一种包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法与流程
本发明属于微流控芯片和细胞分选技术领域，特别涉及一种包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法。
背景技术：
癌症是导致人类死亡的首要因素，据世界卫生组织(who)专家预测，2020年全球癌症发病人数将达到2000万人，死亡人数将达到1200万人，癌症将成为21世纪影响人类生存和健康的主要威胁。研究表明，90％癌症患者的死亡病例都与肿瘤的转移密切相关。作为肿瘤原发灶和转移灶之间的关键环节，循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)在近几年引起了国内外的广泛关注。在肿瘤转移初期，肿瘤细胞从原发灶实体瘤上脱落，进入血液，成为ctcs。虽然人们对于癌症的诊断和治疗的需求十分迫切，但是临床上治疗癌症的常规手段却极其有限。此外，一旦癌症发展到晚期阶段，几乎无治愈的可能。因此，癌症的早期发现、诊断与治疗是有效提高生存率、降低死亡率的主要方法。
由于肿瘤患者血液中ctc的数目极其稀少(大约每106～107个白细胞中才有一个循环肿瘤细胞)，采用常规手段难以实现分离和捕获。例如：cellsearch是目前唯一获得美国食品药品监督管理局认可并用于ctc检测的商业化产品。但是检测成本昂贵，以磁珠靶向结合ctc不利于后续的检测分析。目前常用的分离方法包括物理分离法(芯片过滤、介电电泳、流体力学)和生物化学分选法(免疫磁珠、免疫微球、表面粘附)，而生物化学分选法是最常用的分析方法。
近年来，基于微流控芯片和纳米材料的检测平台受到了人们广泛的关注。静电纺纳米纤维因其设备简单，操作容易以及高效等特点，并且通过其制备的纳米纤维具有比表面积大、均一性好、形貌可控以及易于功能化修饰等优点而备受关注，将静电纺纳米纤维膜用于ctc的分离富集，可以增加细胞与靶向材料的碰撞接触几率，进而提高细胞的捕获效率(sunn,lium,wangj.n.,etal.chitosannanofibersforspecificcaptureandnondestructivereleaseofctcsassistedbypcbmabrushes[j].small:2016.12(36):5090-5097.)。微流控芯片具有样品需求量少、检测灵敏度高和分析速度快等优点，非常适合应用于细胞分选(chenj,lij,suny.microfluidicapproachesforcancercelldetection,characterization,andseparation[j].labonachip:2012.12(10):1753-1767.)。另外，用于分选ctcs的血液样品量非常有限，微流控芯片恰巧弥补了这一缺陷，所以用微流控芯片分选ctcs的技术受到了广大研究者的青睐。
目前大多数捕获ctcs的方法都是基于抗体-抗原的特异性结合，然而抗体作为一种蛋白类物质，保存困难、容易失活以及价格昂贵。相比抗体而言，天然高分子配体与受体蛋白具有更强的结合力，并且这些天然高分子价格低廉，不易分解，保存条件简单。cd44受体在多种癌细胞表面都有过高表达包括上皮癌、淋巴癌、乳腺癌和肺癌等，其与肿瘤细胞的转移有着密切的关系。cd44受体与透明质酸具有很强的结合力，已经有很多研究在利用ha作为靶向分子修饰到大分子表面用于肿瘤的靶向治疗(kimy,kumars.cd44-mediatedadhesiontohyaluronicacidcontributestomechanosensingandinvasivemotility[j].mol.cancerres.:2014.12(10):1416-1429)。因此，利用ha代替抗体作为靶向分子不仅可以特异性捕获肿瘤细胞，还可以大大降低临床应用成本。
