表面活性非酶促蛋白质用于织物洗涤的应用的制作方法

专利名称：：表面活性非酶促蛋白质用于织物洗涤的应用的制作方法表面活性非膝&蛋白质用于织物洗涤的应用本发明涉及界面活性非酶促蛋白质在织物洗涂中的应用。本发明还涉及用于织物洗涤的含有界面活性非酶促蛋白质的洗涤组合物，以及利用此类蛋白质洗涤的方法。目前，织物洗涤只能在相对高的温度下4吏污垢，特别是疏水性的污渍的清除达到令人满意的程度。在中等温度特别是室温下，对于改善洗涤性能仍然有巨大的需求。根据现有技术，特别是用表面活性剂和脂解酶可以实现疏水性污渍的清除。原则上已知使用i^蛋白质作为洗涤组合物的添加剂。特别是蛋白酶被用于洗涤组合物，而且使用淀粉酶、纤维素酶或脂肪酶的使用也是已知的。更详细的细节参见，例如，R6mppChemie-Lexikon，在线版，2.6版，Georg-Thieme画Verlag，Stuttgart,NewYork,2005年2月中的"Waschmittel-酶"[洗潦组合物酶J。还已知蛋白质可以用于将洗涤助剂(例如固定剂、UV保护剂、加香物质或污垢分离助剂)固定在纤维上。为此目的，WO98/00500^5^开了纤维素酶、纤维素酶f;t生物或纤维素样蛋白质的用途，为此目的WO01/46357公开了具有纤维素结合位点和其它化合物结合位点的融合蛋白。界面活性蛋白质在原则上是已知的。一类具有特别强表面活性的蛋白质是即所谓的"疏水蛋白"。疏水蛋白具有显著的界面亲和力，因此适合用于包净it^面。例如，通过用疏水蛋白包被特氟隆(Teflon)的表面，可以使特氟隆亲水化。疏水蛋白是有约100-150个氨基酸的小蛋白质，其特征是丝状真菌，例如裂褶菌(Schizophyllumcommune)。它们通常具有8个半脱氛酸单元。疏水蛋白可以首先从天然来源分离。但是，它们也可以通过遗传工程的方法获得。我们的在先申请PCT/EP2006/0507197〉开了疏水蛋白的此类制备过程。现有技术已经提出了疏水蛋白用于多种用途中的应用。WO96/41882提出疏水蛋白的以下用途，其作为乳化剂、增稠剂、表面活性物质，用于使旒7jC表面亲7jC化、改善亲水底物的防水性、制备水包油乳状液或油包水乳状液。此外，提出了例如生产软膏剂或乳膏剂的制药用途，和例如皮肤保护或生产洗发香波或洗发液的化妆品用途。EP1252516公开了使用含有疏水蛋白的溶液在30°C-80。C的温度下包4皮窗户、隐形眼镜、生物传感器、医疗i文备、用于进行测试或储存的容器、船体、固体颗粒或交通工具的框架或底盘。WO03/53383公开了疏水蛋白在化妆品用途中用于处理角蛋白材料的应用。WO03/10331公开了疏水蛋白包被的传感器(例如检测电极)，其上以非共价的方式结合其它物质，例如电活性物质、抗体或酶。到目前为止，还没有关于界面活性非酶促蛋白质，特别是疏水蛋白，作为洗涤组合物的污垢分离添加剂用途的描述。别对于低温洗涤的情形中洗涤性能的改善是显著的。因此，已经发现了界面活性非a蛋白质用于织物洗涤中的应用。在本发明的第二个方面，发现了包含界面活性非酶促蛋白质的洗涤组合物。在本发明的第三个方面，发现了在包含界面活性非i^l蛋白质的洗涤液中洗涤的方法。在该方法的特定实施方案中，洗涤在不超过60。C的温度下进行。在发明的特别优选的实施方案中，界面活性非酶促蛋白质在每种情形中是疏水蛋白。已经令人惊奇的发现，洗涤液中添加界面活性非白质显著增强了洗涤作用。特别令人惊奇的是，甚至在低的洗涤温度而且甚至在使用非常少量的蛋白质的情况下，仍然具有这一效应。例如，发现即使在洗涤液中蛋白质浓度仅仅约2.5ppm,结合常规洗涤组合物，在仅25。C的洗涤温度下，洗涤作用仍增强了高达8%。除了增强污垢分离作用以外，还观察到对有色油污的防变灰作用(graying-inhibiting)。在洗涤过程中可以从织物上脱离的疏水性污渍会以细小的分离形式重新沉积到衣物上，导致因此变灰或变色。基于白色或淡色织物的性质，该效应在所述白色或淡色织物中特别显著。特别是当表面活性剂和助洗剂系统处于低剂量时会出现该问题。与不添加界面活性非酶促蛋白质洗涤的织物相比，本发明的添加所述蛋白质降低了这一再沉积，因此改善了洗涤的织物的白度。发明的具体细节如下为了进行本发明，使用了界面活性非,蛋白质。术语"非酶促"用来表示优选的不具有或至少没有明显的酶促作用的蛋白质。术语"界面活性"用来表示使用的蛋白质具有影响界面性质的能力。所讨论界面可以是固体-固体、固体-液体、固体-气体、液体-液体或液体-气体界面。特别的，它们可以是固体-液体或液体-液体界面。对于固体-液体界面的情况，所述性质可以是，例如，固体界面的亲水性或疏水性，其会在使用的蛋白质的影响下发生改变。亲水性或疏水性的改变可以以已知的方式，通过测量在包被和未包被表面上水滴的接触角来测量。其它的界面性质是液体表面张力的改变，可以通过已知方法测量。为了进行本发明，优先使用即使在低浓度下也是界面活性的蛋白质。合适的蛋白质特别是那些即使在0.05至50ppm浓度下也具有显著界面活性性质的蛋白质。在本发明优选的实施方案中，使用的蛋白质的特征是在室温下用于玻璃表面后，与水滴和未包被的玻璃表面的接触角相比，具有导致等大水滴(5nl)的接触角增加至少20。的性质。优选使用接触角增加了至少25°(更优选至少30°)的蛋白质。对接触角的测量是本领域技术人员原则上已知的。例如适用于测量接触角的方法的确切实验条件详细的叙述在实验部分中。在本发明特别优选的实施方案中，使用的蛋白质是疏7JC蛋白。在本发明的上下文中，术语"疏水蛋白"在下文中表示具有通用结构式(I)的多肽Xii-C1-Xi-so-GF-Xo^srC^-Xi—it-G4-Xi.ioo~C5-Xi，so"C^-)Q)-s倫G7-X，搶G8-Xffl〖1)其中X可以是20个天然存在的氨基酸(Phe，Leu，Ser，Tyr，Cys，Trp,Pro,His,Gln，Arg，Ile，Met，Thr，Asn，Lys，Val，Ala，Asp，Glu，Gly)中的任一个。在式中，x基团可以各自是相同或不同的。x旁边的指lblL各自特定部分序列x的氨基酸数目，c是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，其中至少四个C标注的残基是半胱氨酸，指数n和m各自独立为0至500之间自然数，优选的在15至300之间。式(I)的多肽的特征在于以下性质即分别与水滴和未包被的玻璃表面的接触角相比，在室温下包被玻璃表面后，所述肽使等大水滴的接触角增加至少20°,优选的至少25°,更优选的30。。用d至C8标注的g酸优选的是半胱氨酸；但是，它们也可以用其他有相似空间充满(space-filling)的M酸代替，优选的是丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸。但是，在C^至CS的位置中的至少4个，优选的至少5个，更优选的至少6个和特别是至少7个应该由半胱氨酸组成。在发明的蛋白质中，半胱氨酸或者以还原的形式存在，或者与另一个形成二硫键。特别优选的是导致C-C桥的分子内形成，特别是其具有至少l个分子内二硫键，优选2个，更优选3个和最优选4个分子内二硫键。在上述将半胱氨酸换成具有相似空间充满的氛基酸的情况下，此类C位置有利地成对更换，它们可以彼此形成分子内二硫键。如果在X标注的位置也使用半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲疏氨酸或苏氨酸，在通式的各个C位置的编号方式可以相应的改变。优先的4吏用通式(II)的疏水蛋白来进行本发明Xn-C1-X3_25-C2-Xo<2-C3-X5"50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-Xo-2-C乙X3—35-C8-Xm(II)其中X、C和在X和C旁边的指数各自如上定义，指数n和m各自为0至350之间的数，优选从15至300，此外，蛋白质还具有上文说明过的改变接触角的特征，并且另外至少6个用C标注的残基是半胱氨酸。更优选的，所有的C残基都是半胱氨酸。特别优选的是使用通式(III)的疏水蛋白其中X、C和X旁边的指数各自定义如上，指数n和m各自为0至200之间的数，此外，蛋白质还具有上文说明过的改变接触角的特征，并且至少6个用C标注的残基是半胱氨酸。