例如甲苯、苯、二氯甲烷，以及优选地氯 仿中合并适当的磷脂与不饱和胆固醇酯，接着蒸发溶剂和真空干燥来制备HPPS纳米颗粒。 在约40-60°C超声处理后加入缓冲剂产生乳液。向乳液中加入如上所述的适当的支架肽导 致球状HPPS纳米颗粒的优先形成。如果期望HPPS纳米颗粒的核心-负载，则要被加载到核心 中的药剂最初与磷脂和油酸胆固醇酯合并，并且随后是同样的程序。
[0193] 细胞表面受体配体的连接
[0194] 在用活性剂加载HPPS纳米颗粒的核心后，HPPS纳米颗粒的表面可以被修饰以连接 细胞表面受体配体。可替换地，也可以在加载活性剂的同时并入所述细胞表面受体配体，在 一些实施方式中，所述细胞表面受体配体共价地结合至本发明的HPPS纳米颗粒的支架肽。
[0195] 将细胞表面受体配体连接至本发明的HPPS纳米颗粒可以经由标准技术发生。HPPS 纳米颗粒的支架肽可以包含可结合的氨基酸残基如赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸等。 在一个实施方式中，存在赖氨酸残基，并利用已知的化学被偶联至所述细胞表面受体配体。 例如，配体叶酸可以通过针对缓冲剂，即NaH 2P〇4/H3B03缓冲剂透析HPPS纳米颗粒，经由增加 的pH连接到具有包含赖氨酸的支架肽的HPPS纳米颗粒。叶酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯然后在 室温下与HPPS纳米颗粒反应10小时。在反应完成后，对混合物进行离心以去除任何降解的 HPPS纳米颗粒。在最后的步骤中，可以针对EDTA缓冲剂透析粗HPPS-FA以将pH调节至7.4。
[0196] 显著地，细胞表面受体配体如叶酸和EGFR特异性肽结合至HPPS纳米颗粒的支架肽 并不影响它们与磷脂结合并形成纳米载体的能力。并且，优选地，叶酸和EGFR特异性肽与 支架肽的赖氨酸残基的结合将归巢分子放置在两亲性螺旋的亲水面与疏水面之间的过 渡处或附近。
[0197] 在另一实施方式中，除了细胞表面受体配体共价连接至HPPS纳米颗粒的支架肽 外，细胞表面受体配体还可以经由将这些细胞表面受体配体锚定到被并入HPPS纳米颗粒的 磷脂单层的脂质被呈现在HPPS纳米颗粒的表面上。在一个实施方式中，所述脂质锚可以为 1，2_二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸（聚乙二醇）-2000](DSPE-PEG(2000); Avanti)〇
[0198] 在另一实施方式中，所述HPPS纳米颗粒可以通过SR-B1受体介导的途径由细胞摄 取。HDL靶向SR-B1 (净化剂受体类型1，还称作HDL受体），并且不受理论的约束，认为HPPS模 拟HDL's SR-B1特异性。由于癌症（如乳腺癌）的一些类型显著过度表达SR-B1受体，因此 HPPS具有选择性靶向恶性细胞的潜力。此外，HPPS纳米颗粒可以用于以基于HDL的Gd-MRI探 针相同的方式使脆弱的斑块成像（Fayad group，Mt.Sinai New York:Frias et al.J.Am.Chem.Soc.2004；126:16316-7；Frias et al.Nano Lett.2006；6:220-4)〇
[0199] 下面的实施例说明通过SR-BI-介导的途径在体外和体内由细胞摄取HPPS纳米颗 粒。没有HPPS内在化的货运的初步证据表明HPPS纳米载体特别可用于癌症诊断剂和治疗剂 的直接细胞溶质递送。
[0200] 下面的实施例更详细地解释本发明。给出了下面的制备和实施例以使得本领域的 技术人员更清楚地理解和实施本发明。然而，本发明并不限于示例的实施方式的范围，所述 实施方式仅旨在作为本发明的单一方面的说明，并且功能上等效的方法在本发明的范围 内。确实通过前面的描述和附图，本发明的除了本文描述的那些外的各种修改对于本领域 技术人员来说变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
[0201] 将本文引用的每一参考文献的全部内容以引用方式明确地并入。
[0202]实施例
[0203] 实施例1
[0204] 起始原料的制备
[0205] 1)大小对照肽（scPep)
[0206] 利用商业上可获得的Ν-α-Fmoc保护的氨基酸、Sieber酰胺树脂作为固体载体，以 及使用HBTU/HOBt作为羧基活化剂，通过利用Fmoc固相肽合成（SPPS)方案(Novabiochem， Resource for peptide synthesis: http://www.emdbiosciences. com/g.asp?f = NBC/ peptideres.htm)，在肽合成仪PS_3(Protein Technologies，Inc ·)上合成两亲性螺旋的一 些短肽类似物，如Ac-DWLKAFYDKVAEKLKEAF(〃2F〃）、AC-DWFKAFYDKVAEKFKEAF( "4F"，在本文 中也称为〃+4F〃））、和Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD(-4F)。在合成受保护的序列后，用N，N-二甲 基甲酰胺(DMF)中20 %的哌啶去除肽-树脂的N末端Fmoc以暴露末端胺。随后用在具有10% 乙酸酐的四氢呋喃中的10 %吡啶帽化NH2-肽-树脂。用95 %三氟乙酸和5 %三异丙基硅烷进 一步处理Ac-肽-树脂以去除肽序列上受保护的基团并劈开固体载体。在通过过滤去除劈开 的固体树脂后，滤液被浓缩并通过加入无水醚沉淀以产生scPep。色氨酸(W)的荧光被用于 确定HPPS的scPep含量。本领域技术人员已知的其他方法，如氨基酸分析，可以用于确定 HPPS的肽含量。具有自由侧链胺基团的赖氨酸(K)被用于结合靶向配体。
[0207] 2)作为对于EGFR的靶向配体的EGFR-特异性肽(EGFp)
[0208] 合成肽序列，Fmoc-YHWYGYTPQNVI。在最终的Fmoc去除后，具有N-末端NH2基团的肽 NH2-YHWYGYTPQNVI从固体载体被切开。三个等摩尔量的辛二酸二-(N-羟基琥珀酰亚胺酯） (Sigma Aldrich)随后被结合至DMS0中的EGFp的N末端，以形成EGFp-NHS。
[0209] 3)结合至磷脂的EGFp(EGFp-脂质）
[0210] 首先在DIPEA存在的情况下，在无水二甲亚砜(DMS0)中，以1:5的摩尔比使EGFp与 辛二酸二(N-羟基琥珀酰亚胺酯）反应以产生EGFp-N-羟基琥珀酰亚胺酯(EGFp-NHS)。随后 在DMS0中，产物EGFp-NHS与1，2_二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二 醇）-2000]胺(DSPE-PEG(2000)胺，来自Avanti)以1:2的摩尔比孵育。在室温下伴随温和的 混合的6小时孵育后，用过量二乙醚冲洗样品。用二乙醚冲洗沉淀物3次以上，以去除任何未 反应的DSPE-PEG (2000)胺。包含终产物的沉淀物被干燥并重新悬浮在甲醇中。
