专利名称：胶原溶解及再生方法
技术领域：
本发明涉及一种溶解胶原(collagen)的方法，以及进一步利用水或其他凝固浴 将溶解的胶原再生为多种形态的方法。
背景技术：
胶原是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质之一，广泛存在于动物的结缔组织、 皮肤、骨骼、肌腱、内脏、细胞间质、韧带、血管、巩膜等部位，占动物体内蛋白质总量的25 30%，是动物体内主要的结构蛋白。作为一种优良的可再生天然高分子资源，胶原具有优异 的生物相容性和可降解性，已在生物医学材料、皮革化学与工程、日化工业、食品工业等领 域得到广泛的应用或具有广阔的应用前景。近年来，由于石油资源短缺、环境恶化及可持续 发展的挑战，具有来源丰富、可再生、可生物降解等优良特性的胶原已成为最为重要的有机 天然资源之一。胶原具有完整的四级结构胶原的每一条肽链形成左手α-螺旋结构，每三条左 手螺旋多肽链相互缠绕，形成一个右手超螺旋结构(原胶原)，多肽链内和链间由数量众多 的氢键、离子键、疏水键、范德华力等相互作用以保持螺旋结构稳定。由于三股螺旋的旋转 方向与构成它们的多肽链的旋转方向相反，因而不易解旋，使胶原具有极高的强度和结构 稳定性。原胶原首尾相接，按规则平行排列成束，首尾错位1/4，通过共价键搭接交联，形成 稳定的胶原微纤维(microfibril)，并进一步聚集成束，形成难溶的胶原纤维(fiber)。和 其他许多天然高分子材料(纤维素、甲壳素等)一样，胶原不具有热塑性，不能被熔融加工， 也很难溶解在普通溶剂中，限制了胶原在许多领域的应用。中性盐或稀醋酸溶液能够从动物皮肤、肌腱、骨骼等富含胶原纤维的组织中提取 出部分未能共价交联或未成熟的胶原，即可溶性胶原。然而动物体内大部分为难溶性胶 原，这部分胶原以胶原纤维形式存在，彼此相互交叉形成网状。对于难溶性胶原，可先用胃 蛋白酶消化水解，去除末端非螺旋型区域，再用稀醋酸溶液提取；胶原粗制品经反复透析、 离心等纯化处理后，经冷冻干燥可得胶原制品。以从猪皮中提取I型胶原为例首先，从猪 皮组织中分离皮肤，去除毛发和表皮，脱脂，用绞肉机绞碎；以2. 5g/L的质量浓度悬浮在 0. 5mol/L醋酸中进行胃蛋白酶水解，连续搅拌消化48h，超速低温离心30min ；去除沉淀后， 在上清液中加入NaCl至最终浓度为4. 4mol/L,充分搅拌后再离心沉淀；将沉淀溶解在醋酸 中后，继续加入NaCl至最终浓度为1. 7mol/L，离心后收集沉淀；将沉淀溶解在醋酸中，通过 0. 45 μ m的滤膜过滤，在4°C对0. 001mol/L醋酸溶液透析24h。可以看出，胶原的整个提取 过程相当繁琐，且该过程会产生很多废弃物，提取率也非常低。同时，冷冻干燥的方法需要 特殊的仪器，耗时长，成本高。寻求胶原天然高分子材料的环保加工技术一直是科学工作者 不懈努力的目标。如果能找到一种溶剂，直接将皮胶原溶解在其中，并用简单的方法将胶原 再生成膜、纤维、微球状、粉状等各种形态的制品，必将极大地促进胶原产业的发展。离子液体是近年来兴起的一类极具应用前景的环保型溶剂，它不挥发，对水和空 气稳定，对无机、有机化合物以及高分子材料具有良好的溶解性，在电化学、有机合成、化工分离、材料制备等领域有着广泛的应用。离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐，也称为低温熔融盐。与传统有机溶剂、水、超临界流体等相比，离 子液体具有许多优良的性能对很多化学物质，包括有机物和无机物具有良好的溶解性能； 具有较高的离子传导性；热稳定性较高；液态温度范围较宽；极性较高，溶剂化性能较好； 几乎不挥发、不氧化、不燃烧；粘度低、热容大；对水和空气均稳定；易回收，可循环使用；设 备简单、易于制造。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种简便的胶原溶解方法，同时还提供了将胶原再生成 膜、纤维、微球或粉状等各种形态的胶原制品的方法。基于上述目的，本发明采用了如下技术方案胶原溶解方法，是利用离子液体做溶 剂溶解胶原。所述离子液体为烷基咪唑类离子液体。所述离子液体1-甲基-3-丁基卤代咪唑、1-丁基-3-甲基卤代咪唑、1-乙 基-3-甲基卤代咪唑、1-烯丙基-3-甲基卤代咪唑或二卤二(3，3' - 二甲基)咪唑基亚砜盐。取干燥的胶原投入到离子液体中，85 140°C下搅拌0. 5 6h。胶原与离子液体的重量比为1 15 100。