专利名称：具有氯苯降解能力的皮式罗尔斯顿菌h2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可高效降解氯苯及其衍生物的氯苯降解菌一皮式罗尔斯顿菌 H2及其应用。
背景技术：
氯苯是一种易挥发的单环卤代芳香类化合物，广泛用于染料、塑料、香料、医药、农 药、有机合成的中间体；用于制造苯酚、硝基氯苯、苯胺以及杀虫剂DDT;还用于制取溶剂 和橡胶助剂、油漆、快干墨水及干洗剂等，是环境中分布较广、难生物降解的一类有毒有机 化合物。氯苯类化合物具有生物积累性和生物毒性，对人体具有致癌作用，被美国环保局 (EPA)列入优先控制污染物名单。生物降解技术具有反应条件温和、运行费用低和无二次污 染等特点，是降解该类物质最有效的方法之一。采用生物技术降解氯苯关键之一便是获得具有高效降解氯苯能力的优良菌株。 目前，国内外学者已对氯苯类化合物的生物降解进行了大量的研究，但由于氯苯易挥发 和难于生物降解，迄今为止，已分离到氯苯降解菌种类还比较有限，主要包括假单胞菌 (Pseudomonas)、气单胞菌(Aeromonas)链球菌属(Streptococcus)、考克氏菌(Kocuria)、 红球菌(Rhodococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、节杆菌(Arthrobacter)、寡食单胞菌 (Stenotrophomonas)等。此外，已分离到的菌株降解效率也有待于进一步提高。经检索有关专利文献，尚未见本发明中在好氧条件下应用罗尔斯顿菌(Ralstonia Pickettii)降解氯苯的报道。该降解菌的发现对氯苯生物净化的工程实践具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株高效、快速降解氯苯类化合物的菌株及其应用。本发明采用的技术方案是一株氯苯降解菌——皮式罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii strain)H2，保藏于 中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2009年 11 月 4 日，保藏号为 CCTCC No =M 209250。所述皮式罗尔斯顿菌H2生物学特征如下菌落呈淡乳白色，圆形，边缘整齐，光滑 湿润，直径为0. 5 Imm ；电镜观察，大小为(0. 4 0. 6) μ mX (0. 9 1. 3) μ m，无鞭毛，无 芽孢；电子显微镜下菌体形态为短杆菌，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性。所述皮式罗尔斯顿菌H2的16S rDNA序列如下(Genebank的登录号为GQ906999)CATGCAAGTCGAACGGCAGCATGATCTAGCTTGCTAGATTGATGGCGAGTGGCGAACGGGTG
AGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTAGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGTGGGGGACCGCAAGGCCTCATGCTATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTT
4
CGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATGGCTCTGGTTAATACCTGGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGGACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGCAAGACCGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTGGTGACTGCACGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAGAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCTCGAAAGAGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCATACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAGAAAATGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGTAGGGTTCATGACTGGGGtGAAGTCGT。本发明还涉及所述的皮式罗尔斯顿菌H2在微生物降解氯苯类化合物或其衍生物 中的应用，所述氯苯类化合物或其衍生物为下列之一氯苯、二氯苯及苯、苯酚、氯苯酚。优选的，所述降解在20 38°C、pH 5 9下进行。更为优选的，所述降解在30°C、 PH 7下进行。所述降解优选在酵母浸膏存在下进行。本发明菌株在纯培养条件下，能将低于100mg/L的氯苯在20小时内完全降解，对 氯苯的最高降解浓度可达220mg/L，添加酵母浸膏(添加量为20 150mg/L)对降解具有明 显的促进作用，对100mg/L的氯苯添加酵母浸膏(20 150mg/L)，降解速率可从4. 8mg/L/h 提高至6. 7mg/L/h。该菌株降解污染物具有一定的广谱性，除可降解氯苯外，还可降解二氯 苯、苯、苯酚、氯苯酚等芳香族化合物。本发明的有益效果主要体现在提供了一株高效、快速降解氯苯类化合物的菌株 该菌株降解污染物具有一定的广谱性，该菌株对氯苯具有更高效的降解能力，对降解氯代 芳香族族化合物及其衍生物具有一定的广谱性，在工业废气和废水的生物净化中具有很好 的应用前景。
