细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂...的制作方法

专利名称：：细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂、皮肤外用剂及食品。
背景技术：
：作为伴随年龄增加而出现的皮肤弹性降低或老年斑及肥胖的这种老化症状的原因，可列举细胞功能降低、胶原等细胞外基质成分的减少或变性、紫外线引起的黑色素产生或色素沉着及细胞的氧化损伤、脂肪的蓄积等。为防止*改善这些老化症状，目前已进行了对各种有效成分的筛查和组合的研究。作为细胞活化剂，已知栊柑的精油(参见专利文献1)，作为胶原产生促进剂，已知来自山毛榉科山毛榉属植物的树木的芽的提取物(参见专利文献2)，作为胶原酶活性阻断剂，已知选自草莓、丁香、枇杷、桑白皮、紫云英中的1种以上的植物提取物(参见专利文献3)，作为黑色素产生抑制剂，已知八角(大茴香)的精油(参见专利文献4)，作为抗氧化剂，己知松萝科松萝属植物的提取物(参见专利文献5)，作为抗炎剂，已知茶多酚类(专利文献6)，作为脂肪蓄积抑制剂，已知槲皮素(参见专利文献7)。此外，未发现涉及以八宝树的提取物作为有效成分的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂、皮肤外用剂及食品。专利文献1:日本专利文献特开2001—131045号公报专利文献2:日本专利文献特开平10—203952号公报专利文献3:日本专利文献特开2003—183122号公报专利文献4专利文献5专利文献6专利文献7曰本专利文献特开平11一302149号公报日本专利文献特开平10_182413号公报日本专利文献特开平6—9391号公报日本专利文献特开2000—344673号公报
发明内容发明要解决的课题目前使用的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂、皮肤外用剂及食品，实质效果有时也并不充分，期待开发更优异的有效成分。本发明是鉴于这些现有的问题点而完成的，目的在于提供由于来自天然而安全性高的、效果更优异的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂、皮肤外用剂及食P叫o解决课题的手段本发明者们为解决上述课题，对各种天然物进行了研究，结果发现八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物具有优异的细胞活化作用、胶原产生促进作用、胶原酶活性阻断作用、黑色素产生抑制作用、抗氧化作用、抗炎作用、脂肪蓄积抑制作用，从而完成了本发明。即，本发明提供含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂、皮肤外用剂及食品。作为八宝树的提取物，利用选自水、生理盐水、磷酸缓冲液、极性有机溶剂、超临界流体以及亚临界流体中的至少1种来提取八宝树的提取物是适用的。其中，优选(1)常温常压下，用低级醇水溶液提取的提取物、(2)高温高压下，用水提取的提取物。用低级醇水溶液或水提取后，还可以进行冷冻干燥除去水分。由于细胞活化、胶原产生促进、胶原酶活性阻断、黑色素产生抑制、抗氧化、抗炎及脂肪蓄积抑制的效果更优异，作为八宝树优选八宝树干燥粉碎物。八宝树的提取物可被认为是通过作为DPPH自由基消除剂和SOD类活性剂(超氧化物消除剂)而发挥功能，产生抗氧化效果。另外，八宝树的提取物可被认为是通过作为透明质酸酶活性阻断剂及磷脂酶A2活性阻断剂而发挥功能，产生抗炎效果。发明效果根据本发明，可提供具有优异效果的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂。另外，通过在皮肤外用剂中配合八宝树的提取物，可提供在防止改善皱纹、松弛、皮肤紧绷、老年斑、晦暗这类皮肤老化症状方面发挥优异效果的防止改善老化用外用剂或对黑色素产生抑制发挥优异效果的美白用皮肤外用剂、对抗炎性发挥优异效果的抗炎用皮肤外用剂、对脂肪蓄积抑制发挥优异效果的瘦身用皮肤外用剂。进而，通过在食品中配合八宝树的提取物，可提供在美容、健康保持或营养补充方面发挥优异效果的食品o具体实施方式本发明中使用的八宝树(Duabangagrandiflom)是海桑科八宝树属的植物。八宝树(Duabangagrandiflora)是分布于从喜马拉雅东部到新几内亚的落叶乔木，树干直立，高度为1040m。木材用于建筑材料或茶具，果实有酸味，可被食用。八宝树的提取物是提取八宝树原料(作为提取对象称作八宝树)而得到的。提取时，可使用八宝树的全草或其叶、杆、茎、枝、枝叶、果皮、果实、树皮、树叶、种子、根茎、根皮、根、花穗、头状花、花等的1或2处以上，但为使提取容易且效率高，可使用八宝树的花、叶、茎或八宝树树皮。八宝树可以直接提取，但考虑提取效率，优选先进行切细、干燥、粉碎等处理再提取。作为提取方法，可适用在提取溶剂中浸渍的方法、或者采用超临界流体或亚临界流体的方法。为提高提取效率，也可以边搅拌边提取，或者在提取溶剂中一边通过均质机或搅拌机使八宝树原料均匀化一边提取。