涂层-微射流联用制备功能型自组装胶原蛋白纤维的方法

本技术属于功能食品领域，具体的，本技术提供了一种涂层-微射流联用制备功能型自组装胶原蛋白纤维的方法。

背景技术：

1、随着全球人口老龄化的加剧和骨关节疾病的流行，通过功能食品进行预防的需求日益增长。非变性ii型胶原蛋白(uc-ii)由三条均匀的α1肽链组成，形成完整的三螺旋结构。已有的研究表明，uc-ii能够通过“口服耐受”治疗自身免疫性疾病—类风湿性关节炎(ra)。口服耐受是一种免疫机制，通过消化系统进入体内的外部物质会被免疫系统识别并做出反应。然而，uc-ii的三螺旋结构很脆弱，容易受到温度、酶、机械作用等影响而变性。三螺旋结构被破坏的ii型胶原蛋白则会失去其生理活性。赵谋明等人(2021)提出“一种具有抗消化性质的可溶性非变性ⅱ型胶原蛋白-多糖复合物及其制备方法”，通过将但非变性ⅱ型胶原蛋白-多糖形成复合物提升其消化稳定性，但未关注到uc-ii的热稳定及其潜在的应用。在热力学平衡状态下，胶原蛋白分子可以聚集形成有序的纤维，即胶原蛋白自组装。近年来，胶原蛋白纤维因其良好的生物相容性、可降解性和机械性能，已成为构建细胞支架、开发生物膜的理想材料。此外，食品级蛋白质纤维具有高纵横比和结构灵活性，已被应用于对环境变化敏感的生物活性化合物的封装、保护和释放。据报道，在蛋白质内包封或与蛋白质络合是改善功能因子在水溶液中溶解度和提高其生物利用度的一种有效途径。然而，胶原蛋白纤维也存在对外界环境胁迫力的不稳定性，例如在高温下变性、在胃肠消化作用下的迅速酶解等缺陷。

2、涂层结构被广泛用于开发结构化纳米给药系统，以封装、保护和释放生物活性物质。张浩等人(2020)在“醇溶蛋白基核壳纤维膜及食品贮藏保鲜材料和制备方法”中采用静电纺丝法制备醇溶蛋白基核壳纤维，并作为姜黄素的载体，但此方法操作复杂且需消耗大量有机溶剂，对环境不友好。此外，动态高压微射流技术技术可以用于改善蛋白质的物理性质，例如稳定性和溶解性等。王金梅等人(2018)提出“热处理结合高压微射流处理制备稳定型大豆蛋白-甾醇颗粒的方法，用于生产粒径更小、稳定性更高的甾醇输送载体。但微射流技术用于胶原蛋白纤维稳态化处理未见报道。

技术实现思路

1、海藻酸钠是一种天然多糖，它的分子结构中包含带负电荷的羧基。当钙离子与带负电荷的羧基结合时，会形成钙离子与海藻酸钠之间的交联，这种交联结构可以使海藻酸钠形成三维网络。动态高压微射流技术技术是改善大分子物质结构和功能性质的有效手段。本技术中，采用钙离子诱导海藻酸钠涂层与动态高压微射流技术联用，提高非变性ii型胶原蛋白纳米纤维的稳定性，还能实现对生物活性物质姜黄素负载和缓慢释放的功能。

2、一方面，本技术提供了一种涂层-微射流联用制备功能型自组装胶原蛋白纤维的方法，所述方法包括：

3、(1)将非变性ii型胶原蛋白以质量比0.05-5％分散在乙酸中，然后与pbs缓冲液混合均匀，调节ph至4.0-7.0，孵育得到非变性ii型胶原蛋白纳米纤维；

4、(2)将海藻酸钠溶解在去离子水中得到质量分数为0.1-2％的海藻酸钠溶液；磁力搅拌条件下，将非变性ii型胶原蛋白纳米纤维注入海藻酸钠溶液中得到非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液；磁力搅拌条件下，将cacl2溶液滴入非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液中，得到钙离子诱导海藻酸钠涂层的非变性ii型胶原蛋白分散液；

5、(3)将步骤(2)所得分散液密封于10kda的透析袋中，置于去离子水中透析8-24小时，以除去未交联的钙离子；

6、(4)将步骤(3)所得分散液加入动态高压微射流均质机，在60-180mpa条件下循环均质1-3次，均质温度保持在在20-30℃，得到海藻酸钠涂层的非变性ii型胶原蛋白纳米纤维。

7、进一步地，所述方法还包括：(1-2)用乙醇配置8-10mg/ml的姜黄素储备液；磁力搅拌下，将姜黄素储备液与非变性ii型胶原蛋白纳米纤维混合。

8、另一方面，本技术提供了一种高稳定性胶原蛋白纳米纤维，所述胶原蛋白纳米纤维按照以下方法制备：

9、(1)将非变性ii型胶原蛋白以质量比0.05-5％分散在乙酸中，然后与pbs缓冲液混合均匀，调节ph至4.0-7.0，孵育得到非变性ii型胶原蛋白纳米纤维；

10、(2)将海藻酸钠溶解在去离子水中得到质量分数为0.1-2％的海藻酸钠溶液液；磁力搅拌条件下，将非变性ii型胶原蛋白纳米纤维注入海藻酸钠溶液中得到非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液；磁力搅拌条件下，将cacl2溶液滴入非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液中，得到钙离子诱导海藻酸钠涂层的非变性ii型胶原蛋白分散液；