更优逸的，所有的C残基都是半胱氨酸。Xn和Xm残基可以是还天然连接了疏水蛋白的肽序列。但是，所述残基之一或二者也可以是天然没有连接疏水蛋白的肽序列。这也理解为表示那些Xn和/或Xm残基，其中在疏7jC蛋白中天然存在的肽序列由疏7jC蛋白中非天然存在的肽序列延长。如果Xn和Xm是没有天然结合疏水蛋白的肽序列，上述序列通常长为至少20，优选至少35，更优选至少50以及，例如至少100个氨基酸。序列可以是，例如从20至500，优选从30至400和更优选的从35至100个氨基酸的序列。此类没有天然结合疏水蛋白的残基在下文中也是指融合配偶体(fusionpartner)。这用于表示蛋白质可以由至少一个疏水蛋白部分和融合配偶体部分组成，而二者不以该形式天然共存。融合配偶体部分可以选自多种蛋白质。还可以只有单个融合配偶体与疏水蛋白部分结合，或者还可以有多个融合配偶体与一个疏水蛋白部分结合，例如在疏水蛋白部分的氨基端(Xj和氛基端(Xm)。但是，还可以，例如，两个融合配偶体与本发明蛋白质的一个位置(Xn或Xm)连接。特别合适的融合配偶体是在微生物(特别是在大肠杆菌(E.coli)或枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)中天然存在的蛋白质。此类融合配偶体的实例M列yaad(SEQIDNO:15和16)，yaae(SEQIDNO:17和18)，以及硫氧还蛋白。非常合适的还有这些序列的片段或衍生物，其包括仅一部分(例如70至99%，优选的5至50%和更优选的10至40%)的上述序列，或其中与所述序列相比改变了单个氨基酸或核苷酸，在这种情况下百分比各自基于氨基酸的数目。在更优选的实施例中，融合疏水蛋白，以及上述的融合配偶体，作为Xn或Xm基团或作为此类基团的末端成分，也具有所谓的亲和结构域(亲和标记物/亲和尾部)。在原则上已知的方式中，这包括可以与特定互补基团相互作用和可以用于更简单的蛋白质操作和纯化的锚定基团。此类亲和结构域的实例包括(His)k、(Arg)k、(Asp)k、(Phe)k或(Cys)k基团，其中k通常是从1至10的自然数。优选是(His)k基团，其中k是从4到6。在上述情况下，Xn和/或Xm基团可以仅由此类亲和结构域组成，或者天然或非天然结合了疏水蛋白的Xn或Xm基团由末端亲和结构域延长。被修饰，例如通过糖基化、乙酰化或者通过化学交联，例如用戊二醛。根据发明使用的疏水蛋白及其衍生物的一个性质是当用所述蛋白质包净錄面时表面性质的改变。表面性质的改变可以被实验测定，例如，通过测量用蛋白质包被表面前后水滴的接触角，并且测定两次测量的差异。进行接触角测量是本领域技术人员原则上已知的。测量基于室温，5fi1的水滴，并使用玻璃板作为底物。用于测量接触角的合适方法的实例的确切实验条件在实验部分给出。在其提及的条件下，根据发明使用的融合蛋白质具有以下性质即在每种情形中与等大水滴和未包被的玻璃表面的接触角分别相比，将接触角增加至少20。，优选的至少25°,更优选的至少30。。用于进行本发明的特别优选的疏水蛋白是疏水蛋白的dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2类型，其结构特征是下面列出的序列。它们也可以只是所述蛋白质的部分或其衍生物。还可以是多种疏水蛋白部分，优选的是2或3个相同或不同的结构，它们彼此结合且与天然不结合疏水蛋白的对应的适当多肽序列结合。根据发明还特别合适的是融合蛋白质yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA國his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa画basfl-his(SEQIDNO:24)(其中多肽序列在括号中说明)，以及编码其的核酸序列，特别是根据SEQIDNO:19、21、23的序列；更优选的，可以4吏用yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)。从SEQIDNO.20、22或24显示的肽序列开始，通过交换、插入或删除至少1个到10个，优选5个氨基酸，更优选的所有M酸的5%而产生的，但仍具有起始蛋白质至少50%程度的生物学性质的蛋白质，也是特别优选的实施方案。蛋白质的生物学性质在本文理解为表示接触角改变至少20。，其在前文已做描述。特别适合进行本发明的衍生物是从yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa画rodA画his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)，通过截短yaad融合配偶体衍生的残基。使用截短的yaad残基，而非完整的具有294个氨基酸的yaad融合配偶体(SEQIDNO:16)，是有利的。但是截短的残基应该包含至少20个，更优选的至少35个氩基酸。例如，可以使用的截短的基团具有从20至293，优选的从25至250，更优选的从35至150以及，例如从35至100个氨基酸。此类蛋白质的一个实例是yaad40-Xa-dewA-his(SEQIDNO:26)，其具有截短至40个氮基酸的yaad残基。可以利用在疏水蛋白与一个或多个融合配偶体之间的裂解位点，来释放纯的、非衍生形式的疏水蛋白(例如，通过在甲硫氨酸上的BrCN裂解、Xa因子裂解、肠激酶裂解、凝血酶裂解、TEV裂解，等)。还可以从一个融合配偶体(例如yaad或yaae)接连产生融合蛋白质，以及大量的疏7JC蛋白(甚至是不同的序列的疏水蛋白)，例如DewA-RodA或Sc3-DewA，Sc3-RodA。同才羊可以4吏用疏水蛋白片段(例如N-或C-端截短)或具有达70%同源性的突变蛋白质。在每种情况下才艮据特定的应用，即待分离的液相，选择最佳构建体。根据发明使用的用于织物洗涤的疏水蛋白，可以通过已知的肽合成的方法化学制备，例如通过Merrifield固相合成。天然存在的疏水蛋白可以通过合适的方法从天然来源中分离。例如参考W6sten等人，Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。不用融合配偶体从嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)产生疏水蛋白的遗传工程产生方法描述在US2006/0040349中。融合蛋白质可以通过遗传工程方法优选的制备，其中以这样的方式结合编码融合配偶体的一个核酸序列(特别是DNA序列)和编码疏水蛋白部分的一个核酸序列，即通过所述方式使得宿主生物中生成由于结合的核酸序列基因表达而产生的所需蛋白质。此类制备过程在例如PCT/EP2006/050719中公开。括古细菌)或真核生物，特别是细菌(包括嗜盐菌(/^/^wcteW")和甲烷球菌(附W/iffm7cocd))、真菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，更优选是大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽抱軒菌(必tt"7/WS柳egfltef/"附)、米曲霉(^45pe/^'〃MS"/J汉")、构巢曲霉(^15/W^〃"51mV/"/tf"S)、黑曲霉(/45/Wg/〃MSzi/ge。、巴斯德毕赤酵母(P/cA/tf/7"5/0,/5)、假单胞菌属物种(尸5^"flfo附0"flWS/^C)、乳酸杆菌属(/tf"o6n"7//)、多形汉逊酵母(flam^腿/a"/拜0r/^fl)、里氏木霉(7Wc/ro^附areese/)、SF9(或相关细胞)等等。发明还提供了表达构建体的用途，以及包含至少一种这些表达构建体载体，所i^达构建体在调节核酸序列的遗传控制下包含编码根据本发明使用的多肽的核*列。使用的构建体优选包括，特定编码序列的5，上游、启动子和3，下游，终止子序列，以及根据需要，其它常规调控元件，它们各自与编码序列有效连接。