作为提取溶剂，可使用水；甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇、正己烷、甲基戊基醇、2—乙基丁醇、正辛醇等的低级醇(即碳原子数为6以下的醇)；甘油、乙二醇、乙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、双丙甘醇、1,3—丁二醇、己二醇等的多元醇及其衍生物；乙醚、丙醚、异丙醚、正丁醚等醚；醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸丁酯等酯；丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮、甲基正丙基酮等的酮等的溶剂，从其中选择使用1种或2种以上。此外，除水以外的上述提取溶剂相当于极性有机溶剂。作为提取溶剂也还可以使用角鲨烯、凡士林、石蜡、石蜡油等的烃；橄榄油、小麦胚芽油、米油、芝麻油、马卡达姆坚果力夕'-、;7>于'乂7)(Macadamianuts)油、杏仁油、椰子油等的植物油脂；牛油、猪油、鲸鱼油等的动物油脂；添加生理盐水、磷酸缓冲盐、磷酸缓冲生理盐水等无机盐类的极性溶剂或添加表面活性剂的溶剂。而且，也可以使用水或二氧化碳、乙烯、丙烯、乙垸、丙垸、一氧化二氮、二氟一氯甲垸、三氟一氯甲垸、氙、氨、甲醇、乙醇等的1种或2种以上的超临界流体或亚临界流体。即，也可以使用水或二氧化碳、乙烯、丙烯、乙垸、丙烷、一氧化二氮、二氟一氯甲烷、三氟一氯甲垸、氙、氨、甲醇、乙醇等进行八宝树的超临界提取或亚临界提取。提取时的八宝树原料与提取溶剂的比例没有特别限定，但相对于1份原料优选0.11000质量倍的溶剂，考虑到使提取容易且有效率，更优选0.5100质量倍。作为提取温度，从5'C左右到提取溶剂的沸点以下的温度都适合。提取时间根据提取溶剂的种类或提取温度的不同而不同，但适合的是1小时14天左右。另外，提取可以在常温(室温、例如104(TC)、常压(1大气压=约100kPa)下进行，也可以使用高压釜在高温(例如50°C200°C，优选50150°C)高压(例如100kPa500kPa，优选100kPa300kPa)下进行。进行超临界提取、亚临界提取时，优选在所用流体的临界温度以上且临界压力以上提取。例如，当使用二氧化碳作为超临界流体时，优选在31。C以上且7.3MPa以上，当使用甲醇时，优选在239t:以上且8.1Mpa以上，当使用水时，优选在374"以上且22.1Mpa以上进行提取。作为八宝树的提取特别优选的是，在常温常压下通过低级醇水溶液(例如甲醇水溶液或乙醇水溶液、特别是乙醇水溶液)来提取、在高温(例如50200°C，优选50150°C，特别是120°C)高压下通过水来提取。进行这样的提取可以有效且确切地得到作为细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂或者脂肪蓄积抑制剂的功能优异的提取物。作为八宝树的提取物，可列举(1)八宝树的提取液；(2)将八宝树的提取液浓縮和/或干燥后重新溶解于水或极性有机溶剂中所得的物质；(3)对八宝树的提取液在不损害生理作用的范围内进行脱色、除臭、脱盐等精制处理或者通过柱色谱进行分级处理后的物质；(4)将八宝树的提取液及进行了上述处理的八宝树的提取液冷冻干燥，在使用时再次溶解于水或极性有机溶剂中而成为使用状态的物质等。这里，所谓八宝树的提取液，是指从八宝树原料中提取的成分分散或溶解于提取溶剂中的状态的物质。另外，作为上述极性有机溶剂，可列举上述低级醇、多元醇、醚、酯、酮等。八宝树的提取物具有优异的细胞活化作用、胶原产生促进作用、胶原酶活性阻断作用、黑色素产生抑制作用、抗氧化作用、抗炎作用及脂肪蓄积抑制作用，可以用作细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂、皮肤外用剂及食品。以八宝树的提取物为有效成分的细胞活化剂，对各种细胞具有细胞活化作用，特别是对真皮纤维芽细胞发挥出优异的细胞活化效果。细胞活化剂中八宝树的提取物的含量，以细胞活化剂总量为基准，优选为0.0001100质量％，更优选0.00150质量％。以八宝树的提取物为有效成分的胶原产生促进剂，具有胶原产生促进作用，特别对于真皮纤维芽细胞中的I、III及IV型胶原产生发挥出优异的胶原产生促进效果。胶原产生促进剂中八宝树的提取物的含量，以胶原产生促进剂总量为基准，优选0.0001100质量％，更优选0.00150质量%。以八宝树的提取物为有效成分的胶原酶活性阻断剂，具有胶原酶(胶原分解酶)活性阻断作用，特别是通过抑制I型胶原酶对I型胶原的分解，发挥优异的抗老化效果。胶原酶活性阻断剂中八宝树的提取物的含量，以胶原酶活性阻断剂总量为基准，优选0.0001100质量％，更优选0.00150质量％。以八宝树的提取物为有效成分的黑色素产生抑制剂，具有黑色素产生抑制作用，对于老年斑雀斑这种色素沉着症状发挥优异的黑色素产生抑制效果。黑色素产生抑制剂中八宝树的提取物的含量，以黑色素产生抑制剂总量为基准，优选0.0001100质量％，更优选0.00150质量％。以八宝树的提取物为有效成分的抗氧化剂，具有抗氧化作用，特别是通过基于DPPH自由基消除作用、SOD样活性作用(超氧化物消除作用)及过氧化脂质耐受性作用的抗氧化作用发挥优异的效果。抗氧化剂中八宝树的提取物的含量，以抗氧化剂总量为基准，优选0.0001100质量％，更优选0.00150质量％。