图 1 为 Ralstonia pickettii strainH2 的透射电镜照片；图2为不同温度下菌Ralstoniapickettii strainH2生长和对氯苯的降解曲线；图3为不同pH下菌Ralstonia pickettii strainH2生长和对氯苯的降解曲线；图4、图5为菌Ralstonia pickettii strainH2对不同初始浓度的氯苯的降解和 生长曲线；图6为菌Ralstoniapickettii strainH2在添加酵母浸膏条件下氯苯降解和生长曲线；图7为菌Ralstoniapickettii strainH2在添加酵母浸膏条件下对氯苯降解速率 的影响。图8为菌Ralstoniapickettii strainH2对二氯苯、苯、苯酚、氯苯酚降解率。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 :Ralstonia pickettii strainH2的分离、纯化及其鉴定1. Ralstonia pickettii strainH2 的分离及纯化Ralstoniapickettii strainH2是采集某净化氯苯废气的生物滴滤床填料表面的 生物膜，经分离纯化得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下从生物滴滤床中取两颗填料，用30mL无菌水将生物膜洗于摇瓶中，置于摇床 160rpm，3(TC振荡1小时。然后利用氯苯降解菌筛选培养基进行菌株筛选。氯苯降解菌 筛选培养基成分=KH2PO4,0. 5g ；Na2HPO4. 12Η20，0. 5g ； (NH4) 2S04，2g ；Mg SO4 · 6H20，0. Ig ； CaCl2,0. Olg ；MnSO4 · H20,0. 13mg ；ZnCl2,0. 23mg ；CuSO4 · H20,0. 03mg ；CoCl2 · 6H20,0. 42mg ； Na2MoO4 · 2Η20，0· 15mg ；AlCl3 · 6Η20，0· 05mg ；琼脂，15g ；蒸溜水，IOOOmL ；pH 7. O 7. 5。氯 苯另外添加200mg/L。按照菌株分离纯化的常规方法，在恒温培养箱30°C培养3 5天， 挑取平板上长出的单菌落，得到多株纯菌。将筛选到的多株氯苯降解菌在含有氯苯为唯一碳源的无机盐培养基中考察菌株 对氯苯的去除效果，通过同空白实验的对照，结果得到了一株高效降解氯苯的菌株H2。所 用的培养基成分为=KH2PO4,0. 5g ；Na2HPO4. 12H20，0. 5g ； (NH4)2S04, 2g ；Mg SO4 · 7Η20，0· Ig ； CaCl2,0. Olg, MnSO4 · H20,0. 13mg ；ZnCl2,0. 23mg ；CuSO4 · H20,0. 03mg ；CoCl2 · 6H20,0. 42mg ； Na2MoO4 ·2Η20，0. 15mg ；AlCl3 · 6Η20，0· 05mg ；蒸溜水补足至 IOOOmL ；pH 7. O 7. 5。氯苯另 外添加，0. 2g/L。2. Ralstonia pickettii strainH2 的 16S rDNA 鉴定通过16S rRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，确定H2菌为Ralstonia pickettii strain。具体步骤如下采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2. 2，上海申能博彩生物科技有限公 司)提取Ralstonia pickettii strainH2的DNA，4°C保存。然后作为PCR反应的模板，设 计引物，扩增Ralstonia pickettii strainH2的全序列DNA，上下游引物序列分别如下BSF8/20 5' -AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'BSR1541/20 5' -AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'PCR反应程序设定为先94°C预变性4min ；然后94°C变性lmin，59°C退火lmin， 72°C延伸1. 5min，循环35个周期；然后72°C延伸IOmin ；最后4°C保持lOmin。将PCR产物 进行测序(上海英潍捷基)，测序结果见序列表。