11、(3)将步骤(2)所得分散液密封于10kda的透析袋中，置于去离子水中透析8-24小时，以除去未交联的钙离子；

12、(4)将步骤(3)所得分散液加入动态高压微射流均质机，在60-180mpa条件下循环均质1-3次，均质温度保持在在20-30℃，得到海藻酸钠涂层的非变性ii型胶原蛋白纳米纤维。

13、另一方面，本技术提供了一种高稳定性的，具备负载姜黄素功能的胶原蛋白纳米纤维，所述胶原蛋白纳米纤维按照以下方法制备：

14、(1)将非变性ii型胶原蛋白以质量比0.05-5％分散在乙酸中，然后与pbs缓冲液混合均匀，调节ph至4.0-7.0，孵育得到非变性ii型胶原蛋白纳米纤维；

15、(1-2)用乙醇配置8-10mg/ml的姜黄素储备液；磁力搅拌下，将姜黄素储备液与非变性ii型胶原蛋白纳米纤维混合；

16、(2)将海藻酸钠溶解在去离子水中得到质量分数为0.1-2％的海藻酸钠溶液液；磁力搅拌条件下，将非变性ii型胶原蛋白纳米纤维注入海藻酸钠溶液中得到非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液；磁力搅拌条件下，将cacl2溶液滴入非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液中，得到钙离子诱导海藻酸钠涂层的非变性ii型胶原蛋白分散液；

17、(3)将步骤(2)所得分散液密封于10kda的透析袋中，置于去离子水中透析8-24小时，以除去未交联的钙离子及游离的姜黄素；

18、(4)将步骤(3)所得分散液加入动态高压微射流均质机，循环均质，得到负载姜黄素的海藻酸钠涂层的非变性ii型胶原蛋白纳米纤维。

19、进一步地，步骤(1)中将非变性ii型胶原蛋白以质量比0.1％分散在乙酸中。

20、进一步地，步骤(2)中将非变性ii型胶原蛋白纳米纤维注入海藻酸钠溶液中得到的非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液中非变性ii型胶原蛋白纳米纤维与海藻酸钠质量比为1:1。

21、进一步地，步骤(1)中乙酸和pbs缓冲液的摩尔浓度均为0.1m。

22、进一步地，步骤(1)中冰浴中将非变性ii型胶原蛋白以质量比0.05-5％分散在乙酸中，然后与pbs缓冲液混合均匀。

23、进一步地，步骤(1)中孵育条件为37℃，60min。

24、进一步地，步骤(2)中磁力搅拌条件均为600rpm，30min。

25、进一步地，步骤(2)非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液中非变性ii型胶原蛋白纳米纤维和海藻酸钠的质量比为0.1-10。

26、进一步地，步骤(2)cacl2溶液滴入非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液中获得的溶液中ca2+浓度为1-10mm，优选5-10mm。

27、进一步地，步骤(2)中离心条件为10000rpm，10min。

28、进一步地，步骤(2)中pbs缓冲液的ph值为5.0，非变性ii型胶原蛋白-海藻酸钠混合分散液中非变性ii型胶原蛋白的浓度为0.1％。

29、进一步地，步骤(1-2)中姜黄素和非变性ii型胶原蛋白的质量比为0.01-0.10。

30、进一步地，步骤(1-2)中磁力搅拌条件为600rpm，30min。

31、进一步地，步骤(3)中透析时间为20小时。

32、进一步地，步骤(4)中均质压力为60-180mpa，均质次数为1-3次，均质温度为20-30℃。

33、本技术中的非变性ii型胶原蛋白材料可以使用任何本领域已知可用的材料制备，或者购买市售成品。非限制性地，使用以下方法制备：

34、预处理：去除附着在鸡胸软骨表面的肉和其他组织，用去离子水清洗，切成小块；脱脂：将鸡胸软骨小块浸泡2-5倍体积的1-5％ naoh溶液中8-24小时，离心获得沉淀物i；除杂蛋白：用2-5倍于沉淀物i的1-5mol/l nacl处理，搅拌8-24小时，离心取沉淀物ii；酶解：将沉淀物ii分散在2-5倍于沉淀物ii体积的含有0.01-0.1％胃蛋白酶的0.05m乙酸中，搅拌、离心取上清液；盐析：上清液用1-5m nacl盐析，离心取沉淀物iii；透析脱盐：沉淀物iii用0.5m乙酸重新溶解，用去离子水透析、冻干。优选在4℃条件下进行，离心条件均为12000rpm离心20分钟。