以八宝树的提取物为有效成分的抗炎剂，具有抗炎作用，特别是通过基于透明质酸酶活性阻断作用及磷脂酶A2活性阻断作用的抗炎作用发挥优异的效果。抗炎剂中八宝树的提取物的含量，以抗炎剂总量为基准，优选0.0001100质量％，更优选0.00150质量％。以八宝树的提取物为有效成分的脂肪蓄积抑制剂，具有脂肪蓄积抑制作用，特别是对皮下脂肪细胞蓄积的中性脂肪发挥优异的脂肪蓄积抑制效果。脂肪蓄积抑制剂中八宝树的提取物的含量，以脂肪蓄积抑制剂总量为基准，优选0.0001100质量％，更优选0.00150质量％。另外，通过将八宝树的提取物配合在皮肤外用剂中，可以得到在皮肤老化症状的防止改善方面发挥优异效果的防止改善老化用的皮肤外用剂或对黑色素产生抑制发挥优异效果的美白用皮肤外用剂、对抗炎性发挥优异效果的抗炎用皮肤外用剂、对脂肪蓄积抑制发挥优异效果的瘦身用皮肤外用剂。在皮肤外用剂中配合时的八宝树的提取物的配合量，可根据皮肤外用剂的种类或使用目的进行调整，但一般地，以皮肤外用剂总量为基准，为0.00000110.0质量％，从效果或稳定性等方面来看，优选0.000015.0质量％，更优选0.00011.0质量％。配合八宝树的提取物的皮肤外用剂(可用作细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂等的皮肤外用剂)的剂型是任意的，例如可作为洗剂(lotion)等的可溶化类、乳膏或乳液等的乳化类、炉甘油(carminelotion)等的分散系来提供。进而，可以以与喷射剂共同填充的气雾剂、软膏、颗粒、散剂、固状等的各种剂型来提供。形态也是任意的，例如可以以化妆水、乳液、美容液、保湿霜等的基础化妆品；防晒霜、防晒露、防晒油、炉甘油等的防晒商品；粉底(foundation)，眼线，睫毛膏，眼影(eyecolor),腮红(cheekcolor),口红等的化妆品；洗面奶、沐浴露、洗发香波等的洗洁用品；染发剂(rinse)、护发素(treatment)、发膏(haircream)、发油(hairoil)、整发剂等的毛发用化妆品；香水或防臭抑汗剂等的形态来提供。另外，在配合八宝树的提取物的皮肤外用剂中，除八宝树的提取物以外，根据需要可适当地配合通常药品、准药品、皮肤化妆品、毛发用化妆品及洗洁用品所能添加的油性成分、表面活性剂、保湿剂、颜料、粉体、色素、乳化剂、可溶化剂、洗洁剂、紫外线吸收剂、增粘剂、药剂、香料、树脂、防菌防螨剂、酒精类等。此外，在不损害本发明的效果的范围内，也可以与其他的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂或脂肪蓄积抑制剂合用。进而，八宝树的提取物也可以用于以美容、健康保持或营养补给为目的的食品、饮料及药品中。配合八宝树的提取物的食品、饮料及药品的剂型是任意的，例如可以以酊剂或点滴剂等的液体制剂、胶或饴等的固体制剂、或者胶囊、粉末、颗粒、片剂等的一般剂型来提供。此外，在配合八宝树的提取物的食品、饮料及药品中，除八宝树的提取物以外，根据需要可适当地配合通常食品、饮料、药品及准药品所能添加的糖类、盐类、醇类、氨基酸、着色剂、香料、甜味料、酸味料、防腐剂、增粘剂、药剂等。此外，在不损害本发明的效果的范围内，也可以与其他的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂或脂肪蓄积抑制剂合用。实施例下面对于八宝树的提取物的制造例及用于评价各种作用的实验，进行更详细地说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。[制造例1]在八宝树的花、叶、茎或树皮的干燥粉碎物100g中加入2.0kg的50容量％乙醇水溶液，室温下边搅拌边提取2小时后，经过滤除去不溶物。将过滤得到的提取上清液减压浓縮后，进行冷冻干燥，得到八宝树的提取物。在八宝树的花、叶、茎或树皮的干燥粉碎物100g中加入2.0kg精制水，使用高压釜在12(TC下加热提取20分钟后，经过滤除去不溶物。将过滤得到的提取上清液进行冷冻干燥处理，得到八宝树的提取物。利用通过上述制造例得到的八宝树的提取物，进行用于评价各种作用的实验。真皮纤维芽细胞活化作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104个接种正常人真皮纤维芽细胞。接种培养基采用在达尔伯克改良依格尔培养基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加1质量％的牛胎儿血清(FBS)的培养基。24小时孵育后，将培养基换成用添加1质量。/。FBS的DMEM培养基调制成各试样浓度的样品培养液，再孵育24小时。48小时孵育后，将样品培养液换成调制成含有40(Vg/mL的MTT试剂的培养基，进一步孵育2小时。MTT(3—(4,5—二甲基一2—噻唑)一2,5二苯基四氮唑溴盐)通过被细胞内的脱氢酶还原，四氮唑环开环生成蓝紫色不溶性的甲簪(formazan)。因此，将生成的甲簪用2—丙醇提取，利用酶标仪测定550nm的吸光度。同时作为浊度测定650nm的吸光度，通过两测定值的差评价真皮纤维芽细胞活化作用。另外，除样品培养液以外，作为阴性对照使用添加l质量n/。