用于治疗白血病的联合用药物及其在治疗白血病中的应用
【专利摘要】本发明属于药物领域，公开了一种用于治疗白血病的联合用药物及其在治疗白血病中的应用。本发明将组蛋白去乙酰化酶3抑制剂和临床急性髓系白血病常用化疗用药物联合使用，可显著增加新发白血病和难治复发白血病的治疗完全缓解率，并可以更有效地逆转难治复发白血病细胞对化疗药物的敏感性。
【专利说明】
用于治疗白血病的联合用药物及其在治疗白血病中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及药物领域，具体涉及用于治疗白血病的联合用药物及其在治疗白血病中的应用。
【背景技术】
[0002]急性髓系白血病是一种常见血液系统恶性疾病，具有起病急骤、临床表现凶险、预后较差等特点，对于生命健康有着极大的威胁。
[0003]目前临床实践中，针对急性髓系白血病常采用以阿糖胞苷联合一种蒽环类抗生素为主的化疗方案。阿糖胞苷是嘧啶类抗代谢药物，通过抑制细胞中DNA的合成，引起DNA损伤，从而使肿瘤细胞死亡。蒽环类抗生素是II型DNA拓扑异构酶抑制剂，可以使DNA产生双链断裂，导致DNA损伤。此外还有一些在此基础上进行改进的化疗方案。但是就目前而言，尽管约60%的急性髓系白血病患者在接受常规化疗后可获得临床完全缓解，其中大部分患者仍会在治疗后复发。白血病患者一旦复发，其体内的肿瘤细胞对原先化疗方案的敏感性就显著降低，并且复发后再次造血干细胞移植的疗效也极差，其结果就是复发的白血病迅速进展，导致患者死亡。此外，常规的化疗方案并不能清除患者体内具有干性的白血病细胞(即白血病干细胞)。数次疗程的化疗只是将患者体内对化疗药物敏感的白血病细胞杀死，而那些具有很强的耐药性的白血病干细胞则通过药物筛选留存下来。因此，经过多次化疗后，白血病患者往往会对常规的化疗方案产生耐受，进展为难治性白血病。难治性白血病的化疗敏感性极差，且容易复发，是白血病临床治疗的难题。
[0004]鉴于此，有必要探索新的治疗方案，对于新发白血病，可以有效的清除患者体内的白血病干细胞;而对于耐药的难治复发白血病，可以有效逆转白血病细胞耐药，增加化疗的完全缓解率，为后续治疗提供条件。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，为改善目前常用化疗方案对白血病治疗效果的不足，提供了一种新的治疗白血病的方案，该方案可显著增加新发白血病和难治复发白血病的治疗完全缓解率，并可以更有效地逆转难治复发白血病细胞对化疗药物的敏感性。
[0006]为此，本发明一方面提供了一种用于治疗白血病的联合用药物，该药物包括组蛋白去乙酰化酶3抑制剂和白血病常规化疗用药物。
[0007]在本发明优选的实施方案中，白血病常规化疗用药物为阿糖胞苷或者阿霉素。
[0008]在本发明另一优选的实施方案中，组蛋白去乙酰化酶3抑制剂为RGFP966或丙戊酸钠(VPA) 0
[0009]在本发明进一步优选的实施方案中，组蛋白去乙酰化酶3抑制剂为口服制剂，白血病常规化疗药物为静脉注射针剂。所述口服制剂更加优选为胶囊或片剂。
[0010]本发明再一方面提供了本发明所述的联合用药物在制备治疗白血病的药物中的应用，其中白血病优选为急性髓系白血病。
[0011]在本发明优选的实施方案中，白血病优选为复发性、难治性或药物耐受性白血病。
[0012]在本发明进一步优选的实施方案中，组蛋白去乙酰化酶3抑制剂为口服制剂，白血病常规化疗药物为静脉注射针剂。所述口服制剂更加优选为胶囊或片剂。
[0013]在本发明更加优选的实施方案中，在本发明所述的联合用药物或者应用中，组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966的用量为口服每天50_500mg ；丙戊酸钠的用量为口服每天500-3000mg;白血病常规化疗药物阿糖胞苷静脉注射的常规剂量为每天20-250mg，连续用药5-14天，或大剂量每天l-6g，连续用药3天;阿霉素静脉注射的用量为每天20-90mg，连续用药3天。