针对后续捕获的循环肿瘤细胞进行释放的方法有借助光敏材料、ph响应键以及二硫键等。二硫键由于其高效的释放效率而备受研究者青睐，目前使二硫键断裂的常用还原剂有谷胱甘肽gsh、二硫苏糖醇dtt、硼氢化钠等。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，具有工艺简单，易操作，特异性强等优点，还能对捕获的循环肿瘤细胞进行无损释放，有利于进一步做后续分析，在癌症的早期诊断方面提供了较高的临床参考价值。
本发明的一种包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，包括：
(1)将质量比为9：0.5～1.5的壳聚糖与聚环氧乙烷peo溶于溶剂中，室温下搅拌反应，冷却至室温，得到壳聚糖/peo纺丝液，静电纺丝，真空干燥得到壳聚糖纳米纤维膜，与戊二醛交联，得到交联壳聚糖纳米纤维膜cnfs；
(2)将透明质酸ha、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐edc·hcl、n-羟基琥珀酸亚胺nhs溶于溶剂中，搅拌反应，得到活化的ha-cooh，逐滴加入到半胱氨酸乙酯盐酸盐h-cys-oet.hcl水溶液中继续搅拌反应，经透析、冷冻干燥，得到ha-cys；其中ha、edc·hcl、nhs、h-cys-oet.hcl的质量比为1：2.4～2.5：1.4～1.5：0.8～0.9；
(3)将步骤(2)得到的ha-cys溶于溶剂中，逐滴加入双氧水h2o2、巯基硅烷偶联剂mptms，冰水浴搅拌反应，经透析、冷冻干燥，得到ha-cys-mptms；其中ha-cys、mptms、h2o2的摩尔比为1：3：5～8；
(4)将步骤(1)得到的cnfs加入甲醇与nacl溶液的混合溶液中，加入两性离子羧酸甜菜碱丙烯酰胺cbaa溶液，室温下搅拌反应，然后水洗、自然晾干，得到两性离子修饰的壳聚糖纳米纤维膜cbaa-cnfs；其中cnfs、cbaa的质量比为4～5：1；
(5)将步骤(4)得到的cbaa-cnfs溶于溶剂中，加入步骤(3)得到的ha-cys-mptms水溶液，搅拌反应，然后水洗、自然晾干，得到ha功能化的纳米纤维膜ha-cbaa-cnfs；其中cbaa-cnfs、ha-cys-mptms的质量比为1：1.5～1.7；
(6)将负载步骤(5)得到的ha-cbaa-cnfs的载玻片作为基底，与聚二甲基硅氧烷pdms微流控通道盖片，通过等离子键合，得到包埋ha功能化的纳米纤维膜的微流控芯片。
所述步骤(1)中的溶剂为浓度为85％的醋酸。
所述步骤(1)中的壳聚糖/peo纺丝液中壳聚糖的浓度为2.5～3.5wt％。
所述步骤(1)中的搅拌为磁力搅拌，搅拌反应的时间为7～9h。
所述步骤(1)中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压为30kv，流速0.1ml/h，纺丝距离12～15cm，环境温度20～30℃，湿度20～40％，以覆盖有铝箔纸的平板装置为接收装置。
所述步骤(1)中真空干燥的时间为12～24h。
所述步骤(1)中交联的时间为4～8h。
所述步骤(2)中的ha的分子量为5830。
所述步骤(2)中的溶剂为二甲基亚砜dmso。
所述步骤(2)中的搅拌为磁力搅拌；搅拌反应的时间为2.5～3h；继续搅拌反应的时间为2～3d。
所述步骤(2)、(3)中透析的工艺条件为：采用截留分子量为1000da的透析袋，于磷酸盐pbs缓冲液中透析1天后，更换为超纯水透析2天。
所述步骤(3)中的溶剂为乙醇。
所述步骤(3)中的双氧水的浓度为28～32％。
所述步骤(3)中的搅拌为磁力搅拌，搅拌反应的时间为3～5h。
所述步骤(4)中的两性离子cbaa是通过将二甲基氨基丙胺、β-丙内酯溶于无水丙酮中，加入阻聚剂1,1-二苯基-2-三硝基苯肼dpph，在氮气保护下冰水浴反应2.5～3.5h，经纯化、真空干燥制得；其中二甲基氨基丙胺、β-丙内酯、dpph、无水丙酮的用量比为1.6g：1～1.1g：50mg：18ml。