FBS的DMEM培养基，作为阳性对照使用添加5质量y。FBS的DMEM培养基。样品培养液中的真皮纤维芽细胞活化作用，是以当阴性对照(control)中的真皮纤维芽细胞活化作用定为100时的相对值来评价。表l显示该评价结果。试<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如表1所示，在样品培养液中，可看出呈试样浓度依赖性的真皮纤维芽细胞活化作用。由此明确可知，八宝树的提取物具有真皮纤维芽细胞活化作用。I型胶原产生作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例2所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104个接种正常人真皮纤维芽细胞。接种培养基采用在达尔伯克改良依格尔培养基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加0.5质量％的牛胎儿血清(FBS)的培养基。24小时孵育后，将培养基换成用添加0.5质量n/。FBS的DMEM培养基调制成各试样浓度的样品培养液，再孵育24小时。培养上清液中分泌的I型胶原的量采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。首先，将培养上清液中的I型胶原与兔抗人I型胶原多克隆抗体(CIIEMICON)进行反应，然后使用经过氧化物酶标记的抗兔IgG多克隆抗体(HISTOFINE;日冷Nichierei)作为二次抗体进行标记。接着，对于标记的过氧化物酶添加2,2，_联氮双(3_乙基苯并噻唑啉一6—磺酸)二铵盐(ABTS)及过氧化氢进行反应后，利用酶标仪测定405nm的吸光度。利用PIERCE公司制BCAProteinReagentAssaykit测定各孔的蛋白量，通过每单位蛋白量的I型胶原产生量来评价I型胶原产生促进作用。另外，除样品培养液以外，作为阴性对照使用添加0.5质量。/。FBS的DMEM培养基，作为阳性对照使用含有50pM的L一抗坏血酸磷酸酯镁盐(VCPMg)的添加0.5质量。/。FBS的DMEM培养基。I型胶原产生促进作用，是以当阴性对照(control)中的每单位蛋白量的I型胶原产生量定为100时的相对值来评价的。表2显示该评价结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>如表2所示，在样品培养液中，可发现与对照组相比的显著的I型胶原产生促进作用。由此明确可知，八宝树的提取物具有I型胶原产生促进作用。ni型胶原产生作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例i所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104个接种正常人真皮纤维芽细胞。接种培养基采用在达尔伯克改良依格尔培养基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加5质量％的牛胎儿血清(FBS)的培养基。24小时孵育后，将培养基换成用添加0.5质量。/。FBS的DMEM培养基调制成各试样浓度的样品培养液，再孵育24小时。培养上清液中分泌的III型胶原的量采用酶联免疫吸附测定法(ELisA)来测定。首先，将培养上清液中的ni型胶原与兔抗人m型胶原多克隆抗体(CIIEMICON)进行反应，然后使用经过氧化物酶标记的抗兔IgG多克隆抗体(HISTOFINE;日冷Nichierei)作为二次抗体进行标记。接着，对于标记的过氧化物酶添加2,2，一联氮双(3_乙基苯并噻唑啉_6—磺酸)二铵盐(ABTS)及过氧化氢进行反应后，利用酶标仪测定405nm的吸光度。利用PIERCE公司制BCAProteinReagentAssaykit测定各孔的蛋白量，通过每单位蛋白量的III型胶原产生量来评价III型胶原产生促进作用。另外，使用添加0.5质量y。FBS的DMEM培养基作为对照。m型胶原产生促进作用，是以当对照中的每单位蛋白量的III型胶原产生量定为100时的相对值来评价。表3显示该评价结果。试样浓度(mg/mL)相对值(％)Control1000.13229如表3所示，在样品培养液中，可发现与对照组相比的显著的m型胶原产生促进作用。由此明确可知，八宝树的提取物具有m型胶原产生促进作用。IV型胶原产生作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例2所述的制造方法得到的八宝树的花的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104个接种正常人真皮纤维芽细胞。接种培养基采用在达尔伯克改良依格尔培养基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加5质量％的牛胎儿血清(FBS)的培养基。24小时孵育后，将培养基换成用添加5质量。/。FBS的DMEM培养基调制成各试样浓度的样品培养液，再孵育5天。培养上清液中分泌的IV型胶原的量采用三明治ELISA法来测定。首先，将培养上清液中的IV型胶原与对IV型胶原的单克隆抗体(识别部位a2链)进行反应，然后与生物素化多克隆抗体反应。