[0014]由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
[0015]1、虽然，现有的实验已经证实了组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有抗肿瘤的效应，并且FDA已经批准了几种组蛋白去乙酰化酶抑制剂用于肿瘤治疗。但是，目前组蛋白去乙酰化酶抑制剂主要用于淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗，对于白血病、尤其是急性髓系白血病的临床效用并不清楚。本发明首次探究了组蛋白去乙酰化酶3抑制剂在急性髓系白血病中的抗肿瘤效应。
[0016]2、本发明的细胞实验表明，尽管在单独使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂的条件下，白血病细胞的增殖和凋亡无明显改变;但是将阿糖胞苷或者阿霉素与组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合使用，则可显著诱导白血病细胞发生凋亡，该凋亡诱导效应比单一使用任何一种药物均要显著。
[0017]3、本发明采用MLL-AF9白血病小鼠模型，探究了组蛋白去乙酰化酶抑制剂与化疗药物联合使用的体内效果。实验结果表明，联合使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂和化疗药物可以显著延长小鼠的生存期，对小鼠体内白血病细胞的扩增具有更明显的抑制效应。
[0018]综上所述，本发明提供了一种新的治疗白血病的方案，即将组蛋白去乙酰化酶3抑制剂和临床急性髓系白血病常用化疗用药物联合使用，该方案可显著增加新发白血病和难治复发白血病的治疗完全缓解率，并可以更有效地逆转难治复发白血病细胞对化疗药物的敏感性。
【附图说明】
[0019]图1:白血病细胞株K562耐阿霉素细胞不同处理方式下的凋亡情况图。
[0020]图2:白血病细胞株THP-1细胞不同处理方式下的凋亡情况图。
[0021]图3:白血病细胞株K562耐阿霉素细胞及使用对照病毒或HDAC3特异敲低病毒感染后，对阿霉素IC50的柱状图。
[0022]图4:不同方式处理后，MLL-AF9白血病小鼠的白血病细胞凋亡百分比柱状图。
[0023 ] 图5:不同处理组MLL-AF9 二次移植小鼠的生存曲线图。
[0024]?:对照组；■:化疗组；▲: VPA处理组；?:化疗联合VPA处理组。
[0025 ] 图6:不同处理组MLL-AF9 二次移植小鼠不同时间点外周血白细胞计数曲线图。
[0026]#:对照组；■:化疗组；▲: VPA处理组；T:化疗联合VPA处理组。
[0027]图7:不同处理组MLL-AF9二次移植小鼠骨髓MLL-AF9阳性细胞数柱状图。
[0028]图8:不同处理组MLL-AF9二次移植小鼠脾脏变化图。
[0029]左:MLL_AF9阳性细胞数柱状图；
[0030]中:脾脏重量柱状图；
[0031 ]右:脾脏解剖标本示意图。
[0032]图9:不同处理组MLL-AF9 二次移植小鼠外周血MLL-AF9阳性细胞数。
【具体实施方式】
[0033]下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0034]实施例1:靶向敲低组蛋白去乙酰化酶3可增强阿霉素对K562耐阿霉素细胞的凋亡诱导效应。
[0035]本实施例采用小发夹RNA(shRNA，其载体为pLVX-shRNA2，购于Clontech公司)敲低K562耐阿霉素细胞(细胞购于中国医学科学院血液病医院血液学研究所)(以下简称KA细胞)中组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)的表达，并用蛋白印迹技术验证敲低效率。