在本发明的上下文中，"有效连接"理解为表示启动子、编码序列、终止子以及(根据需要)其它调节元件的顺序排列，从而使得每个调节元件都可以实现其在编码序列表达中所希望的功能。有效连接的序列实例是标签序列，还有增强子、多聚腺苷酸化信号等。其它调节元件包括选择性标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列是,例如，描述在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。除了这些调节序列，这些序列的天然调节还可以出现在实际的结构基因的上游，以及根据需要，被遗传修饰从而关闭天然调节，并增加基因的表达。优选的核酸构建体还有利的包含一个或多个所谓的"增强子"序列，其功能性的连接到启动子上，能够增加核酸序列的表达。同样在DNA序列的3，端，还可以插入额外的有利序列，例如其它调节元件或终止子。构建体中出现的核酸可以是一个或多个拷贝。根据选择构建体需要，还可以有其它标记例如抗生素抗性或补充营养缺陷型的基因。存在用于制备的有利的调节序列，例如，在启动子例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、X-PR或imlambda-P启动子中，发现所述启动子利于在革兰氏阴性细菌中使用。其它有利的调节序列出现在，例如，革兰氏阳性启动子amy和SP02，以及酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。还可以使用合成的启动子进行调节。为了在宿主生物中表达，将核酸构建体有利的插入到载体中，例如使得基因在宿主中最优表达的质粒或噬菌体。除了质粒和噬菌体，载体还理解为表示所有本领域技术人员已知的其它载体，例如病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、黏粒和线性或环状DNA，以及还有农杆菌属(Agrobacterium)系统。这些载体可以在宿主生物中自主复制或染色体复制。合适的质粒是，例如，在大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-Iir，3-Bl、tgtll或pBdCI,在链霉菌属(Streptomyces)中的plJ101、pIJ364、p腦2或plJ361,在芽孢杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214，在棒状杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667，在真菌中的pALSl、plL2或pBB116，在酵母中的2a、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23或者在植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述质粒构成了可行质粒的一小部分选择。其它质粒也是本领域技术人员已知的，并且例如，可以取自书本CloningVectors(编著PouwdsP.H等人，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)。有利地，为了表达其它存在的基因，核酸构建体还额外的包含用于增强表达的3，-和/或5，-端的调节序列，其根据宿主生物和所选的一或多个基因为了最优表达而被选择。这些调节序列意图使得能够控制基因表达和蛋白质表达。根据宿主生物，这可以表示，例如，基因只有在诱导之后才表达或过表达，或者立即表达和/或过表达o调节序列或因子优选的可以正向影响，从而增加所导Aj^因的基因表达。因此，调节元件的扩增可以有利地在转录水平通过^f吏用强转录信号例如启动子和/或增强子被影响。此外，还可以通过例如，改善mRNA的稳定性，来增强翻译。在载体的另一个实施方案中，包含核酸构建体或者核酸的载体可以以线性DNA的形式有利的导入微生物，并通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。该线性DNA可以由线性化的载体例如质粒或仅由核酸构建体或核酸构成。为了在生物中异源基因的最优表达，根据在生物中使用的特定"密码子选择"改变核酸序列是有利的。"密码子选择，，可以参考所讨论生物的其它已知基因的计算机评估来简单的测定。通过将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子信号或多聚腺苷酸化信号融合，制备表达盒。为此，使用常规重组和克隆技术，描述在，例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和在T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中。为了在合适的宿主生物中表达，重组的核酸构建体或基因构建体被有利的插入到宿主特异性载体中，所述栽体使得基因在宿主中最优表达。载体是本领域技术人员普遍已知的并且可以取自例如"CloningVectors"(PouwelsP.H等人,编著，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)。在栽体的辅助下，可以制备重组微生物，所述微生物已经被转化了例如至少一个载体并可以用于生产根据发明使用的疏水蛋白或其衍生物。有利的，上述重組构建体被引入合适的宿主系统并表达。优选的使用本领域技术人员熟悉的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，从而在特定表达系统中引起所述核酸的表达。合适的系统描述在，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等人编著,WileyInterscience,NewYork1997，或者Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989。还可以制备同源重组的微生物。为此，制备载体，其包括待使用的基因或编码序列的至少一部分，其中，根据需要，引入了至少一个M酸缺失、添加或取代，从而改变(例如功能性破坏)所述序列("敲除"载体)。待引入的序列也可以，例如是来自相关微生物的同源物，或来自哺乳动物、酵母或昆虫来源。可以备选的配置用于同源重组的载体，4吏同源重组的内源基因#:以另一方式突变或改变，但仍编码功能性蛋白质(例如，可以改变上游调节区从而改变内源蛋白质的表达)。根据发明使用的基因的改变部分位于同源重組栽体内。用于同源重组的合适载体的构建描述在，例如，Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503。原则上，所有的原核或真核生物都可以作为此类核酸或此类核酸构建体的重组宿主生物。有利的，使用的宿主生物是微生物，例如细菌，真菌或酵母。有利的，使用革兰氏阳性或革兰氏阴性菌，优选肠杆菌科(i"tera6tf"cV/ccae)、假单胞菌科(_Pscwflfo/M<mflt</ffcc—、根瘤菌科(i/r/zo油ceae)、链霉菌科(浙cpto附j;c""ce—或诺卡氏菌科(/V(OCfln/Zflce—的细菌，更优选使用的细菌为埃希氏菌属CEsc&Wc/h'a)、假单胞菌属(_Psei/o/wc>/iflw)、链酶菌属(5^e/to附yces)、诺卡氏菌属(7Vooi/y///1)、4白克霍尔德菌属(必wr^^/flfenVi)、沙门氏菌属(^|//<股//")、农杆菌属(々/y^fl"m'w附)或红球菌属(i/^fifoC0CC"5)的细菌领域技术人员已知的方法生长或培养的宿主生物。微生物通常生长在液体培养基中，温度为0至100。C之间，优选的10至60。C之间，有氧气喷射，所述液体培养基包括碳源(一般是糖的形式)，氮源(通常是有机氮源的形式例如酵母提取物或盐类如硫酸铵)，痕量元素(例如铁盐、锰盐和镁盐)，以及根据需要，维生素。营养液的pH可以维持在固定值，即在生长过程中可调节或不调节。培养可以是分批培养、半分批培养或连续培养。营养物可以在发酵起始加入，或以半连续或连续的方式补充。可以通过实施例中描述的方法从生物中分离酶，或作为粗提取物用于反应。