接着，添加亲和素化辣根过氧化物酶，使其与生物素化多克隆抗体的生物素部结合。添加形成过氧化物酶的基质的3,3'，5,5'—四甲基联苯胺使其发色，利用酶标仪测定650nm的吸光度。利用PIERCE公司制BCAProteinReagentAssaykit测定各孔的蛋白量，通过每单位蛋白量的IV型胶原产生量来评价IV型胶原产生促进作用。另外，使用添加5质量y。FBS的DMEM培养基作为对照。IV型胶原产生促进作用，是以当对照中的每单位蛋白量的IV型胶原产生量定为IOO时的相对值来评价。表4显示该评价结果。_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表4所示，在样品培养液中，可发现呈试样浓度依赖性的IV型胶原产生促进作用。由此明确可知，八宝树的提取物具有IV型胶原产生促进作用。胶原酶活性阻断作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的树皮的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向Tris盐酸缓冲液中添加试样，调制各种浓度的样品溶液。在样品溶液中，添加I型胶原酶标准品和0.25mg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)标识的I型胶原，在37°。下孵育2小时。向其中添加酶反应终止液，在37"C下孵育30分钟。通过醇沉淀法，得到含有分解后的胶原的上清液。利用荧光分光光度计测定上清液的荧光强度(激发波长495nm、荧光波长520nm)。以使用未添加试样的Tris盐酸缓冲液时的荧光强度作为对照荧光强度，以使用样品溶液时的荧光强度作为样品荧光强度，由下式求得的值作为胶原酶活性阻断率。通过胶原酶活性阻断率来评价胶原酶活性阻断作用。表5显示该评价结果。{(对照荧光强度_样品荧光强度)/对照荧光强度}X100(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表5所示，胶原酶活性阻断率呈试样浓度依赖性增加。由此明确可知，八宝树的提取物具有胶原酶活性阻断作用。[实施例6]黑色素产生抑制作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向90mm培养皿中以每1皿18000个接种B16小鼠黑素瘤(B16F0)细胞。接种培养基采用在达尔伯克改良依格尔培养基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加5质量％的牛胎儿血清(FBS)的培养基。24小时孵育后，将培养基换成用添加5质量c/。FBS的DMEM培养基调制成各试样浓度的样品培养液，再孵育5天。另外，除样品培养液以外，作为阴性对照使用未添加试样的添加5质量。/。FBS的DEME培养基，作为阳性对照使用含有50mM浓度的乳酸钠的添加5质量n/。FBS的DEME培养基。培养结束后，利用胰蛋白酶处理回收细胞，转移至1.5mL微型管中进行离心操作得到细胞沉淀物。用肉眼目测判断所得到的沉淀物的黑化状况。表6显示目测判定标准。以阴性对照为判定5，以阳性对照为判定6，作为目测判定的基准。另外，向上述得到的沉淀物中添加组织溶解剂(商品名Solvable)并煮沸后，冷却至室温，通过分光光度计(日立产分光光度计U—3010)测定500nm的吸光度。通过上述判定及500nm吸光度来评价黑色素产生抑制作用。表7显示该评价结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>如表7示，在使用添加10mg/mL试样的样品培养液时，与阳性对照组相比仅有微小的黑化。由此明确可知，八宝树的提取物具有黑色素产生抑制作用及以此为基础的美白作用。DPPH自由基消除作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向96孔微滴定板以每孔100mL添加用50容量％乙醇调制成各试样浓度的样品溶液。进而向其中以每孔100mL添加0.2mM的1,1—二苯基苦基苯肼(DPPH)乙醇溶液。充分混合后，在室温下暗处静置24小时后，测定来自于DPPH自由基的516nm的吸光度。以代替样品溶液而仅添加50容量％乙醇时的吸光度为(A)，添加样品溶液时的吸光度为(B)，根据下式求得的值作为DPPH自由基消除率。通过DPPH自由基消除率评价DPPH自由基消除作用。表8显示该评价结果。{1—(B)/(A)}X100(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表8明确可知，八宝树的提取物具有基于DPPH自由基消除作用的抗氧化作用。SOD样活性作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。在含有0.25mM的WST—1和lmM的Hypoxanthine的HANK，s(+)溶液75)^L中，添加用HANK，s(+)溶液调制成各试样浓度的样品溶液25pL。进而，添加Xanthine0xidase25^L(0.0075单位)，在37"C下反应15分钟后，测定450nm的吸光度。