[0036]以2X105/ml的密度重悬细胞，采取不同的处理方式，然后于24小时、48小时和72小时收集细胞，使用Annexin V-APC单染法流式检测阳性细胞(即凋亡细胞)的比例。
[0037]各处理组分别为KA细胞组，KA细胞HDAC3敲低组，KA细胞HDAC3敲低并使用0.5yg/ml阿霉素处理组，KA细胞HDAC3敲低并使用1.0yg/ml阿霉素处理组，KA细胞HDAC3敲低并使用2.0yg/ml阿霉素处理组。
[0038]Annexin V-APC染色方案如下:(I)收集单细胞悬液，离心并用冰冷I3BS清洗细胞2遍；(2)取1\105细胞重悬于10(^1 IXbinding buffer中，加入Annexin V-APC 2μ1;⑶室温避光孵育15分钟，然后加入300μ1 IXbinding buffer，流式检测。
[0039]检测结果如说明书附图1所示。其中附图1(A)从左至右分别为对照组，HDAC3敲低组，HDAC3敲低并使用0.5yg/ml阿霉素处理组，HDAC3敲低并使用1.0yg/ml阿霉素处理组，HDAC3敲低并使用2.0yg/ml阿霉素处理组。从上至下分别为24小时，48小时和72小时处理组。附图1(B)中的柱状图表示各处理方式下细胞凋亡的变化。
[0040]从说明书附图1可以看出，敲低KA细胞中的HDAC3，可增高不同浓度下阿霉素所引起的KA细胞凋亡。因此，HDAC3敲低可增加KA细胞对阿霉素的敏感性。
[0041 ]实施例2:靶向抑制组蛋白去乙酰化酶3可增强阿糖胞苷对THP-1细胞的凋亡诱导效应。
[0042]本实施例以2 X 105/ml的密度重悬THP-1细胞(细胞购于中科院细胞库)，采取不同的处理方式，然后于24小时和48小时收集细胞，使用Annexin V-FITC/PI双染法流式检测阳性细胞(即凋亡细胞)的比例。
[0043]各处理组分别为对照组，阿糖胞苷(以下称为Ara-c)处理组，RGFP966(HDAC3特异性抑制剂)处理组，Ara-c和RGFP966联合处理组。其中Ara-c浓度为5μΜ，RGFP浓度为2μΜ。
[0044]Annexin V-FITC/PI染色方案如下:(I)收集单细胞悬液，离心并用冰冷I3BS清洗细胞2遍；(2)取I X 15细胞重悬于ΙΟΟμΙ IXbinding buffer中，加入Annexin V-FITC和PI各2μ1;(3)室温避光孵育15分钟，然后加入300μ1 IXbinding buffer，流式检测。
[0045]检测结果如说明书附图2所示。其中附图2(A)从左至右分别为对照组，Ara-c处理组，RGFP966处理组，Ara-c和RGFP966联合处理组。从上至下分别为24小时和48小时处理组。附图2(B)中的柱状图表示各处理方式下细胞凋亡的变化。
[0046]从说明书附图2可以看出，单独使用Ara-c或者RGFP966对THP-1细胞并无明显的凋亡诱导效应，但是联合使用Ara-c和RGFP966时，THP-1细胞发生明显凋亡。
[0047]实施例3:靶向敲低组蛋白去乙酰化酶3可增加KA细胞对阿霉素的敏感性。
[0048]本实施例中，KA细胞及采用对照病毒或HDAC3特异敲低病毒感染后，使用CCK-8试剂盒(试剂盒购于东仁化学科技(上海)有限公司)检测阿霉素对各细胞的IC50值(半数抑制率)。
[0049]以下是CCK-8检测细胞存活和增殖的原理:CCK_8试剂中含有WST-8，它可以在细胞线粒体脱氢酶的作用下还原为高度水溶性黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比。然后用酶联免疫检测仪检测在450nm波长处的吸光度值(A)，即可反映活细胞的数量。