[0211] 4)适于并入用于诊断和/或治疗应用的HPPS纳米颗粒的化合物在图2中阐述并包 括近红外荧光(NIRF)成像探针DiR-B0A( 1，Γ -双十八烷基-3，3，3 '，3 ' -四甲基吲哚三碳菁 碘二油酸酯）和DIR(1，Γ -双十八烷基-3，3，3 '，3 ' -四甲基吲哚三碳菁碘化物）JiR-BOA和 DIR可以分别作为核心-负载和表面-加载的NIRF探针合成用于HPPS。这两种染料具有类似 的吸收和发射波长激发（ex. 748nm,em. 782nm) 〇 [0212] 5)磷脂
[0213] 适合于HPPS制备的磷脂包括但不限于DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆 碱）、P0PC(1-棕榈酰基-1-油酰基-磷脂酰胆碱)和EYPC(卵黄磷脂酰胆碱）。所有磷脂均从 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster,Alabama,USA)贝勾买。
[0214] 实施例2
[0215]用于HPPS纳米颗粒制备的方法
[0216] HPPS是完全溶于含水缓冲剂，如tris盐水（10mM tris-HCl，150mM NaCl，ImM EDTA，pH 7.5)中的大分子复合体。1^8盐水缓冲剂在下面概述的所有试验中被用作用于 HPPS的溶剂。
[0217] 1 )HPPS:将3μπιο1的DMPC和0.3μπιο1的胆固醇油酸酯溶解在试管中的0.5mL氯仿中。 用仏缓慢蒸发掉溶剂并通过高真空进一步干燥。随后将lmL的缓冲剂（10mM Tris-HCl，pH 8.0，包含0.1M KC1，ImM EDTA)加入到干燥试管中并在50°C超声处理1小时以形成乳液。将 scPep 0.8μηιο1加入到溶液中以形成HPPS颗粒。所述颗粒随后通过快速蛋白质液体层析法 (FPLC)纯化。FPLC方法将在下面描述。
[0218] 2)DiR-B0A 核心-加载的 HPPS((DiR-BOA)HPPS):将 3μπιο1 的 DMPC和0·3μπιο1 的胆固 醇油酸酯和〇. 25μπιο1的DiR-BOA溶解在试管中的0.5mL氯仿中。用Ν2缓慢蒸发而去除溶剂并 通过高真空进一步干燥。将lmL的缓冲剂（10mM Tris-HCl，pH 8.0,包含0.1M KCl，lmM EDTA)随后加入到干燥的试管中并在50°C超声处理1小时以形成乳液。将scPep 0.8μπι〇1加 入到溶液中以聚集(DiR-BOA) HPPS颗粒。所述颗粒随后通过FPLC纯化。
[0219] 3)DiR表面-标记的HPPS(DiR-HPPS):利用基于由Pitas等人[J.Cell Biol.1985, 100,103-117 ]描述的初始方法的修改的程序，用亲脂性近红外染料DiR(l，l'_双十八烷基-3，3，3 '，3 ' -四甲基Π 引噪三碳菁鹏化物）（ex · 748nm，em. 782nm) (Molecular Probes，Inc ·， Eugene，0R)标记HPPS。简单地说，通过将3mg(3 · 2μηιο1)的DiR溶解在lmL二甲亚砜(DMS0)中 来制备DiR的储备溶液;将0. lmL的储液加入到0.5mL的HPPS溶液(30μΜ)中以产生40DiR与1 颗粒的最终摩尔比率。在黑暗中在37°C孵育该混合物18小时后，DiR表面-标记的HPPS(DiR-HPPS)通过超速离心（49,000rpm，20小时，4°C，Beckman 50Ti旋转器)进行分离，针对包含 0.01 %EDTA的盐水透析，并且过滤灭菌(0.45ym，Water Millex HV单位）。通过检查HPPS浓 度(基于320nm处色氨酸荧光的肽浓度）和DiR浓度(基于782nm处DiR荧光）来确定DiR-HPPS 上的DiR加载。
[0220] 4)作为对于（DiR-BOA)HPPS 的靶向配体的 EGFp 结合的 scPep，EGFp-(DiR-B0A)-HPPS(类型1 EGFR-靶向的HPPS):根据图3中描述的方案来合成EGFp-结合的DiR-BOA核心-加载的HPPS ((DiR-B0A)HPPS)。简单地说，在试管中将3μπιο 1的DMPC、0.2μπιο 1的胆固醇油酸 酯和0.40μπι〇1的DiR-BOA溶解在氯仿中。通过用犯缓慢蒸发来去除溶剂并通过高真空进一 步干燥。随后将lmL的缓冲剂加入到干燥的试管中并在50°C超声处理1小时以形成乳液。然 后将scPep加入到溶液中以聚集（DiR-BOA)HPPS颗粒。通过在4°C下，分别针对pH = 9.0、 10.0、10.9的0.说似!^04,0.11!1必03缓冲剂进行透析，该颗粒溶液的？!1逐步从8.0增加到 10.9。随后将无水DMS0中的活性配体分子（1.8μπιο1)，如EGFp-NHS或FA-NHS加入到颗粒溶液 中，并且将反应混合物在室温下置于振荡器上。在6小时反应后，混合物随后在4°C下以 500rpm进行离心以去除任何沉淀物，随后在4°C下针对EDTA缓冲剂（0.3mM EDTA，0.9 % NaCl，pH 7.4)透析过夜。在透析过程中46??-(0丨1?-8(^)-即?3的?!1返回到7.4，并且除去未 反应的配体起始原料。重复该透析过程直到不存在分光光度上可检测的游离配体。所述颗 粒然后通过FPLC (FPLC法将在下面描述)纯化。
[0221] 5)作为对于（D iR-BOA) HPPS 的靶向配体的 EGFp-脂质，EGFp-脂质（D i R-BOA) HPPS (类型2 EGFR-靶向的HPPS):如图4所示，制备EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS的过程类似于(DiR-B0A)HPPS的制备过程。仅有的差别是在纳米颗粒配制中将0.18μπι 〇1 EGFp-脂质(EGF肽结合 的磷脂)加入到3μπιο1的DMPC中。
[0222] 6)作为对于（DiR-BOA)HPPS的靶向配体的叶酸结合的scPep，FA-(DiR-BOA)-HPPS (类型1 FR-靶向的HPPS):按照图3中描述的方案来合成FA-(DiR-BOA) -HPPS (用叶酸-NHS替 换EGFp)。
[0223] 7)作为对于(DiR-BOA)HPPS的靶向配体的叶酸-脂质，FA-脂质(DiR-BOA)HPPS(类 型2 FR-靶向的HPPS):按照图4中描述的方案来合成FA-脂质(DiR-B0A)_HPPS(用叶酸-脂质 替换EGFp-脂质）。