以代替样品溶液而仅添加HANK's(+)溶液时的吸光度为(A)，添加样品溶液时的吸光度为(B)，根据下式求得的值作为超氧负离子消除率。通过超氧负离子消除率评价SOD样活性作用。表9显示该评价结果。{1—(B)/(A》X100(%)_<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如表9所示，超氧负离子消除率呈试样浓度依赖性的增加。由此明确可知，八宝树的提取物具有基于SOD样活性作用的抗氧化作用。[实施例9]过氧化脂质耐受性的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的花的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向96孔板以每1孔2.0X104个接种人表皮细胞株HaCaT。接种培养基采用在达尔伯克改良依格尔培养基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加10质量％的牛胎儿血清(FBS)的培养基。24小时孵育后，将培养基换成用添加10质量n/。FBS的DMEM培养基调制成各试样浓度的样品培养液。再孵育24小时后，将培养液换成含有任意浓度的t一叔丁基过氧化氢的Hanks(+)溶液。孵育2小时后，将溶液换成含有150pg/mL的中性红的PBS(-)，在37'C下孵育2小时。将PBS(-)换成含有1容量％醋酸的50容量％乙醇水溶液，提取细胞内摄取的中性红(二二一卜，》^:yK)。通过测定提取液的540nm的吸光度，并求出细胞生存率来评价过氧化脂质耐受性。另外，使用添加10%FBS的DMEM培养基在不添加试样及叔丁基过氧化氢下进行培养的作为对照。过氧化脂质耐受性是以当阴性对照的细胞生存率设定为IOO时的相对值来评价。表10显示该评价结果。_<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>如表10所示，细胞生存率呈试样浓度依赖性的增加。由此明确可知，八宝树的提取物具有过氧化脂质耐受性及基于此的抗氧化作用。透明质酸酶活性阻断作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。将市售的透明质酸钾盐(来源于人脐带)以0.9mg/mL溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中，作为基质溶液。将市售的透明质酸酶(来源于牛精巢)以5300单位/mL溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中，作为酶溶液。另外，酶溶液为临用时调制。向试管中加入用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)调制成各试样浓度的样品溶液O.lmL和酶溶液0.3mL，在37"C下反应20分钟。然后加入活化剂0.06mL，在37。C下反应20分钟。再加入基质溶液0.15mL，在37。C下反应1小时。加入0.4NNaOH0.06mL使反应停止后立即用冰冷却，添加硼酸缓冲液(pH9.1)0.06mL，煮沸3分钟后再用冰冷却。添加p—DABA溶液(Ehrilich试药)2.0mL，在37"C下反应20分钟后，从各试管移至96孔微滴定板中，利用酶标仪测定585nm处的吸光度。透明质酸酶的活性如果被阻断，则作为透明质酸分解产物的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)减少，由于Morgan—Elson反应的吸光度将降低。以使用未添加试样的0.1M磷酸缓冲液时的吸光度为对照吸光度，以使用样品溶液时的吸光度为样品吸光度，将根据下式求得的值作为透明质酸酶活性阻断率。通过透明质酸酶活性阻断率来评价透明质酸酶活性阻断作用。表ll显示该评价结果。{(对照吸光度一样品吸光度)/对照吸光度}X100(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>如表11所示，透明质酸酶活性阻断率呈试样浓度依存赖性增加。由此明确可知，八宝树的提取物具有透明质酸酶活性阻断作用及基于此的抗炎作用。磷脂酶A2活性阻断作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例1所述的制造方法得到的八宝树的花的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。调制各浓度的试样及含有20ng/mL的磷脂酶A2(PLA2)和3.3mM的DTNB(5，5—二硫代双(2—硝基苯甲酸))的溶液，室温下静置10分钟。向其中添加作为PLA2的基质的二庚酰基硫代一PC(1，2—双(庚酰硫基)甘油胆碱磷酸)至1.66mM，室温下反应45分钟。该反应中，由于PLA2分解基质而产生的硫醇，还原DTNB而生成5一巯基一2—硝基苯甲酸。然后，观淀在5_巯基_2_硝基苯甲酸的最大吸收波长414nm处的吸光度。另外，测定代替PLA2而添加缓冲液时的吸光度，求出两测定值的差。以未添加试样时的值为(A)，添加试样时的值为(B)，将根据下式求得的值作为PLA2活性阻断率。