所述纯化的工艺条件为用无水丙酮洗脱纯化。
所述步骤(4)中的混合溶液中甲醇与nacl溶液的体积比为1：1。
所述步骤(4)中的nacl溶液的浓度为0.1～0.2m。
所述步骤(4)中的cbaa溶液的浓度为0.07～0.09mg/ml。
所述步骤(4)中搅拌反应的时间为2～3d。
所述步骤(5)中的溶剂为异丙醇。
所述步骤(5)中的溶剂、ha-cys-mptms水溶液的用量比为200ml：800μl。
所述步骤(5)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌温度为70～80℃，搅拌反应时间为7～9h。
所述步骤(5)得到的包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片用于循环肿瘤细胞ctcs的分选和无损释放。
所述ctcs的分选和无损释放的工艺参数为：向所述包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片中通入含有癌细胞的细胞悬浮液或癌症患者血液，利用癌细胞表面特定表达cd44的抗原与ha的结合力，完成癌细胞的分选；向所述包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片中持续通入谷胱甘肽gsh溶液，并收集回收液，完成癌细胞的无损释放。
本发明的壳聚糖纳米纤维成本低廉，表面含有大量丰富的氨基和羟基基团，易修饰，首先修饰两性离子cbaa以减少细胞的非特异性吸附，提高细胞的捕获纯度；再修饰二硫键的化合物便于后续对捕获的肿瘤细胞进行释放，最后将靶向分子ha通过二硫键修饰在壳聚糖纳米纤维上，根据二硫键的易断裂性质，利用还原性物质dtt将捕获的循环肿瘤细胞从纳米纤维膜上释放下来，用于靶向捕获循环肿瘤细胞，实现对肿瘤细胞的后续分析。
有益效果
(1)本发明的壳聚糖纳米纤维膜表面具有丰富的氨基和羟基，易于修饰，结合微流控芯片技术，具有装置简易、重复性好的优点。
(2)本发明采用透明质酸修饰的纳米纤维膜特异性捕获表面高度表达cd44受体的循环肿瘤细胞，特异性强，操作过程简便、分离效率高。
(3)本发明将功能化的纳米纤维膜与微流控芯片相结合，针对循环肿瘤细胞传统分选方法存在的效率低、纯度低、易损伤细胞等问题，利用表面功能化的纳米纤维特异性捕获循环肿瘤细胞，结合微流控分选技术，实现循环肿瘤细胞的高效分离。
(4)本发明制得的包埋透明质酸功能化纳米纤维膜的微流控芯片，所需血液样品量少，检测效率高，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的壳聚糖纳米纤维膜的sem图(左)及直径分布图(右)；
图2为本发明制备的cbaa的核磁共振氢谱；
图3为本发明制备的cbaa-cnfs的红外光谱图(a)、ha-cys的红外光谱图(b)ha-cys-mptms的红外光谱图(c)和ha-cbaa-cnfs的红外光谱图(d)；
图4为本发明制备的cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜的抗蛋白吸附率结果(a)和抗白细胞细胞率结果(b)；
图5为本发明制备的cnfs(a)、cbaa-cnfs(b)和ha-cbaa-cnfs(c)纳米纤维膜在0s时的水接触角图像；
图6(a)为本发明制备的cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜对血液相容性评价的紫外吸收图谱；(b)为(a)图在500-600nm处的放大图；
图7为本发明制备的cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜在不同的时间点的抗凝血行为表征结果；