[0050]取对数生长期细胞，调整浓度，以每孔2 X 14个细胞接种于96孔板，体积为90μ1。并设置调零孔(只加入ΙΟΟμΙ的培养基；由于使用的阿霉素有自发荧光，因此当实验涉及阿霉素时，调零孔为90μ1培养基+10μ1相应浓度的阿霉素)、对照孔(细胞、药物溶解介质、培养液共90μ1)和不同浓度加药组(每种浓度设置3个复孔，KA和KA vector组的药物浓度分别为
10、20、30、40、50、60、70、80yg/ml，KA shHDAC3组的药物浓度为0.5、1、2、3、4、5、6、8、1yg/ml)，每孔体系为ΙΟΟμΙ。在实验孔周围一圈空白孔加入ΙΟΟμΙ的无菌roS，防止培养过程中细胞液蒸发，干扰实验结果。37 0C继续培养。48小时后每孔加入10μ1 CCK-8试剂，继续培养4h，完全显色后，用酶标仪于450nm处检测每孔的吸光度(A)值。每3个孔取均值，结果以细胞抑制率表示:抑制率(％) = 100-(A样品-A空白)/(A对照-A空白)X 100%。并使用软件计算出IC50 值。
[0051]检测结果如说明书附图3所示。从说明书附图3可以看出，靶向敲低HDAC3后，KA细胞对阿霉素的敏感性升高。
[0052]实施例4:组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠可增强阿糖胞苷对MLL-AFWJ、鼠白血病细胞的凋亡诱导效应。
[0053]本实施例中，首先建立MLL-AF9融合基因白血病小鼠模型。
[0054]具体方法如下:处死6-8周龄的C56BL/6小鼠(小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司)，分离两侧股骨和胫骨。将股骨和胫骨置于培养皿中，用注射器吸取含2%胎牛血清的DMEM培养基将骨髓吹出，并反复吹打数次，得到单个骨髓细胞悬液，然后用70微米滤网滤过细胞悬液。将骨髓细胞悬液离心，收集沉淀。将所得到的骨髓细胞用磁珠分选缓冲液重悬，计数细胞量，然后加入适量的抗小鼠CDl 17磁珠，于冰上孵育20分钟，每5分钟震荡混匀。然后加入30毫升磁珠分选缓冲液清洗，离心得到细胞沉淀。用0.5-1毫升磁珠分选缓冲液重悬细胞，进行磁珠分选，富集得到CD117阳性的骨髓细胞。离心后用完全培养基重悬(完全培养基成分:20 %胎牛血清，5 % WEH1-3B细胞培养上清，I X青霉素_链霉素，I X谷氨酰胺，100ng/ml小鼠干细胞因子，10ng/ml小鼠白介素3，10ng/ml小鼠白介素6，用IMDM补足)。用表达MLL-AF9的逆病毒细胞进行感染，24小时候重复感染一次。将细胞经小鼠尾静脉注入经过致死剂量(800cGy)辐照的C57BL/6小鼠体内。每周检测外周血表达绿色荧光蛋白的白细胞比例，用于判断小鼠白血病的发病情况，作为第一代MLL-AF9白血病小鼠。
[0055]当受体C57BL/6小鼠外周血绿色荧光蛋白阳性细胞比例达到80%左右时，表明已经是白血病发病末期。将小鼠处死，分离两侧股骨和胫骨中的白血病细胞，并用完全培养基以I X1Vml密度重悬细胞，采用不同的处理方式，然后于48小时收集细胞，使用AnnexinV-PE/7-AAD双染法流式检测阳性细胞(即凋亡细胞)的比例。各组分别为对照组，Ara-c处理组，丙戊酸钠(VPA，一类HDAC抑制剂)处理组，Ara-c和VPA联合处理组。Ara-c浓度为5nm，VPA浓度为0.2mM。
[0056]检测结果如说明书附图4所示。从说明书附图4可以看出，单独使用Ara-c或者VPA对MLL-AFWj、鼠白血病细胞并无明显的凋亡诱导效应，但是联合使用Ara-c和VPA时，细胞发生明显凋亡。
[0057]实施例5:组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠联合化疗对白血病有显著治疗效应。