[0224] 8)作为对于（DiR-BOA)HPPS的靶向配体的全长EGF，（-4F)EGF(DiR-BOA)HPPS:全长 重组人类EGF从R&D Systems，Inc · (Minneapolis，Minnesota，USA)购买。如上所述，配制 HPPS，具有30%的作为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000 ]马来酰亚胺(DSPE-PEG( 2000)马来酰亚胺）的磷脂含量。将EGF与Traut ' s试剂(2-亚氨 基硫烷-盐酸盐）（Sigma)在pH 9.0下一起孵育以将反应性巯基基团引入至EGF。然后在室温 下，在lmL的反应容积中，使巯基-EGF(16nmol)与HPPS(DSPE-PEG(2000)马来酰亚胺）（0.1μ mol)反应24小时。孵育期后，通过FPLC来纯化EGF-HPPS。
[0225] 实施例3
[0226] 利用4F制备的HPPS纳米颗粒的表征
[0227] 1.颗粒和有效载荷稳定性:颗粒和有效载荷稳定性对于所有的基于纳米颗粒的药 物递送系统是重要的。常规的基于脂质的纳米载体(如，脂质体和脂质乳液)在超小尺寸(〈 25nm)时不能维持稳定性。本发明的HPPS纳米载体系统表现出显著的稳定性。如表4所示，在 一个月期间，HPPS维持它们的尺寸和DiR-BOA有效载荷，如通过动态光散射(参见下文)和荧 光分光光度法所确定的。在4°C下储存后，没有观察到有效载荷泄漏。可以注意到，下面表中 的百分比表明具有所示尺寸的纳米颗粒的群体的比例。
[0228] 表4.颗粒稳定性
[0229]
[0230] 注意:该表示出了平均尺寸、百分比组成和DiR-BOA荧光强度
[0231] 当使用EGF肽、全长EGF、和FA作为靶向配体时，全部三个剂型(配方）的稳定性似乎 在一个月期间相当。
[0232] 2 .颗粒表征：四种方法已经用于表征HPPS纳米载体：1)快速蛋白质液相层析 (FPLC)，2)动态光散射(DLS)(纳米分级机），3)透射电子显微术(TEM)以及4)圆二色性(CD)。 [0233] 方法
[0234] 电子显微镜研究。装备有数字图像获取系统的现代Hitachi H-7000透射电子显微 镜用于确定HPPS纳米颗粒的含水分散体的形态和大小。将5微升的HPPS纳米颗粒悬浮液置 于碳-涂覆的200目铜网上并且使得放置5分钟。用拭镜纸除去过多的样品，并且施加5yL的 2%饱和含水醋酸双氧铀并使得放置20秒。随后用滤纸排出着色剂，并在采集数字图像之前 对铜网进行风干。所有的电子显微镜设备从Electron Microscopy Sciences(Fort Washington，PA)购买。
[0235] 动态光散射。通过光散射光子相关光谱学（Zetasizer Nan〇-ZS90;Malvern Instruments，Malvern，UK)，利用在633nm处操作的4 · OmW He_Ne激光器和90°的检测器角 度，测量HPPS颗粒的粒度分布。假定球形颗粒经历布朗运动来模型化数据。
[0236]快速蛋白质液相层析。在颗粒形成后，通过凝胶过滤层析，利用具有Akta快速蛋白 质液相层析（FPLC)系统（Amersham Biosciences，Pittsburgh，PA)的Superdex 200柱（60X 16cm)来纯化期望尺寸的HPPS颗粒。用Tris缓冲盐水（10mM Tris-HCl，pH 7.5,包含0.15M NaCl，ImM EDTA)以lmL/分钟的流速来洗提颗粒。洗提的颗粒的大小通过比较它们的保留时 间与具有已知直径的蛋白质的保留时间来确定：甲状腺球蛋白（17. Onm)、脱铁铁蛋白 (12.2nm)、过氧化氢酶（10.4nm)、牛血清白蛋白（7. lnm)、α-胰凝乳蛋白酶(4.2nm)、以及核 糖核酸酶A(3.8nm)〇
[0237] 圆二色性(CD)分光镜检查。利用Jasco J-815CD分光计来记录HPPS颗粒的远-UV ⑶光谱。在25 °C下，以lnm步长，从260到190nm记录⑶光谱。在5个连续的扫描上收集数据并 取平均数。ScPep的α螺旋二级结构通过在222nm处椭圆率的变化来监测。
[0238] 图5示出了利用4F制备的未靶向的DiR-BOA加载的HPPS的FPLC、DLS和CD。从FPLC (图5A)，可以收集HPPS颗粒的不同群体，如图5B中所示。FPLC部分的CD分析揭示scPep的强 结合(α_螺旋标志的存在）。对于较小的颗粒可以看出朝向α螺旋的更高含量的趋势。图6示 出了FPLC测量与ΤΕΜ-致。ΤΕΜ显示在60分钟洗提的颗粒。FPLC示出了具有狭窄分布的颗粒 的高产率。TEM证实HPPS颗粒具有单分散的球形形态。FPLC、TEM和DLS数据（未示出）表明 EGFp结合的HPPS颗粒的直径在ll-14nm的范围内。
[0239] 3.DiR-B0A加载和靶向配体对HPPS大小的影响：发现HPPS的大小可以通过它们的 DiR-BOA有效载荷来控制。这里是实例:如下所示，制备了 2个HPPS配方(剂型）。
[0241] 如图7所示，从每个制剂收集FPLC分布的单个部分。具有较低的DIR-B0A加载(#1) 的配方产生较小的HPPS颗粒的更均匀的分布。配方#2具有较高的DiR-BOA有效载荷(通过收 集的部分的更强的蓝色着色表明）和更不均匀的颗粒群体。这些HPPS颗粒的大小大于配方# 1的大小。这些发现表明HPPS颗粒的大小可以通过货物(DIR-BOA)加载来控制/调节。
[0242] 考虑到在配制具有较高剂量的DiR-BOA的颗粒时，HPPS颗粒的大小增大，对于HPPS "最终产物"的大小的一些控制可以通过调节加入到配方中的核心成分(D i R-B0A&胆固醇 酯）的量来实现。因此，增加/减少剂量的核心成分将导致增大/减小的尺寸的HPPS颗粒。这 在图7C中示出。强正相关系数在HPPS的大小与其DiRBOA有效载荷(R = 0.91)之间确定。
[0243] 当使用EGF肽和全长EGF作为用于HPPS的靶向配体时，形成的HPPS颗粒比用FA制备 的HPPS颗粒稍小(3-5nm)。所述肽和全长EGF似乎限制HPPS的大小。
[0244] 4.用4F和-4F形成的（DiR-BOA)HPPS的比较：
[0245] 利用3·0μπιο1 DMPC、0.2ymol胆固醇油酸酯、0.2ymol DiR-BOA、和2mg的4F或-4F， 如上所指出的，制备(DiR-BOA)HPPS纳米颗粒。
[0246] 如图8(a)所示，FPLC分布显示出对于-4F(DiR-B0A)HPPS仅一个峰，而对于4F(DiR-B0A)HPPS有两个峰。因此，4F和-4F均用于形成均匀的纳米颗粒。
[0247] 如图8 (b)所示，TEM成像揭示用-4F形成的（D i R-B0A) HPPS的球形比用4F形成的 (DiR-BOA)HPPS 更均匀。
[0248] 实施例4
[0249] HPPS的体外和体内评估
[0250]除非另外指明，否则在这些研究中所用的scPep为4F。