图8为本发明制备的cnfs(a)、cbaa-cnfs(b)和ha-cbaa-cnfs(c)纳米纤维膜和癌细胞共孵育40min时对细胞捕获的荧光显微镜图以及在不同的孵育时间段(10、20、40和60min)对癌细胞的静态捕获效率(d)；
图9(a)为静态条件下40min谷胱甘肽对捕获的癌细胞释放和对释放的癌细胞做活死染色的荧光显微镜图；(b)为不同反应时间内对癌细胞的释放效率；(c)为释放下来的癌细胞活死染色的存活率；
图10(a)为本发明制备的包埋ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜的微流控芯片对模拟的患者血液在不同流速下(0.5ml/h、1.0ml/h、2.0ml/h、4.0ml/h和6.0ml/h)的动态捕获效率；(b)为本发明制备的ha-cbaa-cnfs纳米纤维微流控芯片在1.0ml/h流速下对不同数量的癌细胞的动态捕获效率；
图11为本发明制备的包埋ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜的微流控芯片在1.0ml/h的流速下，对不同数量的癌细胞的动态捕获分离效率；
图12为本发明制备的透明质酸功能化纳米纤维膜ha-cbaa-cnfs的合成示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将180mg壳聚糖与20mg聚环氧乙烷peo溶于85％的醋酸溶液中，室温下磁力搅拌反应8h，直到壳聚糖成为均一稳定的溶液为止，冷却至室温，得到浓度为3.0wt％的壳聚糖/peo纺丝液，存储在4℃冰箱中备用。将上述所得纺丝液缓慢吸取到注射器内，利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，纺丝条件为：纺丝电压为30kv，流速0.1ml/h，纺丝距离12cm，环境温度20～30℃，湿度20～40％，以覆盖有铝箔纸的平板装置为接收装置，然后置于真空干燥箱中24h，得到壳聚糖纳米纤维膜，与戊二醛在干燥器中交联6h，得到不溶于水的交联壳聚糖纳米纤维膜cnfs。
(2)将200.94mg透明质酸ha溶于8ml的dmso中，将492.67mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐edc·hcl、296.11mg的n-羟基琥珀酸亚胺nhs溶于1ml的dmso中，磁力搅拌反应3h，得到活化的ha-cooh；逐滴加入到10ml含有176.47mg半胱氨酸乙酯盐酸盐h-cys-oet.hcl的水溶液中，继续磁力搅拌反应3d，采用截留分子量为1000da的透析袋，于磷酸盐pbs缓冲液中透析1天后，更换为超纯水透析2天，然后冷冻干燥，得到白色粉末状产物ha-cys，储存于-20℃备用。
(3)将500mg步骤(2)得到的ha-cys溶于10ml乙醇中，在磁力搅拌下，逐滴加入浓度为30％双氧水h2o2，然后加入50μl巯基硅烷偶联剂mptms，冰水浴磁力搅拌反应4h，采用截留分子量为1000da的透析袋，于磷酸盐pbs缓冲液中透析1天后，更换为超纯水透析2天，然后冷冻干燥，得到ha-cys-mptms，储存于-20℃备用。
(4)将1.6g二甲基氨基丙胺、1.024gβ-丙内酯溶于18ml无水丙酮中，加入50mg1,1-二苯基-2-三硝基苯肼dpph阻聚剂，在氮气保护下冰水浴反应3h，得到白色沉淀，然后用无水丙酮洗脱纯化，得到白色粉末，最后真空干燥，得到两性离子羧酸甜菜碱丙烯酰胺cbaa。
(5)将72mg步骤(1)得到的cnfs加入甲醇与0.138m的nacl溶液的混合溶液(v/v＝1:1)中，加入16mg步骤(4)得到的两性离子cbaa溶液(浓度为0.08mg/ml)，室温下搅拌反应2～3d，然后用超纯水清洗2-3次、自然晾干，得到两性离子修饰的壳聚糖纳米纤维膜cbaa-cnfs。