[0058]本实施例中，分离第一代MLL-AF9白血病小鼠的白血病细胞，经尾静脉注入经过非致死剂量(400cGy)辐照的C57BL/6小鼠体内，构建为第二代MLL-AF9白血病小鼠模型。移植I周后将小鼠分组，分别采取不同的处理方式:对照组(用?表示，小鼠数量为15只)，化疗组(小鼠给予阿糖胞苷和阿霉素处理，用■表示，小鼠数量为15只)，VPA处理组(小鼠给予VPA处理，用▲表示，小鼠数量为15只)，化疗联合VPA组(小鼠给予阿糖胞苷，阿霉素和VPA共同处理，用?或▼表示，小鼠数量为15只)。给药剂量和时间为:阿糖胞苷100mg/kg X 5天，阿霉素3mg/kgX3天，VPA 300mg/kgX5天。
[0059]说明书附图5显示了检测各组小鼠的生存情况。如图5所示，与对照组相比较，VPA处理可以轻微延长小鼠的生存期，但是无明显统计学差异。化疗可以显著延长小鼠的生存期，而化疗和VPA联合可进一步显著延长生存期。
[0060]说明书附图6显示了移植后每周监测外周血白细胞的数量，其中每组包含5只小鼠。如图6所示，化疗可以降低外周血白细胞的数量，而化疗和VPA联合可进一步降低外周血白细胞的数量。
[0061]移植后21天，处死部分白血病小鼠，分离小鼠的左右股骨和肱骨中的骨髓细胞，计数骨髓细胞中MLL-AF9阳性白血病细胞的数量，其中每组包含3只小鼠。如图7所示，化疗和VPA联合组小鼠骨髓中MLL-AF9阳性的白血病细胞数量显著低于其他各组。
[0062]移植后21天，处死部分白血病小鼠，分离小鼠的脾脏，拍照并称量脾脏的重量，计数脾脏中MLL-AF9阳性白血病细胞的数量，其中每组包含3只小鼠。如图8所示，化疗和VPA联合组小鼠脾脏中MLL-AF9阳性的白血病细胞数量显著低于其他各组，并且脾脏的重要和体积也更接近于正常。
[0063 ] 移植后21天，计数外周血中MLL-AF9阳性白血病细胞的数量，其中每组包含5只小鼠。如图9所示，化疗和VPA联合组小鼠外周血MLL-AF9阳性的白血病细胞数量显著低于其他各组。
【主权项】
1.一种用于治疗白血病的联合用药物，所述药物包括组蛋白去乙酰化酶3抑制剂和白血病常规化疗用药物。2.根据权利要求1所述的联合用药物，其中白血病常规化疗用药物为阿糖胞苷或阿霉素。3.根据权利要求1或2所述的联合用药物，其中组蛋白去乙酰化酶3抑制剂为RGFP966或丙戊酸钠(VPA)。4.根据上述权利要求任一项所述的联合用药物，其中组蛋白去乙酰化酶3抑制剂为口服制剂，白血病常规化疗药物为静脉注射针剂。5.根据权利要求4所述的联合用药物，所述口服制剂为胶囊或片剂。6.上述权利要求任一项所述的联合用药物在制备治疗白血病的药物中的应用，其中白血病优选为急性髓系白血病。7.根据权利要求6所述的应用，其中白血病是复发性、难治性或药物耐受性白血病。8.根据权利要求6或7所述的应用，其中组蛋白去乙酰化酶3抑制剂为口服制剂，白血病常规化疗药物为静脉注射针剂。9.根据权利要求8所述的应用，所述口服制剂为胶囊或片剂。10.根据权利要求1-5中任一项所述的联合用药物，或者权利要求6-9中任一项所述的应用，其中组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966的用量为口服每天50-500mg;丙戊酸钠的用量为口服每天500-3000mg;白血病常规化疗药物阿糖胞苷静脉注射的常规剂量为每天20-250mg，连续用药5-14天，或大剂量每天l-6g，连续用药3天;阿霉素静脉注射的用量为每天20-90mg，连续用药3天。
【文档编号】A61K45/06GK105920604SQ201610403985
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】龙俊, 胡炯, 李军民, 郑仲征
【申请人】上海荻硕贝肯生物科技有限公司