通过PLA2活性阻断率评价PLA2活性阻断作用。表12显示该评价结果。__<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如表12所示，PLA2活性阻断率呈试样浓度依赖性增加。由此明确可知，八宝树的提取物具有PLA2活性阻断作用及基于此的抗炎作用。[实施例12]脂肪蓄积抑制作用的评价实验在该评价实验中，使用通过制造例2所述的制造方法得到的八宝树的叶的提取物作为试样。按照以下步骤进行评价。向96孔板以每1孔5.0X103个接种来自于皮下脂肪的正常人前体脂肪细胞CryoHPRAD—SQ(三光纯药株式会社)。接种培养基使用含有10质量％的FBS、2mM的L一谷酰胺、100单位/mL的青霉素、及100吗/mL的链霉素的PGM培养基。培养2天后，进行培养基更换。新培养基使用在含有lOpG的胰岛素、I)liM的地塞米松、200pM的吲哚美辛、及500nM的3—异丁基一1一甲基黄嘌呤的PGM—分化用培养基中添加各浓度的试样的培养基。使用未添加试样的PGM—分化用培养基作为对照。利用该培养基开始从前体脂肪细胞到脂肪细胞的分化诱导，直至对照组的细胞成熟且细胞内许多脂肪滴蓄积，培养10天14天。回收细胞，使用10容量％中性缓冲甲醛液固定细胞，用PBS(-)洗净。向细胞中添加0.5质量比容量％的油红0溶液，在37"C下培养2小时，染色脂肪。用PBS(-)洗净细胞后，通过甲醇提取色素。对于提取液，利用酶标仪测定550nm处的吸光度。同时测定650nm的吸光度作为浊度，利用两测定值的差求出中性脂肪细胞蓄积量。添加试样的培养基中的中性脂肪细胞蓄积量，是以当对照组中的中性脂肪细胞蓄积量设定为100时的相对值来评价。表13显示该评价结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如表13所示，脂肪细胞蓄积量随着试样浓度越高越减少。由此明确可知，八宝树的提取物具有脂肪细胞蓄积抑制作用。下面例举配合了本发明所述的八宝树的提取物的皮肤外用剂(可作为细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂而适用的皮肤外用剂)及饮料的处方例。另外，以下只要没有特别明示，各个成分的配合量均是指质量％。化妆水<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>制法将(1)(14)的油相成分及(15)(18)的水相成分分别加热到8(TC，混合均匀化后，将油相添加到水相中。加入(19)并利用均质机乳化。边搅拌边冷却，在4(TC下预混合，添加溶解的(20)、(21)，搅拌、均匀化。[处方例3]美容液<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>制法将(1)(5)及(6)(9)的成分分别加热至7CTC混合、溶解后，混合两成分并利用均质机乳化。边搅拌边冷却，在4(TC下添加(10)的成分，混合，均匀化。化妆水__<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>制法在(1)的成分中加入预先混合的成分(2)和(3)，依次添加(4)(10)的成分，混合、溶解、均匀化。[处方例5]洁肤霜(cleansingcream)[表18]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>制法混合(1)(8)的油相成分，加热溶解至7(TC。另一方面混合(9)(12)的水相成分，溶解并加热至70°C。向该水相成分中慢慢添加上述油相成分后，添加(13)并用均质机均匀乳化。乳化后，冷却至4(TC后，添加(14)并混合。W/0乳化型霜<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>制法向混合(1)(5)的油相中，一边搅拌一边慢慢添加(6)(9)的水相，用均质机进行乳化。乳化后，添加(10)并混合。[处方例7]洁面凝胶[表20]<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>制法将(3)、(7)添加到(11)中并均质化后，在(1)和(2)中溶解(4)(6)并加入，加热至7(TC并均匀地使其溶解。然后冷却至40。C时添加(9)、(10)，最后加(8)进行中和。染发剂(hairrinse)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>制法在(9)中加入(5)、(7)，加热至70°C。另一方面混合(1)(4)并溶解，加热至70。C。一边搅拌该油相一边慢慢加入事先调制好的水相进行预乳化，加入均质机进行均匀化后冷却，在4(TC下添加(6)、(8)。护发素(hairtreatment)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>制法混合(1)(8)的油相成分，并加热至80°C。另一方面，混合(9)(11)的水相成分，并加热至85°C，将其添加到上述油相中并乳化，冷却后在4(TC下添加(12)。