(6)将72mg步骤(5)得到的cbaa-cnfs浸入200ml异丙醇中，加入800μl步骤(3)得到的含有118mgha-cys-mptms的水溶液，75℃搅拌反应8h，然后用超纯水清洗2-3次、自然晾干，得到ha功能化的纳米纤维膜ha-cbaa-cnfs。
(7)将负载步骤(6)得到的ha-cbaa-cnfs的载玻片作为基底，与聚二甲基硅氧烷pdms微流控通道盖片，通过等离子键合，得到包埋ha功能化的纳米纤维膜的微流控芯片。
实施例2
本发明以扫描电子显微镜(sem)、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(atr-ftir)、核磁共振氢谱(1hnmr)、紫外-可见吸收光谱(uv-vis)、抗蛋白吸附试验、水接触角测试、血液相容性试验、抗凝血试验、癌细胞的静态/动态捕获和释放试验以及免疫染色试验表征本发明中制备的透明质酸功能化纳米纤维膜的各项性能及其结合微流控芯片在循环肿瘤细胞分选和无损释放中的应用潜能。
扫描电子显微镜测试：
采用sem表征实施例1步骤(1)得到的壳聚糖纳米纤维的形貌和直径分布，sem结果如图1所示，通过静电纺丝技术制备出的壳聚糖纳米纤维表面光滑、直径均匀，纤维平均直径为(150.9±29.50)nm。
核磁共振氢谱测试：
采用1hnmr图谱表征实施例1步骤(4)得到的两性离子cbaa的合成，结果如图2所示：在化学位移5.62～6.11ppm处的质子峰代表cbaa中c＝c双键上的质子峰，在化学位移2.91ppm处的质子峰代表n-(ch3)2的质子峰，在化学位移3.40ppm处的质子峰代表n-ch2-ch2-coo的质子峰，在化学位移3.2ppm和1.89ppm处的质子峰代表nh-ch2-ch2-ch2的质子峰。结果表明，成功制备实验所需的两性离子cbaa。
衰减全反射-傅里叶变换红外光谱测试：
采用atr-ftir表征实施例1中cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs的结构，验证透明质酸功能化的纳米纤维膜ha-cbaa-cnfs是否成功制备，结果如图3所示。
图3(a)中曲线(1)在3024cm-1处是cbaa中c＝c双键上-ch的红外特征吸收峰，曲线(2)在1590cm-1处是氨基上的-nh振动的特征吸收峰，曲线(3)在1375cm-1处出现c-n的特征吸收峰，说明cbaa已成功修饰在纳米纤维表面。
图3(b)中曲线(1)在1541cm-1和1580cm-1处是h-cys-oet.hc中氨基的红外特征吸收峰，曲线(2)在3292cm-1处是ha羧基中o-h的红外吸收峰，曲线(3)在1739cm-1处出现-conh的红外特征吸收峰，表明h-cys-oet.hcl成功修饰在ha上。
图3(c)中曲线(1)在1739cm-1处出现-conh的红外特征吸收峰，曲线(2)在2562cm-1处是mptms上-sh的特征吸收峰，曲线(3)在564cm-1处出现s-s键的红外特征吸收峰，说明合成的ha-cys-mptms化合物中已成功生成s-s键。
图3(d)中曲线(1)在2922cm-1处是ha-cys-mptms上-ch2的红外特征吸收峰，曲线(2)在2943cm-1处是cbaa-cnfs上-ch2的红外特征吸收峰，而曲线(3)在波数为2933cm-1和2878cm-1处出现了增强的-ch2的红外特征吸收峰，说明透明质酸功能化的纳米纤维膜ha-cbaa-cnfs已成功制备。
实施例3
抗蛋白吸附测试：