[0251]在下面提及HPPS的浓度的情况下，这些指的是由HPPS携带的DiR-BOA的浓度。为了 确定[DiR-ΒΟΑ]，绘制了DiR-B0A荧光与DiR-B0A浓度的标准曲线。用氯仿-甲醇(2:1，v: v)从 HPPS颗粒提取DiR-BOA。重复提取两次，并收集氯仿层，然后用快速真空干燥。将残留物重新 悬浮在lmL的氯仿-甲醇(2:1， v:v)中，并在荧光计上读取荧光。根据荧光读数，可以从标准 曲线确定HPPS颗粒中的DiR-BOA的浓度。
[0252] HPPS的浓度还可以基于肽浓度来确定。可以通过Bradford分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc .Hercules，CA)来确定HPPS的肽浓度。在这样的计算中，假定每个HPPS颗 粒包含22个肽。
[0253] 对于体内试验，tris盐水是用于给予HPPS的缓冲剂。注射的体积通常为250-350μ L〇
[0254] 实验动物和异位肿瘤的诱导。下面描述了各种肿瘤异种移植模型。这里我们介绍 了用于制备具有肿瘤异种移植物的小鼠的一般方法。成年雌性裸鼠（8-12周大)在整个研究 中被允许自由获取食物和水。将癌细胞(通常在中3 X 106个)皮下接种到裸鼠的右侧中。 将肿瘤接种后1到3周小鼠（具有约5mm的肿瘤尺寸)用于指定的研究。
[0255] A.EGFp(DiR-BOA)HPPS(类型 1 EGFR-靶向的 HPPS)的体外研究：
[0256] 利用共聚焦显微镜研究，在具有不同EGFR表达水平的癌细胞上(A549和MT1:高表 达，HepG 2:中等表达，H520 :低表达）检测EGFp (DiR-B0A)HPPS的EGFR-靶向特异性。利用 Olympus FV1000激光扫描共聚焦显微镜进行共聚焦研究。在具有10%胎牛血清(FBS)的 0.2mL 的 RPM1 1640 细胞培养介质中，A549、MT1 和 H520 细胞与 3μΜ 的 EGFp(DiR-BOA)HPPS(这 里和下面的体外和体内试验中表达的浓度是DiR的浓度)孵育。如图9所示，在5小时和24小 时孵育后，A549和MT1细胞呈现出具有高于H520细胞的EGFp(DiR-BOA)HPPS摄取，表明HPPS 的EGFR-靶向特异性。
[0257] 利用流式细胞术研究来进一步确认EGFp(DiR-BOA)HPPS的EGFR-特异性，在这些研 究中，细胞与EGFp(DiRBOA)HPPS孵育3到24小时，随后在FV 500流式细胞仪上进行分析。图 10表明在与Ι.ΙμΜ的EGFp(DiR-BOA)HPPS孵育后在MT-1与H520细胞中HPPS的较高摄取。图11 示出了利用过量的EGFp(lOyM)作为竞争性抑制剂，MT-1细胞中HPPS的摄取减少。
[0258] B.EGFp(DiR-BOA)HPPS 的体内研究
[0259] 体内NIR荧光成像。EGFp(DiR-BOA)HPPS经由尾静脉以250yLtris-盐水中5.2nmol 的浓度被给予小鼠。在注射前、注射后1、5、和24小时进行体内荧光成像。用CRI Maestro?体 内成像系统获得荧光图像。用氯胺酮/乙酰丙嗪(50/5mg/kg i.p.)麻醉小鼠并将其俯卧放 置入1&^81：1'〇成像仪的避光室中。用深红滤光镜(61 = 671-70511111，6111 = 750111]1长度穿过(730-950，10nm步中））和150msec的曝光时间来获得荧光图像。代表性图像示于图12中。到24小 时，MT1肿瘤内的荧光强度清楚地可见，表明HPPS被EGFR-表达的肿瘤的优先摄取。
[0260] 为了生物分布研究，收获小鼠（EGFp(DiR-BOA)HPPS注射后24小时）的器官/组织 (MT-1肿瘤、肝脏、脾脏、心脏、肌肉、肾和肾上腺）、称重并在PBS中匀化。随后将匀浆与3倍过 量的CHC13 :Me0H(2:1)混合物合并，并涡旋2分钟。随后将溶液以3，000rpm离心2分钟。利用 Horiba JobinYvon Fluoromax-4焚光分光光度计，测量各种样品的焚光强度(ex.748nm; em.782nm)。荧光信号对于样品重量被规格化，并且比率相对于肌肉和肿瘤组织表示（参见 图⑵。
[0261] C.EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS(类型2 EGFR-靶向的HPPS)的体内研究：用Cytomics FC 500 Series Flow Cytometry System(Beckman Coulter,Inc.Mississauga,Ontario, Canada)进行一系列流式细胞术试验，以评估EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS的EGFR-特异性。细 胞培养实验在具有10 %胎牛血清(FBS)中的0.2mL的RPM1 1640细胞培养介质中进行。首先， 如图13中所示，在与1. ΙμΜ的EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS孵育3小时后，A549细胞具有比H520 细胞更高的HPPS摄取。这些结果表明EGFp-脂质（D iR-B0A) HPPS在A549细胞中的EGFR-特异 性积聚。EGFR-特异性被进一步呈现在图14中，表明在具有不同EGFR表达水平的细胞系中 HPPS的时间依赖性摄取。
[0262] EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS的EGFR-特异性的进一步证据示于图15中。9倍过量的 EGFp的使用明显地抑制表达高或中等水平EGFR的细胞中该类型2 EGFR-靶向的HPPS(右）的 摄取，其与从类型1 EGFR-靶向的HPPS(左)获得的结果一致。
[0263] D.EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS的体外初步毒性研究：为了证实这些生物相容的纳米 载体确实是无毒的，利用MTT和流式细胞术分析进行体外毒性研究。为了评估毒性，通过流 式细胞术在A549细胞中研究浓度依赖性HPPS摄取。细胞培养实验在具有10%胎牛血清 (FBS)的0.2mL的RPM1 1640细胞培养介质中进行。由于在所有先前研究中使用的EGFp-脂质 (DiR-BOA)HPPS的标准药物剂量是1. ΙμΜ，所以EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS的药物-剂量依赖 性细胞内摄取通过增加药物剂量来检验。如图16c所示，2倍的标准剂量(2.2μΜ)导致摄取饱 和。因此，决定使用直到6倍剂量(6.6μΜ)用于毒性评价。如在图16a (ΜΤΤ分析)和图15b (流式 细胞术分析)中看到的，在MTT和流式细胞术试验中没有观察到毒性。
[0264] E.EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS 的体内研究：为 了评价 EGFp-脂质（DiR-BOA)HPPS 的体 内表现，检验了几个肿瘤模型。