将H2的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号GQ906999，同时同 Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Ralstonia属，然后通过系统发育树的 建立，H2可能为Ralstonia pickettii。为了进一步确定鉴定结果，通过Biolog鉴定系统的分析，最终确定H2为Ralstonia pickettii。实施例2 =Ralstonia pickettii H2对氯苯生物降解性能检测1.不同温度下菌Ralstonia pickettii H2对氯苯的生物降解特性在不同温度下实施Ralstonia pickettii H2对氯苯的降解实验，发现其在25 38°C具有较高的降解苯系化合物的能力，从实际应用角度看，30°C为最佳温度，此时去除率 最高，具体实施步骤如下分别取 150mL 无机盐培养基(KH2PO4,0. 5g ；Na2HPO4. 12Η20，0. 5g ； (NH4) 2S04，2g ； Mg SO4 · 7H20,0. Ig ；CaCl2,0. Olg, MnSO4 · H20,0. 13mg ；ZnCl2,0. 23mg ；CuSO4 · H20,0. 03mg ； CoCl2 · 6Η20，0· 42mg ；Na2MoO4 · 2Η20，0· 15mg ；AlCl3 · 6Η20，0· 05mg ；蒸溜水补足至 IOOOmL) 分装至14个500mL的厌氧瓶中，灭菌。分成两组，每组7瓶，其中一组每瓶加入新鲜培养 的H2的菌悬液，OD600为0. 15，接种量为2mL/150mL，以氯苯为唯一碳源，氯苯的初始浓度为 100mg/L。分别置于 15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、38°C、40°C 的摇床中 160rpm 培养；另外 7 瓶同样的未接菌的培养基分别置于对应的温度同时培养，作为空白对照。培养36h后，取样 气相检测氯苯的浓度，同时测定菌株的菌密度，绘制氯苯的去除率曲线图及H2的生长曲线 图。结果如图3所示，表明在温度为15°C时，菌株对苯系化合物的去除率较低。随着温 度的逐渐提高，菌株对苯系化合物的去除率也随之提高；在温度为20 38°C时为该菌株较 为适宜生长的温度，菌株的生长和对氯苯的去除率都达到了较高的值 ’温度30°C和35°C时 达到了最大值，36h对氯苯的去除率高达97. 5%。随着温度的进一步提高，菌株的生长和降 解能力又受到抑制。2.不同pH下菌Ralstoniapickettii H2对氯苯的降解特性在不同pH下实施Ralstonia pickettii H2对氯苯的降解实验，结果表明其最佳 的生长降解PH值为7，具体实施方案如下在7个500mL的厌氧瓶中加入150mL等量的无机盐培养基，氯苯作为唯一碳源，初 始浓度为100mg/L，分别调节pH至4、5、6、7、8、9、10 ；同时准备7瓶相同的培养基作为空白 对照。均接种2mL 0D600为0. 15的新鲜培养的H2菌悬液，在30°C，160rpm下培养。分别 在Oh，36h取样，检测培养基中的氯苯浓度变化和菌株的菌密度，绘制氯苯去除率曲线图及 H2的生长曲线图。结果如图4所示，在pH为4、5、9、10时，H2对氯苯去除效率较差。在？!1为4、10 的培养液中，溶液较澄清，同空白溶液一样，表明菌株生长十分不好。在pH为5 9的条件 下，细菌都能以氯苯为唯一碳源生长，只是生长和降解速率有所不同，在PH为7时，菌株H2 的生长和降解速率最快，36h对氯苯的去除率高达100%。3.菌Ralstoniapickettii H2对不同初始浓度的氯苯的降解情况在不同氯苯初始浓度下，实施H2对氯苯的降解，结果发现H2对氯苯的耐受浓度为 250mg/L。具体实施方案如下在500mL的厌氧瓶中加入150mL的无机盐培养基，氯苯作为唯一碳源。氯苯的初 始浓度为 10、25、50、80、100、150、200、220、250mg/L。分别接种等量 2mL OD600 为 0. 15 的菌 悬液，30°C，160rpm培养，间隔一段时间取样，绘制H2对氯苯的降解曲线图以及H2的生长曲 线图。
从图5可以看出在氯苯浓度低于250mg/L时，H2可快速地降解氯苯，细菌生长良 好，而在250mg/L时，菌株生长和降解受到明显抑制。4.菌Ralstoniapickettii strain H2在添加酵母浸膏(YE)条件下氯苯降解情况添加不同浓度的酵母浸膏(北京双旋微生物培养基制品厂)，实施对氯苯的降解， 结果发现酵母浸膏的添加对H2降解氯苯有明显的促进作用。具体实施方案如下在500mL的厌氧瓶中加入150mL的无机盐培养基，氯苯的初始浓度为100mg/L， 分别添加10、20、50、100、150mg/L的YE，分别接种等量2mL OD600为0. 15的菌悬液，30°C， 160rpm培养，间隔一段时间取样，绘制H2对氯苯的降解曲线图及H2的生长曲线图。从图6可看出添加YE后，10mg/L的YE对H2降解氯苯没有促进作用，20、50、100、 150mg/L的YE都对H2降解氯苯有明显的促进作用，并且YE的浓度越高，促进作用越明显。从图7可看出添加不同浓度YE后，H2对氯苯的降解速率有了明显的提高，并且YE 的浓度越高，降解效率提高的越显著。实施例3 =Ralstonia pickettii H2对苯、二氯苯、苯酚、氯苯酚的生物降解性能检 测分别取150mL无机盐培养基分装至8个500mL的厌氧瓶中，灭菌。分成2组，每 组4瓶，其中一组每瓶加入新鲜培养的H2的菌悬液，OD600为0. 15，接种量为2mL/150mL，分 别以初始浓度50mg/L的苯/ 二氯苯/苯酚/氯苯酚为唯一碳源。分别置于30°C的摇床中 160rpm培养；另外4瓶同样的未接菌的培养基分别置于对应的温度同时培养，作为空白对 照。培养36h后，取样分别气相色谱检测苯/ 二氯苯，液相色谱检测苯酚/氯苯酚的浓度， 结果如图8显示，36h菌H2对二氯苯、苯、苯酚、氯苯酚的去除率分别为93%、72%、67%、 52%。