根据发明使用的疏水蛋白，或其功能性、生物学活性的片段，可以通过重组制备方法制备，其中培养生产多肽的微生物，根据需要诱导蛋白质表达，并将它们从培养物中分离。如果需要，蛋白质也可以以工业,以这样的方式生产。可以用已知方法培养并发酵重组微生物。细菌在例如TB或LB培养基，温度为20至40。C和pH为6至9中增殖。合适的培养条件具体描述在，例i口T.Maniatis，E.RFritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)。融合配偶体可以极大的方便疏水蛋白的制备生产融合疏水蛋白比没有融合配偶体的疏水蛋白有显著更高的产量。如果蛋白质没有被分泌到培养基中，就破坏细胞并通过已知的蛋白质分离方法从裂解物中获得所述产物。根据需要，可以通过高频超声、通过高压(如弗氏细胞压碎器(Frenchpressurecell))、通过'渗透溶解、通过去污剂、水解酶或有机溶剂的作用、通过匀浆器或通过组合多种所列方法来石皮坏细胞。可以用已知的色i普方法纯化蛋白质，例如分子筛色语(凝胶过滤)，如Q琼脂糖色镨、离子交换色谙和疏水色谱，以及其他常用方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法描述在，例如，Cooper,F.G"BiochemischeArbdtsmethoden[BiochemicalTechniques]，VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYork,或在Scopes,R.，ProteinPurification,SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin。通过为融合疏水蛋白提供特异性锚定基团，可以特别有利于简化融合疏水蛋白的分离和纯化，所述基团可以结合固体支持物(特别是合适的聚合物)上相应的互补基团。此类固体支持物可以作为，例如，色谱柱的填充料，并且以这一方式一般可以显著增加分离的效率。亲和色i普也是已知的此类分离方法。为了掺入锚定基团，在蛋白质的制备中可以使用载体系统或寡核苷酸，所述寡核苷酸用特定的核苷酸序列延长了cDNA，从而编码改变的蛋白质或融合蛋白质。为了筒化纯化，修饰的蛋白质包括所谓的作为锚起作用的"标签"，例如已知的六组氨酸锚的修饰。用组氨酸锚修饰的融合疏水蛋白可以用色傳纯化，例如，用镍-琼脂糖(nickd-Sepharose)作为柱填充料。然后，通过合适的洗脱剂例如咪唑溶液将融合疏7JC蛋白再次从柱上洗脱。在简化的纯化方法中，可以省略色语纯化。为此，首先通过合适的方法M酵肉汤中去掉细胞，例如通过微量过滤或离心。然后，通过合适的方法破坏细胞，例如通过上文已经提及的方法，将细胞碎片可以与内含体分离。后者可以有利的通过离心实现。最后，以原则上已知的方式^s皮坏内含体，从而释放融合疏水蛋白。这可以通过例如酸、碱和/或去污剂实现。具有根据发明使用的融合疏水蛋白的内含体通常可以甚至用0.1MNaOH在约1小时内完全溶解。通过该简化的方法获得的融合疏水蛋白的纯度一般是所有蛋白质量的60至80%(重量)。通过所述简化的纯化方法获得的溶液可以用来实施本发明，而不需要其他纯化。但是，融合疏水蛋白也可以作为固体从溶液中分离。例如，这可以以原则上已知的方式，通过冷冻干燥或喷雾干燥来实现。在发明的优选的实施方案中，可以通过喷雾干燥的方法分离。喷雾干燥可以使用色镨纯化的溶液，也可以优选的使用通过制备内含体在简化的纯化方法后获得的溶液。为了实施喷雾干燥，根据需要可以中和溶液。发现pH7至9的范围是特别有利的。通常还建议将初始溶液略微浓缩。发现在初始溶液中有用的固体浓度达30%(重量)。一般固体含量>5%可以产生精细产品粉末。随后，溶液可以用原则上已知的方式喷雾干燥。喷雾干燥合适的装置是商业可购的。最优喷雾干燥条件随单位类型和所需产量变化。已经发现输入温度为130至180'C,输出温度为50至80。C时对疏水蛋白溶液是有利的。任选的，喷雾干燥可以使用助剂，例如糖类、甘露糖醇、葡聚糖(dextran)或麦芽糖糊精。发现上述助剂的有用量是基于疏水蛋白的0至30%(重量)，优选5至20%(重量)的此类助剂。按所述制备的疏水蛋白可以直接作为融合蛋白质使用，或在分离和移除融合配偶体后，作为"纯"疏水蛋白使用。当需要移除融合配偶体时，建议在疏水蛋白部分和融合配偶体部分之间的融合蛋白质中掺入潜在的裂解位点(蛋白酶的特异性识别位点)。合适的裂解位点特别是那些在疏水蛋白部分和融合配偶体部分都不存在的肽序列，所述序列可以用生物信息学工具容易的确定。特别合适的实例是曱硫氨酸的BrCN裂解，或蛋白酶介导的用因子Xa裂解的裂解、肠激酶裂解、凝血酶裂解或TEV裂解(烟草蚀紋病毒)。对于织物洗涤的本发明用途，界面活性非H^蛋白质可以首先作为洗涤组合物的成分使用，并以这一形式加入洗涤液中。而且，还可以分别向洗涤液中加入界面活性非i^蛋白质，并使用不含界面活性非g蛋白质的洗涤组合物。分别的添加可以通过添加固体形式的蛋白质进行，作为溶液或作为适当的制剂。要理解两种添加方法也可以组合。本领域技术人员根据所需效果确定洗涤液中界面活性非S^L蛋白质的量。发现有效量一般是0.05至50ppm，优选的0.1至30ppm，更优选的0.2至20ppm，甚至更优选的0.5至10ppm以及，例如1至6ppm。发明的洗涤組合物包括至少一种洗涤活性物质和至少一种界面活性非酶促蛋白质。至少一种界面活性非酶促蛋白质优选的是导致如开始所述的接触角改变的蛋白质，更优选的至少一种疏水蛋白。要理解也可以使用不同蛋白质的混合物。如果使用疏水蛋白，它们可以作为"纯"疏水蛋白或另外以上述融合蛋白质的形式使用。发现实施本发明的有用实例是yaad-Xa-dewA-his型(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA-his型(SEQIDNO:22)或yaad-Xa國basfl-his型(SEQIDNO:24)融合蛋白质。发现特别有用的实例是具有完整yaad融合配偶体或具有截短的融合配偶体(例如yaad40-Xa-dewA-his(SEQIDNO:26))的yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)。术语"用于织物洗涤的洗涤组合物"是同时不言自明且限制性的。用于洗涤织物的洗涤组合物以例如，粉末、颗粒、粒状沉淀、糊状、片状、凝胶或液体形式，一般是以含水溶液(洗涤液)的形式来使用。它们的作用由化学和物理化学过程的相对复杂的相互作用组成。洗涤組合物包括至少一种洗涤活性物质，但是一般包含多种不同洗涤活性物质，它们相互作用产生最优的洗涤结果。洗涤组合物的重要洗涤活性成分特别是表面活性剂，还有助洗剂，辅助助洗剂(cobuilder)、漂白系统和洗涤组合物酶。还可以另外使用典型的添加剂，例如芳香剂、緩蚀剂、染料传递抑制剂、抑泡剂或荧光增白剂作为洗涤组合物的成分。表面活性剂可以是阴离子、非离子、阳离子或两性表面活性剂。合适的非离子表面活性剂特别是-烷氧基化CVC22-醇，例如脂肪醇烷氧基化物、羰基合成醇烷氧基化物(oxoalcoholalkoxylate)和格尔伯特醇(Guerbetalcohol)乙氧基化物可以使用环氧乙烷、氧化丙烯和/或环氧丁烷进行烷氧基化作用。可以存在嵌段共聚物或随机共聚物。每摩尔醇，通常包括2至50mo1,优选的3至20mol至少一种烯基氧化物。优选的烯化氧是环氧乙烷。醇类优选具有10至18个碳原子。-烷基酚烷IL^化物，特别是烷基酚乙氧基化物，其包括CVd4-烷基链和5至30mol的烯化lL/摩。-烷基多葡糖苷，其包括QrC22-，优选的d。-C『烷基链和一般1至20，优选的1.1至5个葡糖苷单元。-N-烷基葡萄糖酰胺(N-alkylglucamide)、脂肪酸酰胺烷氧基化物、脂肪酸链烷醇酰胺烷基氧化物，和环氧乙烷、氧化丙烯和/或环氧丁烷的嵌段共聚物。合适的阴离子表面活性剂是，例如-(脂肪)醇硫酸盐，其具有8至22，优选的10至18个碳原子，特别是C9-Cu-醇硫酸盐，C12《14-醇硫酸盐，C『d8-醇硫酸盐、硫酸月桂盐、十六烷J^危酸盐、肉豆蔻^i^危酸盐、棕榈酰石危酸盐(palmitylsulfate)、石更脂酰硫酸盐和动物脂肪酸硫酸盐。