[0265] 1) MT1肿瘤异种移植物：具有MT1肿瘤的雌性裸鼠在静脉内注射1.8nmo 1 (25 0μ 1 tris-盐水）的EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS(图17)后的几个时间点通过CRI Maestro?成像仪 进行检验。对于成像方法，参见体内EGFp (DIR-B0A) HPPS研究部分4B。观察到在所述时间过 程期间，纳米颗粒显不出优先在MT1肿瘤异种移植物中积聚，在24_48h达到最大。在72h， HPPS开始从肿瘤区清除。
[0266] 2)人类肺原发肿瘤异种移植物:EGFp-脂质(DiR-BOA)HPPS(l ·8nmol)的体内表现 还在表达EGFR的原发肿瘤异种移植物中进行评价。如图18所示，顶行示出了肾上的原发肿 瘤，而底行示出了胸部上的原发肿瘤。利用体内实时NIR荧光成像，清楚的是，HPPS颗粒在 注射后24小时期间在两个原发肿瘤部位积聚。结果还通过成像切除的组织和肿瘤来证实。 来自体内的组织/肿瘤成像以类似于整个动物成像的方式进行。（荧光图像在Maestro成像 仪上用深红色滤光镜（ex = 671-705nm，em = 750nm长度穿过(730-950，10nm步中）和150msec 的曝光时间获得）。
[0267] F.FA(DiR-B0A)HPPS 的体外研究：为 了证实 FA(DiR_B0A)HPPS 的叶酸受体(FR)-靶 向，HPPS与表达FR的细胞(KB细胞，人类表皮样癌细胞)和缺乏FR的细胞(HT-1080细胞，人类 纤维肉瘤细胞)孵育。在〇.2mL具有10%胎牛血清(FBS)的RPM1 1640细胞培养介质中进行细 胞培养实验。共聚焦成像研究（图19)表明，在与FA(DiR-B0A)HPPS(1100ng/mL)孵育4h后，在 整个KB细胞的细胞质看到强DiR-BOA荧光，表明FR靶向的HPPS纳米颗粒的高摄取(顶行hFA (DiR-BOA)HPPS的FR-介导的摄取通过另外的对照实验来确认。首先，当KB细胞与伴随过量 FA的FA(DiR_B0A)HPPS孵育时，FA(DiR_B0A)HPPS的摄取被FA竞争性抑制（中行）。第二，HT-1080细胞(FR阴性）中显著荧光的缺乏，表明FA(DiR-B0A)HPPS的急切摄取依赖于FR介导的 过程(底行）。共同地，这些结果提供了 FA(DiR_B0A)HPPS有效靶向FR的强大证据。
[0268] G ·与-4F形成的（DiR-B0A)HPPS( "(-4F) (DiR-B0A)HPPS"）的体外研究：HDL靶向并 结合至SR-B1 (净化剂受体类型1，还称作HDL受体）。认为，HPPS可以模拟HDL的SR-B1特异性， 并且HPPS的核心成分可以经由SR-B1受体-介导的途径被细胞摄取。
[0269] (-4F)(DiR-B0A)HPPS纳米颗粒如实施例3,部分4所述制备。两个细胞系被用于证 实HPPS(DiRBOA)的核心材料通过SR-B1途径由细胞摄取的假说:称为ldlA(mSR-Bl)的SR-B1 +细胞系和称为LDLA7的SR-B1-细胞系(Krieger，MIT)。羧基荧光素标记的磷脂(DSPE-PEG-CF)(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[聚（乙二醇)2000-N'_羧基荧光素])被用 于追踪结合至SR-B1后HPPS的磷脂成分的命运(结局）。类似地，焚光素标记的4F肽被用于追 踪肽成分的命运(图20)。
[0270] DSPE-PEG-CF从Avanti Lipids购买。HPPS的荧光素标记如制造商的说明所建议的 进行。简单地说，如上所述制备HPPS，并针对0.1M碳酸钠缓冲剂(pH 9)透析。将FITC(Sigma) 以lmg/mL的浓度溶解在无水DMS0中。然后将FITC以1:1(FITC:HPPS肽）的摩尔比加入到 HPPS中。在缓和和持续地搅拌HPPS溶液的同时，非常缓慢地加入FITGHPPS-FITC溶液在黑 暗中被孵育，并且反应在4°C下持续8小时。在该反应期间后，HPPS针对Tris-缓冲盐水进行 透析，并且未结合的FITC通过FPLC去除。
[0271] 同时，将近红外荧光探针DIR-B0A核心-加载到具有胆固醇油酸酯的HPPS中，以追 踪货物的命运。HPPS货物被SR-B1+细胞的特异性-摄取通过流式细胞仪，利用基于HDL的竞 争性抑制来量化。每个HPPS成分的亚细胞命运通过共聚焦成像来可视化。通过共聚焦显微 镜产生的三维图像允许定位每个标记的成分的命运，不管它是在细胞的表面还是内部(亚 细胞区室）。
[0272] 图21示出了（DiR-BOA)HPPS对于SR-B1受体的特异性。简单地说，SR-B1阳性和阴性 细胞(分别为ldlA(mSR-Bl))和LDLA7)，每种20，000个，对于LDLA7在Hams F-12介质（1 %青 霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中被培养，并且对于ldlA(mSR-Bl)在Hams F-12和 +300yg/mL G418中被培养。随后这些细胞与(DiR-BOA)HPPS颗粒（1100ng/mL)孵育3小时。在 另外的抑制实验中，细胞暴露于(DiR-BOA)HPPS和HDL(50摩尔过量的；400yg;2.2X10- 4M)。 在3小时孵育后，共聚焦图像显示(DiR-BOA)HPPS在SR-B1阳性细胞（ldlA(mSR-Bl))中的强 摄取，但是在SR-B1阴性细胞(LDLA7)中没有显示。此外，过量的HDL有效抑制(DiR-BOA)HPPS 在ldlA(mSR-Bl)细胞中的摄取。
[0273] 图22示出了在结合至SR-B1后HPPS的每个成分的命运。类似地，20,000个细胞 (ldlA(mSR-Bl)在具有10%胎牛血清的RPM11640细胞培养介质中进行培养。FITC-脂质或 FITC- (-4F) (D i RB0A) HPPS (1100ng/mL)与所述细胞孵育 1 小时。
[0274] 其后，共聚焦成像被用于鉴定与ldlA(mSR-Bl)细胞孵育后FITC-脂质（DiR-BOA) HPPS和FITC-(-4F)(DiR-B0A)HPPS的每个成分的亚细胞定位。发现HPPS可以与SR-B1结合并 将DiR-BOA直接释放到细胞溶质中，而大多数标记的-4F肽和磷脂停留在细胞的表面上。
[0275] 来自HPPS纳米颗粒的DiR-BOA的释放在图23中进一步示出。在ldlA(mSR-Bl)与 (DiR-BOA)HPPS的3小时孵育后，来自DiR-BOA的荧光信号仅在未冲洗的细胞的细胞溶质内 可以观察到。由于DiR-BOA在HPPS的小核心内经历的自我-猝灭作用，因此在细胞外部，对 于DiR-BOA很少到没有信号可以被看到。一旦(DiR-BOA)HPPS结合至SR-B1并在靶细胞中释 放DiR-B0A，DiR_B0A信号的信号强度增加。所述细胞的非常大的胞内体积允许DIR-B0A分子 分散在整个细胞溶质中，并因此克服自我-猝灭作用。