对实施例1中的cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维进行抗蛋白(bsa和纤连蛋白)吸附评价，用于表征cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜的抗bsa吸附能力和抗纤连蛋白吸附能力，首先，用紫外测得不同浓度的bsa和纤连带白的标准曲线方程。在此基础上，选取bsa的浓度为2mg/ml和纤连带白的浓度为1mg/ml为测试浓度。分别取cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维各10mg，每个样品一式四样放入24孔板中，然后分别向每个孔板加入1ml的bsa和纤连蛋白溶液，在室温下共孵育1h，取出纳米纤维，取上清液并用lamada25型紫外分光光度计对上清液在278nm处的吸光值进行测试，根据不同样品在278nm处的吸光值计算吸附率，测试结果如图4所示。
图4(a)为抗蛋白吸附率测试结果，可知与修饰前的cnfs纳米纤维膜相比，cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs对蛋白的吸附率明显减小，呈现出显著性差异，说明经过两性离子功能化修饰以后，纳米纤维膜获得了优异的抗蛋白粘附性能。图4(b)为抗白细胞细胞率测试结果，可知与修饰前的cnfs纳米纤维膜相比，修饰后的cnfs对蛋白的吸附率明显减小，呈现出显著性差异，进一步证明经过两性离子功能化修饰的纳米纤维膜具有良好的抗蛋白吸附性能。
实施例4
水接触角测试：
通过水接触角测量仪研究了壳聚糖纳米纤维修饰前后的亲水性能，用于表征cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜的亲水性能。将负载有厚度均匀纳米纤维的载玻片放在载样台上，随机选取不同的部位，将仪器注射针头处3μl液滴滴在纤维毡上，通过测量软件测定接触角的大小，并拍摄液滴形貌水接触角，结果如图5所示，可以看出cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维的接触角分别为46.9±4.5°、35.0±2.4°和24.8±2.4°由此可见，修饰后的纳米纤维的接触角是呈逐渐减小的趋势，表明修饰后的纳米纤维膜具有更强的亲水性，进一步说明cbaa和ha已成功修饰在壳聚糖纳米纤维的表面。
实施例5
血液相容性测试：
血液相容性是评定一种材料能否应用于捕获血液中存在ctcs的重要指标。通过溶血实验评价所制备的纳米纤维膜的血液相容性。溶血活力实验用于研究cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜在生物体内的生物相容性。
取1ml健康人的血液，离心5min(转速为150r/min)，弃上清，用pbs洗涤沉淀5次，得红细胞。用pbs按照1:10的比例配置红细胞悬浮液，于4℃冰箱中备用。对照组将0.2ml红细胞悬浊液分别溶于0.8mlpbs中(阴性对照)和0.8mlh2o中(阳性对照)。然后，将cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs壳聚糖纳米纤维按照质量体积比为4mg/ml浸入到稀释10倍后的红细胞悬浮液中，每个纳米纤维样品均取3个平行样，在37℃条件下孵育2h。最后取出纤维毡，将对照组及浸泡过纤维毡的红细胞悬浮液离心1min(10000r/min)，取上清液并用lamada25型紫外分光光度计对上清液在450-800nm处的吸光值进行测试，根据不同样品在540nm处的吸光值计算溶血率，结果如图6所示，(a)为cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维对血液相容性评价的紫外吸收图谱；(b)为(a)图在500-600nm处的放大图。