-硫酸化烷氧基化CVC22-醇(烷基醚硫酸盐)通过以下制备该类型的化合物例如，首先烷氧基化C8-C22-，优选的d(rd8-醇，如脂肪醇，然后硫酸化该烷氧基化产物。对于烷氧基化作用，优选的使用环氧乙烷。-线性Cs-C2。-烷基苯磺酸盐(LAS)，优选的线性CVd3-烷基笨璜酸盐和C9-C『烷基曱苯磺酸盐。画链烷磺酸盐，特别是C『C24-，，优选的d。画Qs-链烷磺酸盐。-皂类，例如Cs-C24-羧酸的钠盐和钟盐。将阴离子表面活性剂优选的以盐的形式加入洗涤组合物。合适的盐是，例如，碱金属盐如钠盐、钾盐和锂盐，铵盐如羟乙基铵盐、二(羟乙基)-铵盐和三(羟乙基)铵盐。合适的阳离子表面活性剂包括-CVC25-烷基胺；-N，N-二甲基-N-(CVC4-羟烷基)(<:7-<:25-烷_&)铵盐；-用烷化剂季铵化的单-和二(<:7-<:25-烷基)二甲基铵化合物；画酯季铵化物(esterquats),特别是被<:8調<:22-羧酸酯化的季铵化酯化单-、二-和三链烷醇胺。-咪唑淋季铵化物(imidazolinequats)，特别是通式II或III的1-烷基咪峻啉错盐(l画alkylimidazoliniumsalt)，其中变量定义如下R3是d-C25-烷基或CVC25-链烯基；R4是d-CV烷基或羟基-Ci-C4-烷基；R5是d-Cr烷基、羟基-d-Cr烷基或R、(CO)-X-(CH2)m-基团(X:-O-或-NH-;m:2或3),其中至少一个RS基团是OC22-烷基。合适的两性表面活性剂是，例如烷基甜菜碱、烷基酰胺甜菜碱、M丙酸盐、M甘氨酸盐和两性咪唑錄盐化合物。在洗涤过程中，助洗剂(也已知不均匀无机助洗剂，HIB)作用为软化水。它们通过其碱度支持洗涤作用，并从污垢和纤维桥中滤去钙离子和镁离子，并且促进色素污垢^:在洗涤液中。合适的无机助洗剂特别是-具有离子交换性质的晶体和无定形铝硅酸盐，特别是沸石多种类型的沸石是合适的，特别是沸石A、X、B、P、MAP和HS，所述沸石为Na形式或其中Na已经被其他阳离子例如Li、K、Ca、Mg或铵部分替换的形式。國晶体硅酸盐，特别是二硅酸盐和片状硅酸盐，例如5-和(3画Na2Si20s。可以以其碱金属、碱土金属或铵盐的形式使用硅酸盐；优选给出的为硅酸钠、硅酸锂和硅酸镁。-无定形硅酸盐，例如硅酸钠和无定形二硅酸盐。-碳酸盐和碳酸氢盐可以以它们的碱金属、碱土金属或铵盐的形式使用它们。优选给出了碳酸钠、碳酸锂和碳酸镁以及碳酸氢钠、碳酸氢锂和碳酸氢镁，特别是碳酸钠和/或碳酸氢钠。-聚磷酸盐，例如三聚磷酸钠。辅助助洗剂与助洗剂协同作用，例如通过作为一类备用品(store),其比助洗剂更迅速的吸收钾离子或镁离子，并将它们传递给助洗剂。此夕卜，它们可以通过吸附在晶种上阻止其生长。合适的有机辅助助洗剂特别是-低分子量羧酸例如柠檬酸，疏7jc修饰的柠檬酸，例如松萆酸、苹果酸、酒石酸、葡糖酸、戊二酸、琥珀酸、亚胺二琥珀酸、氧二琥珀酸(oxydisuccinicacid)、丙三羧酸、丁坑四曱酸、环戊烷甲酸、烷基琥珀酸和链烯基琥珀酸和氨基多羧酸，例如氨三乙酸、P-丙氨酸双乙酸、乙二胺四乙酸、丝氨酸双乙酸、异丝氨酸双乙酸、N-(2-羟乙基)亚氨乙酸、乙二胺二琥珀酸，以及甲基甘氨酸双乙酸和乙基甘氨酸双乙酸。-低聚和多聚羧酸，例如丙烯酸和天冬氨酸均聚物、低聚马来酸、马来酸和丙烯酸、异丁烯酸或C2-C22-烯烃的共聚物，例如，异丁烯或长链a-烯烃、乙烯基CrCs-烷基醚、乙烯基乙酸酯、乙烯基丙酸酯、CrCV醇的(曱基)丙烯酸酯和苯乙烯。优选给出了丙烯酸的均聚物和丙烯酸与马来酸的共聚物。低聚和多聚碳酸以酸的形式或作为钠盐的形式使用。合适的漂白剂是，例如过氧化氩和无机盐的加合物，如过硼酸钠一水合物、过硼酸钠四水合物和碳酸钠过氧化氢合物，以及过羧酸如苯二酰亚氨基过己酸。合适的漂白活化物是，例如N，N，N，，N，-四乙酰基乙二胺(TAED)、对-壬酰氧苯磺酸钠和N-曱基吗啉基乙腈硫酸甲酯盐(N-methylmorpholinioacetonitrilemethylsulfate)。在洗涤组合物中优选使用的酶是蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶和过氧化物酶。合适的染料传递抑制剂是l-乙烯基吡咯烷酮，1-乙烯基咪唑，4-乙烯基吡啶N-氧化物的均聚物、共聚物和接枝聚合物，或者与氯乙酸反应过的4-乙烯吡咬的均聚物和共聚物。使用的成分的类型和量由本领域技术人员根据洗涤组合物的所需最终用途来确定。例如，漂白剂一般在强力洗涤组合物中使用，而不用于温和洗涤组合物。洗涤组合物的组成和洗涤組合物的成分的进一步详述见，例如，"Waschmittel"[Washingcompositions]inR6mppChemie-Lexikon，在线编辑，2.6版，Georg-Thieme画Verlag,Stuttgart,NewYork,Febr.2005,或者"Detergents"inUllmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第6版，2000，ElectronicRelease,Wiley陽VCH-Verlag，Weinheim，2000。实施本发明的优选的表面活性剂是阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。根据发明使用的界面活性非i^tl蛋白质，特别是疏水蛋白，可以特别有利的与线性烷基笨璜酸盐或脂肪醇硫酸盐与烷基醚硫酸盐或烷基烷氧基化物的组合一起使用。可以特别有利的使用基于Q-ds-醇和/或其烷氧基化产物的阴离子和/或非离子表面活性剂，任选的与其他表面活性剂混合。烷氧基优选的是主要包含环氧乙烷单元和/或氧化丙烯单元，优选的环氧乙烷单元。它们可以是，例如，1至25个环氧乙烷单元(优选的3至20个，且更优选的5至15个单元)的基团，或者包含环氧乙烷和氧化丙烯单元的基团，其中后者在各种情况下应该包含基于所有烷氧基单位的总数的至少50摩尔％，优选的60摩尔％的环氧乙烷单元。优选的表面活性剂的实例包括烷氧基化Cs-ds-醇，例如脂肪醇烷氧基化物、羰基合成醇烷氧基化物、格尔伯特醇烷氧基化物、CVdr醇的硫酸盐、硫酸化烷氧基化CVds-醇(烷基醚硫酸盐)或线性Q-d8-烷基^t酸盐(LAS)，优选的线性C9-C『烷基苯磺酸盐和CVd3-烷基甲笨璜酸盐。特别优选的是2-丙基庚醇和十三醇的烷氧基化产物及其硫酸酯。洗涤组合物中的界面活性非i^l蛋白质的量是由本领域技术人员根据对洗涤组合物的所需性质判断的。在此背景中，有利的选择该量，使得在按照说明的洗涤组合物剂量的情况下，获得界面活性非sm蛋白质的上述特定的浓度。发现有用量是占洗涤组合物所有成分总量的0.002至2.5%(界面活性非i^l蛋白质的重量)。该量优选为从O.Ol至1.5%(重量)，更优选为从0.025至1.0%(重量)，甚至更优选的从0.05至0.5%(重量)，例如，0.1至0.3%(重量)。在优选的实施方案中，发明的洗涤组合物包括O.Ol至1.5%(重量)的界面活性非酶促蛋白质，0.5至40%(重量)的表面活性剂，优选为阴离子和/或非离子表面活性剂，59至99.45%(重量)的其它洗涤活性添加剂或配制助剂。使用的成分(c)可以优选的是脂肪酶和/或无定形聚合物，例如环氧乙烷-氧化丙烯嵌段共聚物。发明的洗涤组合物可以用本领域技术人员原则上已知的方法生产。洗涤组合物的生产方法细节在，例如，上文引用过的"RiimppChemie國Lexikon"或"UUmaim，s"文献中给出。可以使用溶液的或固体的界面活性非iHl蛋白质生产洗涤组合物。固得，例如喷雾千燥或冷冻干燥。在洗涤组合物的生产中，应该保证对界面活性非酶促蛋白质的热应力不过高。该限制当然是由蛋白质的类型所指导的。在使用疏水蛋白的情况下，已经发现不超过120。C的产物温度是有用的。过程温度(即，例如喷雾干燥器中气流的温度)当然也可以更高，条件是产物温度不超过临界极限。向洗涤组合物中温和掺入成分的技术是本领域技术人员已知的。