[0276] 流式细胞术研究被用于评价(-4F)(DiR-B0A)HPPS在SR-ΒΓ和SR-ΒΓ细胞系中的摄 取。5X10 5个细胞/孔在12-孔板中被培养2-3天。使用具有10%FBS的RPMI 1640培养基作为 细胞培养基。细胞在各种条件下被处理5小时。FC500被用于测量细胞的荧光强度。
[0277] 为了研究-4F肽对颗粒摄取的影响，在SR-ΒΓ和SR-ΒΓ细胞系中，由DiR_B0A、DMPC 和-4F制备的HPPS与由DiR-BOA和DMPC制备的乳液进行比较。DiR-BOA的最终浓度为1， 100ng/mL 〇
[0278] 图24示出了-4F对于(DiR-BOA)HPPS颗粒的有效细胞摄取的要求。将llOOng/mL的 (DiR-BOA)HPPS的溶液和DiR-BOA的无肽乳液暴露于ldlA(SR-Bl)和LDLA7细胞3小时。细胞 培养实验对于LDLA7在Hams F-12介质（1%青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中进 行，并且对于ldlA(mSR-Bl)在Hams F-12和+300yg/mL G418中进行。在孵育期后，细胞通过 流式细胞仪进行检验。SR-B1阳性细胞(ldlA(mSR-Bl))内在化比DiR-BOA乳液高得多的水平 的(DiR-BOA)HPPS(3 · 5x)。LDLA7 (SR-B1 阴性细胞)摄取最小量的(DiR-BOA)HPPS或乳液。
[0279] 图25示出了 ldlA(mSR-Bl)细胞中-4F(DiR-B0A)HPPS的浓度-依赖性摄取。对于 ldlA(mSR-Bl)，细胞培养实验在0.2mL的Hams F-12和+300yg/mL G418中进行。SR-B1阳性细 胞（ldlA(mSR-Bl)与从13.8到1100ng/mL范围的不同浓度的-4F(DiR-B0A)HPPS孵育3小时。 流式细胞术分析揭示-4F(DiR-B0A)HPPS的摄取与颗粒的孵育剂量成比例。增加量的-4F (DiR-BOA)HPPS 导致增加量的伴随 ldlA(mSR-Bl)细胞的 DiR-BOA。ldlA(mSR-Bl)细胞中-4F (DiR-BOA)HPPS的饱和摄取发生在440ng/mL处。
[0280] HDL以剂量依赖方式抑制（-4F)(DiR-B0A)HPPS的摄取（图26)。对于ldlA(mSR-Bl)， 细胞培养实验在〇.2mL的Hams F-12和+300yg/mL G418中进行。ldlA(mSR-Bl)细胞与HDL和 (-4F) (DiR-BOA)HPPS(摩尔比从0 :1 到50 :1 范围；HDL浓度从9.0 X 10-7到2.2 X 10-4摩尔范 围）孵育3小时。增加浓度的HDL抑制ldlA(mSR-Bl)细胞中（_4F)(DiR_B0A)HPPS摄取，具有增 加的效率。在50:1摩尔过量的HDL处观察到(_4F)(DiR_B0A)HPPS细胞摄取的接近完全的抑 制。这些结果进一步证实(_4F)(DiR_B0A)HPPS的SR-B1介导的摄取。
[0281] 图27进一步示出了（-4F)(DiR-B0A)HPPS在SR-ΒΓ细胞中的选择性摄取，以及该摄 取被HDL的抑制。2X10 4个细胞/孔SR-ΒΓ和SR-ΒΓ细胞在8孔盖玻片室中被培养2-3天。具有 10%FBS的RPMI 1640培养基被用作细胞培养基。在共聚焦研究前1天，所述细胞培养基被变 成没有FBS的RPMI 1640培养基。细胞在各种条件下被处理5小时。
[0282] 扫描共聚焦显微镜也被用于评价细胞中（_4F)(DiR_B0A)HPPS的摄取（图27)。细胞 培养实验对于LDLA7在Hams F-12介质（1%青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中进 行，并且对于ldlA(mSR-Bl)在Hams F-12和+300yg/mL G418中进行。简单地，2.39yg/mL的（-4F) (DiR-BOA)HPPS 与 ldlA(mSR-Bl)和 LDLA7 细胞孵育 3 小时。孵育期后，在 ldlA(mSR-Bl)中 观察到显著的荧光信号，但在LDLA7中没有观察到。在类似的抑制研究中，HDL(50倍过量； 2.2 X 10-4M)与(-4F) (DiR-BOA)HPPS-起孵育。3小时孵育后，在ldlA(mSR-Bl)中没有检测到 荧光，表明HDL完全阻断ldlA(mSR-Bl)中（-4F)(DiR-B0A)HPPS的摄取。在LDLA7细胞中没有 检测到荧光。
[0283] 图28示出了ldlA(mSR-B 1)细胞中（4F和-4F) (DiR-B0A)HPPS摄取的效能。细胞培养 实验对于ldlA(mSR-Bl)在0.2mL的Hams F-12和+300yg/mL G418中进行。14到220ng/mL的 (4F和-4F)(DiR-B0A)HPPS与ldlA(mSR-Bl)细胞孵育3小时。流式细胞术揭示HPPS的两个剂 型均以剂量依赖的方式在ldlA(mSR-Bl)细胞中被摄取。（_4F)(DiR_B0A)HPPS显示出比其4F 对应物稍高的细胞摄取。
[0284] 与-4F形成的（DiR-B0A)HPPS( "（-4F)(DiR-B0A)HPPS"）的体内研究：利用 Maestro系统的体内成像在具有人类KB(SR-BI + )肿瘤异种移植物的裸鼠上进行（图29)。在_ 4F(DiR-B0A)HPPS(5.2nmol;350yL tris-盐水)注射后直到72小时收集光学图像。可以看到 DiR-BOA荧光信号在早到注射后8小时选择性地定位在KB肿瘤异种移植物中。也示出了切除 的器官的荧光图像。
[0285] I.(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(全长EGF作为靶向配体）的体外研究：利用共聚焦显微 镜研究在具有不同EGFR表达水平(A549:高表达，H520 :低表达）的癌细胞上检验(_4F)EGF (DiR-BOA)HPPS的EGFR-靶向特异性。细胞培养实验在0.2mL具有10%胎牛血清(FBS)的RPM1 1640细胞培养介质中进行。简单地说，共聚焦研究在与Ι.ΟμΜ的（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS(这 里表示的浓度和下面的体外和体内试验中的浓度是DiR的浓度)孵育的A549和H520细胞上 进行。图30(a)示出了 A549细胞具有高于H520细胞的（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS摄取。然而，应 当注意，（_4F)(DiR_B0A)HPPS的摄取在A549中比在H520细胞中也明显更高。对于A549和 H520进行多个表面受体蛋白的蛋白质印迹分析（图30(b))。相对于H520细胞，EGFR在A549细 胞中过度表达。SR-B1表达在两个细胞系之间是相当的，而叶酸受体水平与A549相比似乎在 H520中过度表达。