由图6可知在450-800nm范围内，对照组水中上清液的吸光值明显较高，这表明血红蛋白含量较高，即红细胞在水中完全涨破，出现严重的溶血现象。但在cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维和pbs中，上清液吸光值很低，说明未发生红细胞涨破。根据540nm处吸光值计算可知，当功能化的纳米纤维与人血红细胞悬浮液体积比4mg/ml时，材料的溶血率为0.98％、0.82％和0.64％，其值都远远均低于临界值5％。表明cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维均不能使人血细胞产生溶血现象，具有良好的血液相容性。
实施例6
抗凝血测试：
为了进一步验证修饰后的壳聚糖纳米纤维的血液相容性，采用动态凝血时间方法对功能化的纳米纤维进行抗凝血性能评价。抗凝血实验用于表征cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜的抗凝血性能。
首先将cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维剪成圆形(φ＝14mm)，放入24孔板中，每个样品取4个平行样(对照组是玻片，coverslip)。然后向每孔纤维毡以及对照组上滴加20μl健康人血液及10μlcacl2溶液(0.2mol/l)，置于37℃条件下孵育5、10、20、40、60min。在每个培养时间结束后，向每个孔板加入3ml蒸馏水，然后再孵育5min，用紫外分光光度计测定540nm的吸光值，对照组玻片、cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维抗凝血性能的评价结果如图7所示。
因为血红蛋白的含量越高代表发生凝固的血细胞越少，即材料的抗凝血性能越好。由图7可知在不同的时间点，cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维上清液中血红蛋白的吸光值均显著高于玻片和cnfs，这说明靶向修饰后的纳米纤维具有较好的抗凝血活性。
实施例7
癌细胞静态捕获测试：
为了验证靶向纤维材料具有特异性捕获癌细胞的效果，以具有cd44受体高表达的肺癌细胞(a549)为细胞模型来检验制备的ha修饰的功能化纳米纤维特异性静态捕获癌细胞的效果。将覆盖有cnfs、cbaa-cnfs和ha-cbaa-cnfs纳米纤维的圆形载玻片
癌细胞静态释放和活死细胞染色测试：
为了验证二硫键不同时间(10，20，30，40，50，60min)的释放效率以及释放后细胞的活性。仍然选取具有cd44受体高表达的a549细胞为模型来检验靶向材料的释放效果。将覆盖有ha-cbaa-cnfs纳米纤维的圆形载玻片
重复上述步骤，但加入孔板的a549细胞不用染色，同样的时间段，用gsh处理，收集回收液，用活死细胞试剂盒对释放下来的细胞进行染色，在荧光显微镜下(10×)观察，用细胞血球计数板对细胞进行计算，其释放存活率如图9(c)所示：随着gsh作用时间的增长(10-60min)，释放下来的癌细胞的存活率越低(99％-80％)，在最佳的释放时间段内(40min)，释放下来的癌细胞的存活率高达90％，可以用于后续培养和分析。
实施例8
癌细胞动态捕获测试：
为了验证ha修饰后的壳聚糖纳米纤维对癌细胞的捕获效果，进行了不同流速下的捕获效率的测定。动态捕获实验用于研究不同流速下微流控系统对癌细胞的捕获效率，利用荧光显微镜对结果进行观察和计数，计算其捕获效率。
以表面修饰有ha的壳聚糖纳米纤维膜为基底，通过等离子处理将玻璃基底、功能化的壳聚糖纳米纤维膜与微流控通道键合，得到微流控芯片，包括：(1)具有277个椭圆柱阵列的微流控芯片细胞捕获通道，通道的一段有样品注入口，另一端有出口样，进口和出口处以等腰三角的方式设计；(2)修饰有ha的壳聚糖纳米纤维膜，纳米纤维膜夹在载玻片和聚二甲聚硅氧烷(pdms)通道的中间，形成夹层；(3)修饰有ha的纳米纤维膜，根据癌细胞表面有特定表达cd44的抗原，cd44受体与ha具有很强的结合力，能特异性捕获表面表达cd44的癌细胞，从而将癌细胞捕获在功能化的纳米纤维上，将癌细胞分离出来。