例如，制备粉状洗涤组合物可以通过，第一步，通过喷雾干燥从洗涤组合物的热稳定成分的含水浆中生产粗产品，将该粗产品在第二步中在温和条件下与热敏感成分混合。通常建议在上述第二步中引入根据本发明使用的界面活性非a蛋白质，但并没有意图将发明局限于此。根据本发明，洗涤织物材料的方法至少包括步骤将待洗的织物材料和含水洗涤液填充到洗涤用具中，对织物材料和洗涤液的混合物应用机械力，移除含水洗涤液并任选的漂洗织物材料，干燥织物材料。所用的洗涤用具可以是任何种类的洗衣机。但是，该术语还包括那些在手洗中通常使用的容器，例如洗澡盆或洗脸盆。在步骤(a)，洗涤用具首先用织物和含水洗涤液填充，填充顺序不重要。以原则上已知的方式，洗涤液包括至少一种洗涤活性物质。才艮据本发明，含水洗涤液还包括至少一种界面活性非酶促蛋白质。已经论述过优选的蛋白质。界面活性非S^蛋白质的添加可以通过洗涤组合物进行，或者单独进行。优选的在洗涤循环开始时进行，但是当然也可以在随后时间进行。步骤(b)中的洗涤操作是通过机械力作用于织物材料和洗涤液的混合物而以已知方式进行的。可以通过洗衣机输入机械力，例如通过滚筒，或在手洗的情况下，通过手和/或其它辅助手段。在洗涤操作过程中的温度由本领域技术人员根据情况选择。例如，温度可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。C。发明的特别优势非常特别体现在中温或低温洗涤的情况中。在本发明的优选实施方案中，洗涤操作在不超过60。C，尤其在不超过50。C的温度下进行。根据发明进行洗涤过程的特别有利的温度范風是5至45。C,非常特别优选的15至35。C，例如20至30。C。在洗涤操作过程中界面活性非,蛋白质的浓度由本领域技术人员选择。优选的浓度范围已经在前文论述。如果添加通过发明的洗涤组合物实现，它们通常的使用量是0.05至25g/1,优选的0.25至15g/1，更优选的0.5至10g/1，甚至更优选的1至6g/1，例如1.5至4g/1，在每种情况中基于洗涤液。在实际的洗涤操作后，洗涂液以原则上已知的方法移除。一般的，织物材料随后通过一次或多次漂洗操作漂洗，并最终干燥(步骤(d)和(e))。在漂洗过程中，织物柔软剂(softner)可以作为添加剂使用。根据发明的方法适合于清洁所有类型的织物材料。这些可以是织物纤维、半成品的和成品的织物及用其生产的成品衣服。这些可以是惯用的衣服织物，或者家庭纺织品，例如地趙、窗帘、桌布和作为技术目的起作用的织物结构。这些还包括不定型的结构例如羊毛状物(fleece),线状结构例如细绳(twine)、线、纱线、线(line)、绳(string)、饰带、编织物(knit)、绳索，还有三维结构例如毡、机织织物、非机织织物和填絮。织物材料可以由天然来源的材料组成，例如棉花、羊毛或亚麻，或由合成材料组成，例如聚丙烯腈、聚酰胺或聚酯。可以理解它们还可以是混合织物，例如棉/聚酯或棉/聚酰胺。下列实施例意在进一步举例说明本发明A部分制备和检测根据发明使用的疏7jc蛋白实施例1克隆yaad-His6/yaaE-His6的制备借助于寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)进行聚合酶链式反应。使用的模版DNA是细菌枯草芽孢杆菌的基因组DNA。得到的PCR片段包括枯草芽胞杆菌yaaD/yaaE基因的编码序列，在每一端上分别都有Ncol和Bglll限制性切割位点。将PCR片段纯化并用限制性内切酶Ncol和Bglll切割。将该DNA片段用作插入片段并克隆到Qiagen的载体pQE60中，所述载体已经用限制性内切酶Ncol和Bglll预先线性化。因此形成的载体pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5可以用于表达由YAAD::HIS6或YAAE::HIS6组成的蛋白质。Hal670:g邻邻coGatggGtcaaat^gQtactgaHal571:gcagatctasagopgcgttcttgcatac;Ha，572:gfgccatgggattaacaaitaggtgtactaggHa，573:gcagatdttacaagtg:ccttttgcttatattee实施例2yaad疏水蛋白DewA-His6的克隆借助于寡核苷酸KaM416和KaM417进行聚合膝涟式反应。使用的模版DNA是霉菌构巢曲霉的基因组DNA。得到的PCR片段包括疏水蛋白基因dewA的编码序列以及N端的因子Xa蛋白酶切割位点。将PCR片段纯化并用限制性内切酶BamHI切割。将该DNA片段用作插入片段并克隆到已经用限制性内切酶BglII预先线性化的栽体pQE60YAAD弁2中。由此形成的载体#508可以用于表达由YAAD::Xa::dewA::HIS6组成的融合蛋白。KaM416;GCAGCCC馬AGGGATCCCTGAGCCTTGGTACCAGCGCKa國7:GCCGTAGCTAGTGGATCeATTGAAGGGCGGAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC实施例3yaad疏水蛋白RodA-His6的克隆1吏用寡核苷酸KaM434和KaM435，与质粒#508类似的克隆质粒#513。隨434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGG(S实施例4yaad疏水蛋白HypA-His6的克隆在pQE60(#522)中HypA的克隆使用寡核苷酸KaM449/KaM450进行PCR。使用的才莫版DNA是Nadicom生产的质粒pCR2.1中的HypA。得到的片段包括疏水蛋白HypA基因的没有起始和终止密码子的编码序列。将PCR片段用凝胶电泳纯化并用限制性内切酶Ncol和BamHI切割。将该片段用作插入片段并连接到用Ncol和BglII预先切割的载体pQE60中。KsM機GTTACCCCATGGCGATGTCTCGCGTCCTTGTCGCT<image>imageseeoriginaldocumentpage28</image>在pQE60+YAAD(#523)中的HypA的克隆用寡核苦酸KaM451/KaM452进行PCR。使用的模版DNA是Nadicom生产的质粒pCR2.1中的HypA。得到的片段包括疏水蛋白HypA基因的没有起始和终止密码子的编码序列。将PCR片段用凝胶电泳纯化并用限制性内切酶BglII和BamHI切割。将该片段用作插入片段并连接到已经用BglII预先切割的载体pQE60+YAAD中。KaM451:CGTAGTAGATCTATCATCTCTCGCGTCCTTGTCGCTGCKaM452:CGACTA(3GATCCGAGGTTGACATTGACAGGAGAGCT5启动子/laclMil元件实施例5yaad疏水蛋白HypA-His6的克隆在pQE60(#524)中的HypB的克隆用寡核苷酸KaM453/KaM454进行PCR。使用的模版DNA是Nadicom生产的质粒puC19中的HypB。得到的片段包括疏7jC蛋白HypB基因的没有起始和终止密码子的编码序列。将PCR片段用凝胶电泳纯化并用限制性内切酶Ncol和BamHI切割。将该片段用作插入片段并连接到已经用Ncol和BglII预先切割的载体pQE60中。Ka453:GCTTATCCATGGCGGTCAGCAC(3TTGATCACTGTCG醒454:GCTATAGGATCCCACATTGGCATTAATGGGAGPGC<image>imageseeoriginaldocumentpage30</image>pQE60+YAAD(#525)中的HypB的克隆用寡核苷酸KaM455/KaM456进行PCR。使用的模版DNA是Nadicom生产的质粒puC19中的HypB。得到的片段包括疏水蛋白HypB基因的没有起始和终止密码子的编码序列。将PCR片段用凝胶电泳纯化并用限制性内切酶BglII和BamHI切割。将该片段用作插入片段并连接到已经用BglII预先切割的载体pQE60+YAAD中。Ka簡5:GCTAACAGATOTATG(3TCAC3CACGTTeATCACTGTCKaM456:CTATGAGGATCCCACATTGGGATTAATG(3GAGTGCT5启动子/lac操纵元件实施例6yaad疏水蛋白BASF1-His6的克隆4吏用寡核苷酸KaM417和KaM418，与质粒#508类似的克隆质粒#507。