8
权利要求
一株氯苯降解菌——皮式罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii strain)H2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2009年11月4日，保藏号为CCTCC NoM209250。
2.如权利要求1所述的皮式罗尔斯顿菌H2，其特征在于所述皮式罗尔斯顿菌H2生物 学特征如下菌落呈淡乳白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，直径为0. 5 Imm ；电镜观察，大 小为(0.4 0.6) μ mX (0.9 1.3) μ m，无鞭毛，无芽孢；电子显微镜下菌体形态为短杆 菌，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性。
3.如权利要求1所述的皮式罗尔斯顿菌H2，其特征在于所述皮式罗尔斯顿菌H2的16S rDNA序列如下CATGCAAGTCGAACGGCAGCATGATCTAGCTTGCTAGATTGATGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTAGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGTGGGGGACCGCAAGGCCTCATGCTATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATGGCTCTGGTTAATACCTGGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGGACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGCAAGACCGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTGGTGACTGCACGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAGAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCTCGAAAGAGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCATACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAGAAAATGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTTTACCAGAAGTA GTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGTAGGGTTCATG ACTGGGGtGAAGTCGT。
4.如权利要求1所述的皮式罗尔斯顿菌H2在微生物降解氯苯类化合物或其衍生物中 的应用，所述氯苯类化合物或其衍生物为下列之一氯苯、二氯苯、苯、苯酚、氯苯酚。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述降解在20 38°C、pH5 9下进行。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述降解在30°C、pH7下进行。
7.如权利要求4 6之一所述的应用，其特征在于所述降解在酵母浸膏存在下进行。
全文摘要
本发明提供了一株可高效降解氯苯及其衍生物的氯苯降解菌——皮式罗尔斯顿菌H2及其应用。所述皮式罗尔斯顿菌(Ralstoniapickettii strain)H2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期2009年11月4日，保藏号为CCTCC NoM 209250。本发明的有益效果主要体现在提供了一株高效、快速降解氯苯类化合物的菌株该菌株降解污染物具有一定的广谱性，该菌株对氯苯具有更高效的降解能力，对降解氯代芳香族族化合物及其衍生物具有一定的广谱性，在工业废气和废水的生物净化中具有很好的应用前景。
文档编号A62D101/22GK101880642SQ20101018133
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者冷守琴, 张丽丽, 朱润晔, 王家德, 蒋轶锋, 陈建孟 申请人:浙江工业大学