选取a549细胞作为癌细胞的模型，取稀释一定倍数(60倍)的钙黄绿素(c-am)20μl加入到a549细胞悬浮液中，37℃条件下孵育12min。之后加培养液离心5min(1000r/min)，用细胞计数器对细胞计数，分别取1×105个a549细胞，在不同的流速下(0.5ml/h、1.0ml/h、2.0ml/h、4.0ml/h和6.0ml/h)通入到微流控通道。由于纳米纤维膜表面修饰有大量的ha，利用受体和配体的结合，当癌细胞在微流通道中沿着纤维表面流过时，细胞会被靶向捕获，粘附在纤维表面，而非靶向细胞(白细胞)就会流出通道，从而实现分选循环肿瘤细胞的目的。
在荧光显微镜下分别对不同流速下捕获的癌细胞进行计数，求出癌细胞的捕获效率，结果如图10(a)所示，可知随着流速的提高，癌细胞的捕获效率降低，当流速为0.5ml/h时，捕获效率高达93.93％；当流速为6.0ml/h时，捕获效率为60.9％。在保证捕获效率较高的情况下，选取1ml/h作为后续实验流速参数。在流速为1.0ml/h条件下，按上述的操作步骤，分别选取hela细胞、kb细胞和mcf-7细胞通过微流控通道，在荧光显微镜下分别对捕获的癌细胞计数，求出癌细胞的捕获效率如图10(b)所示，在相同的条件下，靶向纳米纤维对hela细胞的捕获效率最高，捕获效率为94.9％；对kb细胞的捕获效率最低，捕获效率为80.8％。综上所述，癌细胞动态捕获测试结果表明ha-cbaa-cnfs纳米纤维膜能够特异性捕获表面高度表达cd44受体的循环肿瘤细胞。
实施例9
为了验证ha修饰后的壳聚糖纳米纤维对模拟患者的血液中的循环肿瘤细胞的分选效果，选取上述注射泵设定在1.0ml/h的流速下，将不同数量的癌细胞加入到裂解后的健康人血液中，研究微流控芯片对癌细胞的捕获效率。
取1ml新鲜的健康人血液，离心5min(1500r/min)，去除血清，然后将稀释一定倍数(60倍)的dapi(500μl)加入到血液中对白细胞染色10min，然后加入pbs溶液离心5min(1000r/min)，以去除多余未结合的染料。选取a549细胞作为肺癌细胞的模型，取稀释一定倍数(60倍)的钙黄绿素(c-am)20μl加入到a549细胞悬浮液中，37℃条件下孵育12min，之后，加培养液进行离心5min(1000r/min)，用细胞计数器对细胞计数，分别取20、50、100、200和300个a549细胞加入到上述健康人血液中，以1.0ml/h的流速通入微流控通道，在荧光显微镜下对捕获的癌细胞进行观察和计数，计算其捕获效率，结果如图11所示，该微流控系统对不同数量(20-300个/ml)循环肿瘤细胞的分离效率均具有理想的捕获效率(85％-94.9％)，捕获效率大致呈先增大后减小的趋势，说明该微流控装置满足对不同浓度癌细胞捕获分离的要求。
实施例10
免疫染色测试：
为了进一步说明本发明的微流控芯片装置对血液中循环肿瘤细胞具有分离的效果，能够分选出患者血液中的循环肿瘤细胞，采用肺癌患者的血进行试验，将裂解过红细胞的患者血液通入本发明的微流控芯片系统中，然后对细胞进行免疫染色，利用免疫荧光染色对捕获的循环肿瘤细胞进行鉴定。
首先对纳米纤维上捕获的细胞用4％的多聚甲醛进行固定，然后用0.1％的triton-100溶液对细胞进行通透10min，再用1％的bsa溶液封闭30min，然后通入ck7(稀释50倍，10μl)和anti-cd45(稀释50倍，20μl)染色1h，最后7min通入dapi(稀释60倍，500μl)，然后在荧光显微镜下观察，根据癌细胞鉴别标准，dapi对所有的细胞都进行染色，anti-cd45只对白细胞进行染色，而ck7只能鉴别循环肿瘤细胞。ck+/cd45-/dapi+为血液中的循环肿瘤细胞，ck-/cd45+/dapi+为白细胞，表明该装置能实现对患者血液中循环肿瘤细胞的鉴别和分离的目的。
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