使用的模版DNA是合成的DNA序列-疏水蛋白BASF1(见附录)。KaM417:CCCGTA3eTAGTGGATCCATTGAAGGGCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGCKa關8:CTGCCATTCA(3GGGATCCCM7VrGQAG(MGGGAGACAG实施例7yaad疏水蛋白BASF2-His6的克隆寸吏用寡核苷酸KaM417和KaM418，与质粒#508类似的克隆质粒#506,。使用的模版DNA是合成的DNA序列-疏水蛋白BASF2(见附录)。Ka國7:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCGGCAT"GAAGTTCTGCGTGTCCGCKa薩8:CTGCCATTGAGGGGATCCCAmTGGAGGAGGGAGACAG实施例8yaad疏水蛋白SC3-Hiss的克隆使用寡核苷酸KaM464和KaM465,与质粒#508类似的克隆质粒#526。使用的模版DNA是来自裂褶菌的cDNA(见附录)。K錢IVW64:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKa聽5:GCTMCAGATCTATC3TTCGCCCGTCTCCCCGTCGT实施例9重组大肠杆菌菌林yaad疏水蛋白DewA-His6的发酵用表达yaad疏水蛋白DewA-His6的大肠杆菌菌林在15mlGreiner管中接种3mlLB液体培养基。在200转/分钟摇动器上，37。C孵育8小时。在每种情形下，用lml预培养物分别接种两个带挡板的1l锥形瓶和250mlLB培养基(+100pg/ml氨千青霉素)，并在180转/分钟摇动器上37。C孵育9小时。在201发酵罐中用0.51预培养物(OD6。。nm1:10，对H20测量的)接种13.51LB培养基(+100jug/ml氨千青霉素)。在OD60nm约3.5时，加入140mll00mMIPTG。3小时后，冷却发酵罐到l(TC并离心去掉发酵肉汤。使用细胞粒状沉淀进行进一步的纯化。实施例10重组疏水蛋白融合蛋白的纯化(带有C端His6标签的疏水蛋白融合蛋白的纯化)100g细胞粒状沉淀(100-500mg疏水蛋白)加入50mMpH7.5的磷酸钠緩冲液至总体积200ml，并且重悬。悬液用Ultraturrax型T25(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)处理10分钟，然后与500单位的Benzonase(Merck,Darmstadt;货号1.01697.0001)—起在室温下孵育1小时，以降解核酸。在细胞破坏前，用玻璃柱(cartridge)(PI)实现过滤。为了破坏细胞和剪切剩余的基因组DNA，在1500bar(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)进行两个匀浆器循环。离心勻浆(SorvallRC-5B、GSA转子、250ml离心杯、60分钟、4。C、12000转/分钟、23000g)，将上清氣改置在冰上并且将粒状沉淀重悬在100mlpH7.5的磷酸钠緩冲液中。离心和重悬重复3次，在第三次重复中磷酸钠緩冲液包含1%的SDS。重悬后，将混合物搅拌1小时并进行最终离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心杯，60分钟，4°C，12000转/分钟，23000g)。根据SDS-PAGE分析，在最终离心后疏水蛋白存在于上清液中(图1)。实验显示了疏水蛋白可能以内含体的形式存在于相应的大肠杆菌细胞中。将50ml含有疏水蛋白的上清液用于50ml镍琼脂糖高精确性(nickelSepharoseHighPerformance)17-5268-02柱(Amersham)上，所述柱已经用50mMTris-ClpH8.0緩冲液平衡。用50mMTris-ClpH8.0緩沖液洗涤柱子，然后用含有200mM咪唑的50mMTris-ClpH8.0緩冲液洗脱疏水蛋白。为了移除掉咪唑，溶液用50mMTris-ClpH8.0緩冲液透才斤。图1显示了制备的疏水蛋白的纯化泳道l:应用于镍-琼脂糖柱(l:IO稀释)泳道2:流通液(Flow-through)-洗涤步骤洗脱物泳道3-5:OD280最大值的分级级分图1的疏水蛋白分子量是约53kD。一些更小的条带代表疏7jc蛋白的降解产物。实施例11性能检测；通过水滴在玻璃上的接触角改变表征疏水蛋白底物玻璃(窗玻璃，StiddeutscheGlas，Mannheim)使用实施例10中的融合疏水蛋白。疏水蛋白浓度在水溶液中100照/ml;添加剂50mM乙酸钠pH4+0.1%聚氧乙烯(20)-失水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween⑧20)。-孵育玻璃板过夜(温度80。C)，然后在蒸馏水中洗涤包被，-然后孵育10分钟/80。C/在蒸馏水中的l。/o十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，-在蒸馏水中洗涤样品在空气中干燥，在室温下测定5pl水的水滴的接触角(以角度)。在DataphysicsOCA15+接触角系统上、软件SCA20.2.0.(2002年11月)测量接触角。测量是根据制造商的说明实现的。未处理的玻璃产生的接触角是30士5。；用根据实施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA-his6)包被的玻璃产生的接触角为75±5。。B部分界面活性非齊&蛋白质用于织物洗涤的应用一般检测描述为了检测作用，在商业购买的检测装置(Launder-o-meter,，来自Atlas，美国)中进行洗涤检测。在洗涤液中添加和未添加蛋白质的各种情况下进行检测。检测4吏用了可商业购买的检测织物和家庭产生的检测织物。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>从上述每种检测织物上截下30x30mm的片，并缝在编织的未染色的漂白棉布上。对于商业的检测织物的情形中，每种情形中将2条(50mmx200mm)与5g白色棉/聚酯混合织物一起在给定条件下洗涤，所述白色棉/聚酯混合织物上带有4块(对于织物1-4)(每种情形中)，或2块(在织物5和6的情形中)(每种情形中)不同的缝好的检测织物。在自产的检测织物的情形中，在O.lg染色的脂肪或油的每个情形中的2个污点滴在棉条上(50mmx200mm编织的未染色的漂白棉布)，并在50。C处理30分钟。用苏丹红染色。在洗涤后，织物在250ml自来水中漂洗5分钟，然后干燥。通过洗涤前后在420nm处的反射度测量评估洗涤作用。每种情况进行一次添加界面活性非IH^蛋白质的检测，以及在相当的条件下，进行没有此类添加剂但条件完全相同的检测。在结果表格中列出的百分比表明，与没有蛋白质添加的检测相比，有蛋白质添加的检测中洗涤作用增加，根据下列公式计算洗涤作用的增加[%]=(1￡國1犯)/(1白-Ia)xIOO在各种情况下，lE在此表示检测织物在检测洗涤后的反射度，Ia表示在检测洗涤进行前的反射度。O表示没有添加发明的蛋白质的比较检测。I白表示没有着色的干净织物的反射度。在添加和未添加蛋白质检测的各种情况中，污垢的再沉积也相应的通过比较没有着色的干净白色织物在洗涤前后的反射度来评估。实施例12检测参数使用的蛋白质蛋白质的浓度洗涤组合物洗涤液的量洗涤组合物的剂疏水蛋白融合蛋白质yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:19)见表l可商业购买的粉状洗涤组合物(WhiteCat(白猫)，中国，2003)每罐250ml2.0g/1'液体比例水狄洗涤温度洗涤时间20:12.5mmol/1(摩尔Ca:Mg比=3:1)25°C30分钟蛋白质作为稀释水溶液添加。根据上文给出的一般描述进行并评估检测洗涤。