[0286] (-4F)(DiR-B0A)HPPS和（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(l·0μM)与H520、A549和EGFR-GFP-A549细胞孵育3小时。如前所述，细胞培养实验在具有10%胎牛血清(FBS)的0.2mL的 RPM1 1640细胞培养介质中进行。流式细胞术数据表明（_4F)(DiR_B0A)HPPS在所有3种细胞 中相等地被摄取。HDL(400yg)也相等地抑制这些颗粒在这些细胞中的摄取(参见图31)。（_ 4F)EGF(DiR-B0A)HPPS在A549和EGFR-GFP-A549中的摄取大大地超过H520的摄取。HDL的存 在减少但是不消除（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS在三个细胞系中的摄取。（_4F)EGF(DiR_B0A) HPPS在A549和EGFR-GFP-A549细胞中的残余摄取反映了在EGFR/SR-B1阳性细胞中该颗粒的 EGFR介导的摄取。
[0287] 为了确定什么角色SR-B1可以有助于EGF-HPPS的摄取，SR-B1阴性细胞、LDLA7被共 转染有用于EGFR和绿色荧光蛋白（GFP)的基因。该实验去除了SR-B1可以对于EGF-HPPS的细 胞摄取进行的任何贡献。如前所述，细胞培养实验在Hams F-12介质（1%青霉素/链霉素， 2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中进行。在与（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(1.0yM)孵育3小时后， EGFR-GFP-LDLA7细胞显示出在细胞溶质内的DiR-BOA的强信号，而对于EGFR的GFP信号在外 质膜上被可视化（图32)。进行共聚焦研究以评价HDL对（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS在EGFR-GFP-LDLA7细胞中摄取的作用（图33)。如在GFP道中可以看到的，被成功转染有EGFR和GFP 的LDLA7细胞构成性地表达荧光。在用(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(1.0yM)处理后，可以在细胞 内检测到DiRBOA信号（DiR道）。当用（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS处理的期间加入过量的HDL (400yg)时，来自DiRBOA的荧光信号在整个处理的细胞中仍可看到。EGFR-GFP-LDLA7细胞中 (-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS摄取的程度在有或没有HDL竞争的情况下是类似的。因此，HDL对于 EGFR-GFP-LDLA7细胞中（-4F) EGF (DiR-B0A) HPPS的摄取没有影响。这些发现表明EGFR-GFP-LDLA7细胞中（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的特异性EGFR介导的摄取。
[0288] EGFR-GFP-A549 和 H520 细胞与 1.0yM(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS 孵育 3 小时。细胞培养 实验在具有10%胎牛血清(FBS)的0.2mL的RPM1 1640细胞培养介质中进行。3小时孵育期 后，共聚焦成像显示EGFR-GFP-A549细胞中的强荧光（图34)。过量HDL的存在稍微减少这些 细胞中的荧光信号。过量HDL和EGF的组合将EGFR-GFP-A549细胞中的荧光信号显著减少到 类似于在单独的细胞对照中看到的水平。没有H520处理组呈现出DiR-BOA荧光。这表明H520 并不摄取任何（-4F) EGF (D iR-B0A) HPPS。
[0289] 在图35中，（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(l .ΟμΜ)与A549和H520细胞孵育。细胞培养实 验在具有10%胎牛血清(FBS)的0.2mL的RPM1 1640细胞培养介质中进行。在该孵育期期间 还加入HDL(400yg)以消除SR-B1对于摄取过程可能具有的任何贡献。所述细胞在HPPS暴露 后1、3和6小时被监测。在HDL存在的情况下，A549表现出大大高于H529的（-4F)EGF(DiR-BOA)HPPS的摄取，然而，在HDL(插入物)缺乏时，A549和H520之间的荧光信号的差异显著减 少。这些发现表明SR-B1有助于SR-B1/EGFR阳性细胞中（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS的摄取。
[0290] J.(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(作为靶向配体的全长EGF)的体内研究：图36示出了在 (-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(在tris-盐水中的5.2nmol)静脉内注射后多个时间处具有A549和 H520肿瘤异种移植物的裸鼠的体内光学图像。在注射后早期，荧光信号在整个动物中被看 到。到22小时，聚焦信号可以在A549和H520中被看到，而身体的其余部位中的荧光信号极大 地减少。该强荧光信号在整个研究期间保持在A549肿瘤中；然而，到3天，H520肿瘤中的信号 被清除。这些结果表明A5 49肿瘤中的EGFR有助于积聚和保持（-4F) EGF (D i R-BOA) HPP S，而 H520中的摄取是非特异性和短暂的。