[处方例]摩丝(Hairfoam)[表23]原液处方<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>制法混合溶解(1)(10)形成油相。另一方面，将(11)(15)添加到(16)中，溶解形成水相。然后，在75"C下将油相添加到水相，用均质机均匀地乳化。然后进行冷却，4(TC下添加(17)并混合。[处方例12]发胶(hairgel)[表26]<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(7)香料0.20(8)乙二胺四乙酸三钠0.05(9)提取物(制造例l)0.10(10)氢氧化钠(10质量％水溶液)0.50合计100.00制法在(1)中溶解(2)及(3)。然后依次添加(4)(9化后，添加(10)进行中和。[处方例13]汤尼水(tonic)[表27]成分配合量(质量％)(1)乙醇60.00(2)L一薄荷醇7.50(3)对羟基苯甲酸酯0.05(4)提取物(制造例l)1.00(5)辣椒酊0.70(6)香料0.30(7)聚氧乙烯硬化蓖麻油0.20(8)甘油1.50(9)精制水余量合计100.00制法混合(1)(6)的醇相，均匀化备用。向5(TC下溶解的成分(7)中加入醇相，在加入预先均匀化的成分(8)和(9)并混合后，过滤。洗面奶[表28]成分配合量(质量％)(1)硬脂酸10.00(2)棕榈酸10.00(3)肉豆蔻酸12,00(4)月桂酸4.00(5)油醇1.50(6)羊毛脂醇1.00<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>制法将(11)(15)在(7)中混炼，再将其添加到(6)(9)的水相中，混合，加热至70°C。另一方面，混合(1)(5)的油相成分，加热至7(TC。一边搅拌油相，一边添加到已加(10)的水相中，乳化。冷却至4(TC后，添加(16)。W/0乳化型粉底(foundation)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>制法均匀混合(8)(11)的油相成分，在均质机中添加(1)(7)使其分散调制油相分散液。将加热溶解的(12)(14)添加到油相分散液中进行乳化。最后添加(15)并均匀混合。[处方例19]两用粉底(twowayfoundation)__<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>制法将(1)(9)的粉体相在锤式粉碎机中粉碎后，再在捏合机中混合均匀化。将(10)(15)的油相在8(TC下溶解并均匀化后，添加到粉体相中进行混炼。然后，用锤式粉碎机进行粉碎，将过筛的大部分(bulk)在金属器皿中压縮成型。工业实用性如上所述，根据本发明，可提供具有优异效果的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂及脂肪蓄积抑制剂。另外，通过在皮肤外用剂中配合八宝树的提取物，可提供在防止改善皱纹、松弛、皮肤紧绷、老年斑、晦暗这类皮肤老化症状方面发挥优异效果的防止改善老化用外用剂或对黑色素产生抑制发挥优异效果的美白用皮肤外用剂、对抗炎性发挥优异效果的抗炎用皮肤外用剂。进而，通过在食品中配合八宝树的提取物，可提供在美容、健康保持或营养补充方面发挥优异效果的食品、饮料及药品。权利要求1.一种细胞活化剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。2.—种胶原产生促进剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。3.—种胶原酶活性阻断剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。4.一种黑色素产生抑制剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。5.—种抗氧化剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。6.—种抗炎剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。7.—种脂肪蓄积抑制剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。8.—种皮肤外用剂，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。9.一种食品，其特征在于含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。全文摘要本发明提供的细胞活化剂、胶原产生促进剂、胶原酶活性阻断剂、黑色素产生抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂、脂肪蓄积抑制剂、皮肤外用剂及食品中含有八宝树(Duabangagrandiflora)的提取物。文档编号A61P17/18GK101516329SQ20078003480公开日2009年8月26日申请日期2007年9月4日优先权日2006年9月19日发明者三舛祐美,小路哲生,山村达郎,浅野阳子申请人:诺薇雅株式会社