胶原再生的方法，步骤为将胶原溶解于离子液体中得到胶原/离子液体溶液后， 用凝固剂洗去溶液中的离子液体，得到再生胶原。所述凝固剂选自去离子水、乙醇、甲醇、丙酮中的一种或任意组合。将所述胶原/离子液体溶液铺膜，然后置于凝固剂中，胶原再生为薄膜形态。使所述胶原/离子液体溶液自细孔(喷丝孔)喷入凝固剂中，胶原再生为纤维形 态。将所述胶原/离子液体溶液直接滴入凝固剂中，胶原再生为球状或粉末形态。本发明所提供的胶原溶解及再生方法步骤简单、无毒无害、安全性高，能大幅度简 化胶原制品的制备过程。离子液体可以破坏胶原分子间或分子内的作用力，进而将其溶解， 溶解条件温和，易于控制，获得胶原/离子液体溶液具有良好的可再生性；再生过程简单， 所用的凝固剂价格低廉、易于回收，为胶原制品的研究和推广应用奠定了良好的基础。
图1是在皮粉纤维溶解过程中拍摄的显微照片，其中图Ia对应的是70°C，图Ib对 应 120 0C ；图2是在皮粉纤维的溶解过程中，于701、1001、1101及120°C拍摄的偏光显微 照片；图3是在II型胶原纤维的溶解过程中，于70°C、110°C、120°C、125°C拍摄的偏光显 微照片。
具体实施例方式实施例1 称取0. 56g皮粉纤维和5. 03g离子液体1_甲基_3_ 丁基氯代咪唑放入烧杯中，边 磁力搅拌边升温至100°c;皮粉纤维在离子液体中逐渐溶解，1. 5h后溶液呈均勻分散的浑浊 状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。取少量制备的皮粉纤维离子液体溶液，均勻铺在玻片上，将玻片浸入去离子水中 静置，皮胶原再生成膜。将膜用去离子水反复浸泡，彻底洗去离子液体，将膜在室温下通风 处自然晾干，得到再生皮胶原膜。实施例2称取0. 25g皮粉纤维和3. OOg离子液体1_ 丁基_3_甲基氯代咪唑，加入0. 30g去 离子水，于油浴中加热至120°C，并进行磁力搅拌；皮粉纤维在含水离子液体中逐渐溶解， Ih后溶液呈均勻分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。用注射器取少量制备的真皮层纤维离子液体溶液，将溶液注射入丙酮中，皮胶原 再生成纤维。将纤维用丙酮反复浸泡，彻底洗去离子液体，将纤维在室温下通风处自然晾 干，得到再生皮胶原纤维。实施例3将浸酸山羊皮的真皮层刮下，中和，于室温下在真空烘箱中充分干燥，得到真皮层 纤维。称取0. 6g真皮层纤维和5. 03g离子液体1- 丁基-3-甲基溴代咪唑，在油浴中加热至 85°C，并进行磁力搅拌；纤维在离子液体中逐渐溶解，6h后，溶液呈均勻分散的浑浊状态， 继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至纤维完全溶解。用注射器取少量制备的真皮层纤维离子液体溶液，将溶液逐滴滴入丙酮中，皮胶 原再生成微粉状。抽滤后得到微粉，将微粉在室温下通风处自然晾干，得到再生皮胶原粉。实施例4称取0. 05g皮粉纤维和5. 03g离子液体1_乙基_3_甲基溴代咪唑放入烧杯中，边 磁力搅拌边升温至90°C ；皮粉纤维在离子液体中逐渐溶解，3h后，溶液呈均勻分散的浑浊状 态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。用注射器取少量制备的皮粉纤维离子液体溶液，将溶液逐滴滴入甲醇中，皮胶原 再生成微粉状。抽滤后得到微粉，用甲醇反复浸泡并抽滤，在室温下通风处自然晾干，得到 再生皮胶原粉。实施例5将浸酸山羊皮的真皮层刮下，中和，于室温下在真空烘箱中充分干燥，得到真皮层 纤维。称取0. 75g真皮层纤维和5. OOg离子液体1-烯丙基-3-甲基氯代咪唑，加入0. 30g 去离子水，于油浴中加热至120°C，并进行磁力搅拌；纤维在含水离子液体中逐渐溶解，Ih 后，溶液呈均勻分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉纤维完全溶解。取少量制备的真皮层纤维离子液体溶液，均勻铺在玻片上，将玻片浸入丙酮中，用 丙酮将离子液体洗去，使皮胶原再生成膜。将膜在室温下通风处自然晾干后揭下，得到再生 皮胶原膜。实施例6称取0. 50g皮粉纤维和5. OOg离子液体二氯二(3，3' - 二甲基)咪唑基亚砜盐，加入0. 30g去离子水，于油浴中加热至140°C，并进行磁力搅拌；皮粉纤维在含水离子液体 中逐渐溶解，0. 5h后，溶液呈均勻分散的浑浊状态，继续搅拌，溶液逐渐变得澄清，直至皮粉 纤维完全溶解。