[0291] 1(.〇肿瘤异种移植物中（-4?沾6?(0丨1?-8(^)冊?3的体内研究：图374示出了在（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(5.2nmol，tris-盐水中）的i.v.注射后多个时间处具有KB肿瘤异种 移植物的裸鼠的体内光学图像。仅肿瘤组织被DiR-BOA荧光增强，其在48h处达到最大。图 37B中，（-4F) (DiR-BOA)HPPS(HPPS) (5 · 2nmol，tris-盐水中）、（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS (EGF-HPPS) (5 · 2nmo 1，tri s-盐水中）和EGF-HPPS+HDL(5 · 2nmo 1 和0 · 14μπιο 1，tri s-盐水中） 颗粒的生物分布在具有KB异种移植物的小鼠中被评估。生物分布图均显示DiR-BOA在肿瘤 中的高摄取，超过除了肝脏的所有其他正常器官。EGF-HPPS的肿瘤摄取高于HPPS或EGF-HPPS+HDL 的摄取。在图 37C 中，HPPS、（-4F)PEG(DiR-B0A)HPPS(PEG-HPPS)(PEG-HPPS 按照图 3 中描述的方案合成（用1，2_二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）_ 2000 ] (DSPE-PEG(2000)代替EGFp)和EGF-HPPS的循环半衰期在正常裸鼠中进行确定。所有 动物接受tri s-盐水中5.2nmo 1的各自的纳米颗粒的静脉内注射。在纳米颗粒注射前和注射 后的多个时间收集血液样品。DiR-BOA从血液样品提取，并且其荧光在荧光计上进行确定。 循环半衰期被测定为大约14h，与迄今最佳设计的纳米载体相当。最后，图37D示出了具有已 经用红色荧光蛋白稳定转染的双KB肿瘤异种移植物的小鼠。在注射EGF-HPPS (5.2nmo 1， tris-盐水中）后，可以看到，DiR-BOA的荧光与红色荧光蛋白的信号紧密重叠。这些结果表 明EGF-HPPS纳米颗粒可以有效地靶向表达EGFR的肿瘤。
[0292] L.(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的特异性EGFR介导的细胞摄取与非特异性组织积聚的 体内确认
[0293] 具有KB(EGFR+'ve)和H520(EGFR-'ve)肿瘤异种移植物的裸鼠被天然HDL(0.14y 111〇1，杜丨8-盐水中）随后紧接(-4卩迮6卩(0丨1?-8(^)冊?3(5.211111〇1，杜丨8-盐水中）静脉内共注 射。注射后48小时，杀死小鼠，并切除肿瘤。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗组织，然后将40mg 的每个组织用于"组织分析"。类似地，将150mg的每个组织用于"细胞分析"。
[0294] 组织分析。组织样品在roS中被匀化，接着如先前在B部分中（"EGFp(DiR-B0A)HPPS 的体内研究"）描述的进行氯仿；甲醇提取。测量提取物的组织荧光并表示为每单位(mg)组 织的荧光。
[0295] 细胞分析。在匀化后，利用尼龙筛（孔径大小70μπι)过滤样品以去除碎片。随后用 PBS冲洗过滤的样品（释放的细胞)两次，并用红血球裂解缓冲液(0.1 %碳酸氢钾、0.8%氯 化铵、Ο. ImM EDTA)处理10分钟以去除红血球。利用倒置显微镜用血细胞计对细胞计数。其 后，用氯仿：甲醇提取细胞(如上所述）。测量细胞提取物的荧光并表示为每百万个细胞的荧 光。
[0296] 在组织和细胞水平上（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS摄取的比较在图38中示出。当从组 织水平观察时，KB和H520肿瘤异种移植物将(_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS积聚到相等的程度。相 反地，当在细胞水平检查时，KB细胞比H520摄取更高程度(2x)的（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS。
[0297] (-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的组织积聚反映了由于增强的渗透性和保留机制的颗粒 的细胞外诱捕以及上皮细胞中颗粒的胞内摄取的复合。当分离细胞并去除来自胞外因素的 贡献时，出现不同的结果。HPPS的EGFR介导的摄取的较清楚的图片被显示，此外，由于天然 HDL的共注射，SRBI对HPPS摄取的贡献也被最小化。共同地，这些结果证实（-4F)EGF(DiR-BOA)HPPS纳米颗粒的EGFR靶向特异性。
【主权项】
1. 一种非天然存在的肽-脂质纳米支架，包括： a) 至少一种磷脂； b) 至少一种不饱和脂质，优选不饱和固醇酯，进一步优选不饱和胆固醇酯，进一步优选 胆固醇油酸酯；以及 c) 至少一种肽，所述肽包括能够形成至少一个两亲性α-螺旋的氨基酸序列，其中，所述 至少一个两亲性α-螺旋或肽的长度在6到30个氨基酸之间； 其中，使成分a)、b)和c)结合以形成结合至革El细胞上的SR-Bl的肽-磷脂纳米支架。2. 根据权利要求1所述的肽-脂质纳米支架，进一步包括： d) 至少一种归巢分子，并且 其中，使成分a)、b)、c)以及d)结合以形成所述肽-磷脂纳米支架。3. 根据权利要求2所述的肽-脂质纳米支架，其中，所述至少一种归巢分子共价结合至 所述至少一种磷脂。4. 根据权利要求2所述的肽-脂质纳米支架，其中，所述至少一种归巢分子共价结合至 所述至少一种肽。5. 根据权利要求4所述的肽-脂质纳米支架，其中，所述至少一种归巢分子在所述两亲 性α-螺旋的亲水面与疏水面之间的过渡处或附近在氨基酸处结合至所述肽。6. 根据权利要求5所述的肽-脂质纳米支架，其中，结合至所述归巢分子的所述肽的氨 基酸选自由赖氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸组成的组，优选赖氨酸。7. -种药物剂型，包括根据权利要求1-6中任一项所述的非天然存在的肽-脂质纳米支 架。8. -种制备根据权利要求1所述的非天然存在的肽-脂质纳米支架的方法，包括在适于 形成所述肽-脂质纳米支架的条件下结合成分a)_e)。9. 一种非天然存在的肽-脂质纳米支架，包括： a) 至少一种磷脂； b) 至少一种不饱和脂质，优选不饱和固醇酯，进一步优选不饱和胆固醇酯，进一步优选 胆固醇油酸酯； c) 至少一种肽，所述肽包括能够形成至少一个两亲性α-螺旋的氨基酸序列，其中，所述 至少一个两亲性α-螺旋或肽的长度在6到30个氨基酸之间；以及 d) 至少一种活性剂，所述活性剂包括双链RNA; 其中，使成分a)、b)、c)以及d)结合以形成所述肽-磷脂纳米支架;并且其中，所述肽-磷 脂纳米支架结合至祀细胞上的SR-Bl并且其中所述活性剂在所述纳米颗粒结合至SR-Bl之 后被释放到所述靶细胞的细胞溶质中。10. 根据权利要求1所述的肽-脂质纳米支架在制备用于预防或治疗与SR-Bl受体的表 达相关的疾病的药物中的应用，所述肽-脂质纳米支架进一步包括治疗剂，并且其中所述疾 病是可用所述治疗剂预防或治疗的。
【文档编号】A61K47/48GK105903029SQ201610245387
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2008年12月12日
【发明人】郑岗, 张智红, 艾安·科尔宾, 陈涓
【申请人】大学健康网络