结果汇集在表l中。实施例13检测参数使用的蛋白质蛋白质的浓度:洗涤组合物洗涤液的量洗涤组合物的剂疏水蛋白融合蛋白质yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:19)见表l可商业购买的粉状洗涤组合物(Ariel，中国，2004，来自Procter&Gamble)每罐250ml2.0g/1液体比例20:1水硬度2.5mmol/1(摩尔比Ca:Mg=3:1)洗涤温度25°C洗涤时间30分钟根据上文给出的一般描述进行并评估检测洗涤。结果汇集在表1中。表l:检测洗涤的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>在所有检测中，都实现了洗涤作用的显著增强。实施例14:对于下列检测洗涤，每种情况下使用由阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和助洗剂组成的洗涤組合物的模式配方。检测参数j吏用的蛋白质疏水蛋白融合蛋白yaad40-Xa-dewAhis(SEQIDNO:26)蛋白质的浓度见表2阴离子表面活性剂非离子辅助表面活性剂助洗剂400ppm的<:12/14一脂肪醇硫酸钠在每种情况下30ppm的C13/15-羰基合成醇乙氧基化物，烷氧基(alkoxylateradical)类型见表2250ppm的碳酸钠洗涂液的:、液体比例-级洗涤温度洗涤时间每罐250ml20:12.5mmol/1(摩尔比Ca:Mg=3:1)25°C30分钟根据上文给出的一般描述进行并评估检测洗涤。结果汇集在表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表2检测洗涤的结果EO-环氧乙烷，PO-氧化丙烯实施例15对于下列洗涤检测，各种情况中使用由阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂和助洗剂组成的洗涤組合物的沖莫式配方。检测参数使用的蛋白质蛋白质A:疏水蛋白融合蛋白质yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:19)蛋白质B:疏水蛋白融合蛋白质yaad40-Xa-dewA-his(SEQIDNO:26)蛋白质浓度见表3阴离子表面活性400ppm的N-十二烷基辆酸钠辅助表面活性剂在各种情况下30ppm，类型见表3助洗剂250ppm的碳酸钠洗涤液的量250ml液体比例20:17K石嫂2.5mmo1/1(摩尔比Ca:Mg=3:1)洗涂温度25°C洗涤时间30分钟根据上文给出的一般描述进行并评估检测洗涤。结果总结在表3中。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表3检测洗涤的结果EO-环氧乙烷，PO-氧化丙烯在所有的检测中，每种情形中都实现了洗涤作用的增强。在每种情形中，带有截短的yaad融合配偶体(B)(40个^i^酸)的融合疏水蛋白比带有全长yaad融合配偶体(294个M酸)的融合疏水蛋白(A)获得了更好的结果。序列表中DNA和多肽序列的序列名称的排列<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>权利要求1.界面活性非酶促蛋白质用于织物洗涤的应用。2.根据权利要求l的应用，其中所述蛋白质的特征在于以下性质与水滴和未包被的玻璃表面的接触角相比，所述蛋白质在室温下应用到玻璃表面后使得等大水滴的接触角增加至少20。。3.根据权利要求2的应用，其中蛋白质是疏水蛋白。4.根据权利要求3的应用，其中蛋白质是融合疏水蛋白，其中融合配偶体包括20至500个氨基酸。5.根据权利要求3的应用，其中疏水蛋白是至少一个选自yaad画Xa-dewA画his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa陽rodA-his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)的疏水蛋白，其中的限制性条件是在每种情形中yaad也可以是具有20至293个氛基酸的截短的yaad融合配偶体。6.根据权利要求1至5的任一项的应用，其中所述蛋白质在洗涤液中以0.05至50ppm的浓度j吏用。7.根据权利要求1至6的任一项的应用，其中所述蛋白质与阴离子和/或非离子表面活性剂联合使用，所i^面活性剂包括线性烷基M酸盐或脂肪醇硫酸盐与烷基醚硫酸盐或烷基烷氧基化物的组合。8.用于织物洗涤的洗涤组合物，其包含至少一种洗涤活性物质，其中洗涤组合物还包含至少一种界面活性非降&蛋白质。9.根据权利要求8的洗涤组合物，其中蛋白质的特征在于以下性质与水滴和未包被的玻璃表面的接触角相比，所述蛋白质在室温下应用到玻璃表面后使得等大水滴的接触角增加至少20。。10.根据权利要求9的洗涤组合物，其中蛋白质是疏水蛋白。11.根据权利要求10的洗涤组合物，其中蛋白质是融合疏水蛋白，其中融合配偶体包含20至500个氨基酸。12.根据权利要求11的洗涤组合物，其中疏水蛋白是至少一个选自yaad曙Xa-dewA画his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)的疏水蛋白，其中的限制性条件是在每种情形中yaad也可以是具有20至293个氨基酸的截短的yaad融合酉己^f禹^。13.根据权利要求8至12的任一项的洗涤组合物，其中界面活性非酶促蛋白质的量为洗涤组合物所有成分的0.002至2.5%(重量)。14.根据权利要求13的洗涤组合物，其包含(a)0.01至1.5%(重量)的界面活性非iHl蛋白质，(b)0.5至40%(重量)的表面活性剂，和(c)59至99.45%(重量)的其它洗涤活性添加剂或配制助剂。15.根据权利要求14的洗涤组合物，其中所^A面活性剂是阴离子和/或非离子表面活性剂。16.根据权利要求15的洗涤组合物，其中表面活性剂是线性烷基苯磺酸盐或脂肪醇硫酸盐与烷基醚硫酸盐或垸基烷氧基化物的组合。17.用于洗涤织物材料的方法，其至少包括以下步骤(a)用待洗的织物材料和含水洗涤液装填洗涤用具，(b)将机械力用于织物材料和洗涤液的混合物，(c)移除含水洗涤液以及任选的漂洗织物材料，以及(d)干燥织物材料，其中，含水的洗涤液包含至少一种界面活性非酶促蛋白质。18.根据权利要求17的方法，其中蛋白质的特征在于以下性质与水滴和未包被的玻璃表面的接触角相比，所述蛋白质在室温下应用到玻璃表面后使等大水滴的接触角增加至少20°。19.根据权利要求18的方法，其中蛋白质是疏水蛋白。20.根据权利要求19的方法，其中蛋白质是融合疏7K蛋白，其中融合配偶体包括20至500个氨基酸。21.根据权利要求20的方法，其中疏水蛋白是至少一个选自yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)的疏水蛋白，其中的限制性^^是在每种情形中yaad也可以是具有20至293个氨基酸的截短的yaad融合配偶体o22.根据权利要求17至21的任一项的方法，其中蛋白质与阴离子和/或非离子表面活性剂联合使用，所W面活性剂包括线性烷基M酸盐或脂肪醇硫酸盐与烷基醚硫酸盐或烷基烷氧基化物的组合。23.根据权利要求17至22的任一项的方法，其中洗涤操作在不超过60。C的温度下进行。24.根据权利要求17至22的任一项的方法，其中洗涤操作在5至45。C的温度下进4亍。25.根据权利要求17至22的任一项的方法，其中洗涤操作在15至35。C的温度下进行。26.根据权利要求17至15的任一项的方法，其中所述蛋白质在洗涤液中以0.05至50ppm的浓度4吏用。全文摘要本发明涉及表面活性非酶促蛋白质在织物洗涤中的用途、用于织物洗涤的包括界面活性非酶促蛋白质的去污剂，以及使用所述蛋白质的洗涤方法。文档编号C11D3/00GK101233220SQ200680028317公开日2008年7月30日申请日期2006年7月27日优先权日2005年8月1日发明者C·博尔施韦勒,D·伯克,H-G·勒迈尔,M·考罗什,T·萨布科夫斯基,T·蒙塔格,U·鲍斯,V·施文德曼申请人:巴斯福股份公司