取少量制备的皮粉纤维离子液体溶液，均勻铺在玻片上，将玻片浸入去离子水中 静置，皮胶原再生成膜。将膜用去离子水醇反复浸泡，彻底洗去离子液体。将膜在室温下通 风处自然晾干，得到再生皮胶原膜。溶解实验1取一根皮粉纤维(生牛皮经水洗、脱脂、浸灰、片皮、脱灰后，进行脱水干燥处理， 然后进行研磨，即可得到皮粉纤维)置于载玻片上，将一滴离子液体[Bmim]Cl滴在皮粉纤 维上，将其完全覆盖，盖上盖玻片。将载玻片置于LEICAMPS 30热台偏光显微镜的热台上， 自室温缓慢升温至140°C，撤去起偏镜能观察到皮粉在温度升至70°C之前(图la) —直呈 现纤维状，但随着温度的升高，皮粉逐渐溶解，升温至120°C时(图lb)皮粉几乎完全溶解， 视野中满是小液滴(若不加离子热体，则能观察到皮粉随温度升高逐渐褐变、碳化)。升温 过程中，于关键温度点拍摄偏光照片，如图2所示，发现70°C时皮粉纤维在偏光显微镜下呈 现大片亮区，表明纤维中有大量结晶区域；升温至100°C时，体系中亮区区域减少，表明部 分结晶结构已被破坏；升温至110°C时，体系中的亮区区域进一步减少；升温至120°C，体系 中亮区完全消失，此时皮粉纤维溶解在离子液体中。溶解实验2取一根不溶性II型胶原纤维(Sigma，C-8886)置于载玻片上，将一滴离子液体 [Bmim] Cl滴在胶原纤维上，将纤维完全覆盖，盖上盖玻片。将载玻片置于LEICA MPS 30热 台偏光显微镜的热台上，从室温缓慢升温至140°C，撤去起偏镜能观察到皮粉在70°C以下 一直呈现纤维状，但随着温度的升高，皮粉逐渐溶解，升温至125°C时皮粉几乎完全溶解，视 野中满是小液滴。在关键温度点拍摄偏光照片，如图3所示。从图中可以看出，在70°C时II 型胶原纤维在偏光显微镜下呈现大片亮区，表明纤维中有大量结晶区域；升温至110°C时，体系中亮区缩减，表明其中部分结晶结构已被破坏；升温至120°C时，体系中的亮区区域进 一步减少；在125°C下停留5min，体系中亮区完全消失，此时胶原纤维完全溶解在离子液体 中。
权利要求
胶原溶解方法，其特征是，利用离子液体做溶剂溶解胶原。
2.如权利要求1所述的胶原溶解方法，其特征是，所述离子液体为烷基咪唑类离子液体。
3.如权利要求2所述的胶原溶解方法，其特征是，所述离子液体为1-甲基-3-丁基卤 代咪唑、1-丁基-3-甲基卤代咪唑、1-乙基-3-甲基卤代咪唑、1-烯丙基-3-甲基卤代咪唑 或二卤二(3，3' - 二甲基)咪唑基亚砜盐。
4.如权利要求1-3任一所述的胶原溶解方法，其特征是，取干燥的胶原投入到离子液 体中，85 140°C下搅拌0. 5 6h。
5.如权利要求4所的胶原溶解方法，其特征是，胶原与离子液体的重量比为1 15 100。
6.利用权利要求1-5任一所述胶原溶解方法进行胶原再生的方法，其特征是，将胶原 溶解于离子液体中得到胶原/离子液体溶液后，用凝固剂洗去溶液中的离子液体，得到再 生胶原。
7.如权利要求6所述胶原再生的方法，其特征是，所述凝固剂选自去离子水、乙醇、甲 醇、丙酮中的一种或任意组合。
8.如权利要求7所述胶原再生的方法，其特征是，将所述胶原/离子液体溶液铺膜，然 后置于凝固剂中，胶原再生为薄膜形态。
9.如权利要求7所述胶原再生的方法，其特征是，使所述胶原/离子液体溶液自细孔喷 入凝固剂中，胶原再生为纤维形态。
10.如权利要求7所述胶原再生的方法，其特征是，将所述胶原/离子液体溶液直接滴 入凝固剂中，胶原再生为微球或粉末形态。
全文摘要
胶原溶解及再生方法，其目的是为了提供一种简便的胶原溶解方法，同时还提供了将溶解后的胶原再生成膜、纤维、微球或粉状等各种形态的胶原制品的方法。为实现这一目的，本发明采用的技术方案为胶原溶解方法，是利用离子液体做溶剂溶解胶原，所述离子液体为为烷基咪唑类离子液体1-甲基-3-丁基卤代咪唑、1-丁基-3-甲基卤代咪唑、1-乙基-3-甲基卤代咪唑、1-烯丙基-3-甲基卤代咪唑或二卤二(3，3′-二甲基)咪唑基亚砜盐。胶原再生方法，是利用所述胶原溶解方法制备胶原/离子液体溶液，然后用凝固剂洗去溶液中的离子液体后得到再生胶原。本发明的胶原溶解及再生方法步骤简单、无毒无害、安全性高，为胶原制品的研究和推广应用奠定了良好的基础。
文档编号D01F4/00GK101838397SQ201010173659
公开日2010年9月22日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者孟卓君, 汤克勇, 郑学晶 申请人:郑州大学