专利名称：一种提高pva降解速度的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种提高PVA降解速度的发酵方法，属于发酵工程领域，具体来说是 一种通过添加1，4_ 丁二醇提高PVA降解速度的发酵方法。
背景技术：
PVA是一种可生物降解的化工高分子聚合物。它具有良好的应用性能，例如良好 的热稳定性、很强的粘性和抗溶剂性等。但由于在自然环境下PVA的降解速度很低，大量废 弃的PVA导致了严重的环境污染。关于提高PVA降解速度的研究主要分为两大类(1)对 PVA进行化学修饰。例如TakasU曾报道用葡萄糖对PVA上的部分羟基进行糖基化修饰， 可以加速PVA主链的生物降解；但也有报道称用邻苯二甲酸苷或乙醛修饰PVA的部分羟基 后，PVA降解速度反而下降。(2)筛选能高效降解PVA的微生物。但结果显示各研究小组筛 选得到的微生物对PVA的降解速度都处于较低的水平。所以仍然有必要寻找新的方法来提 高PVA的降解速度。一种可行的方法就是用发酵的方法提高细胞对PVA的降解活力和细胞 的生长活力，从而从整体上提高PVA的降解速度。在混合微生物相对高效降解PVA的基础 上，本技术通过一种与PVA结构类似的小分子碳源(1，4_ 丁二醇)显著提高了 PVA的降解 速度。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种提高PVA降解速度的发酵方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下在混合微生物降解PVA的过程中， 添加1，4-丁二醇。所述1，4_ 丁二醇的添加方式为在发酵36h向发酵液中一次性添加7. 65g/L 1， 4- 丁二醇；所述1，4_ 丁二醇的添加方式为在发酵21h向发酵液中一次性添加7. 65g/L 1， 4- 丁二醇；所述1，4_ 丁二醇的添加方式为在发酵21h向发酵液中一次性添加7. 65g/L 1， 4_ 丁二醇，然后在发酵30h向发酵液中连续流加1，4_ 丁二醇，流加速度为0. 3g/L/h。所述混合微生物为从无锡太平洋纺织厂PVA退浆车间下水道口筛选出一个可以 彻底降解培养基中lg/L PVA的混合微生物体系(Chen J, Zhang Y，Du G_C，Hua Z_Z，Zhu Y， Biodegradation of polyvinyl alcohol by a mixed microbial culture,Enzyme Microb. Technol.，2007,40(7)，1686-1691)。混合微生物降解PVA的培养基组成为基础培养基(g/L)酵母粉2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1， FeS04 7H200. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 灭菌 15min。混合微生物降解PVA的过程为液体种子培养方法500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30°C振荡培养 36h ；分批补料发酵法1 :3L发酵罐装1. 5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/ LPVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )，接种150mL液体种子后，pH通过添加 2. Omol/L HC1和2. Omol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm) 和通气量(2L/min-3L/min)控制在60%饱和度，温度控制在30°C，在发酵36h向发酵液中 一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇；分批补料发酵法2 :3L发酵罐装1. 5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/ LPVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )，接种150mL液体种子后，pH通过添加 2. 0mol/L HC1和2. 0mol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm) 和通气量(2L/min-3L/min)控制在60%饱和度，温度控制在30°C，在发酵21h向发酵液中 一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇；连续补料发酵法3L发酵罐装1. 5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )，接种150mL液体种子后，pH通过添加 2. 0mol/L HC1和2. Omol/LNaOH控制在7. 20,溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm) 和通气量(2L/min-3L/min)控制在60%饱和度，温度控制在30°C，在发酵21h向发酵液中 一次性添加7. 65g/L 1，4_ 丁二醇，然后在发酵30h向发酵液中连续流加1，4_ 丁二醇，流加 速度为0. 3g/L/h。PVA含量测定采用Finley法，具体方法为将发酵液离心(10000r/min，10min)，弃去沉淀，收集上清液。将上清液经微孔滤膜 (孔径0. 45 u m,直径50mm)过滤，然后用0. lmol/L磷酸钾缓冲液(pH 8. 0)透析24h，即为 粗酶液。在5X15试管中加入0. 5mL粗酶液和0. 5mL底物(lg/L PVA1799溶于pH 8. 0的 磷酸钾缓冲液中)，将此混合体系于35°C反应6h，分别测定反应前后反应混合液所对应PVA 含量的吸光度。每分钟吸光度下降0. 001定义为一个酶活单位。1，4-丁二醇测定方法为首先向发酵液中添加65g/L的乙酸钙，然后将样品进行离心(10，000Xg、10min) 去除沉淀，收集上清液。将上清液经微孔滤膜(孔径0.45 ym，直径50mm)过滤。然后用 Waters 600HPLC System (Waters Corp. , USA) with an 2487UV detector 检测 1，4-丁二醇。 固定相是WatersSugar-Pakl，流动相是0. 4mL/min的去离子水。柱温为85°C。细胞干重测定方法为将发酵液进行适当稀释后，在600nm下检测吸光值(0D)；细胞干重(DCW)的计算 公式为:(DCff = 0. 153X0D+0. 014)。混合微生物静止细胞降解PVA:混合微生物在不同条件下进行培养，在发酵60h通过离心发酵液(10，000 Xg, lOmin)收集细胞，然后用磷酸缓冲液(0. lmol/L, pH 7.0)清洗3次细胞，将含有1. 0g/ L(DCff)细胞和1. 0g/L PVA的5mL反应液，在150rpm和30°C的条件下培养10h，检测培养前 后PVA含量。本发明采用的1，4- 丁二醇是PVA的结构类似物，它在细胞内的代谢途径和PVA类 似，因此它不会抑制PVA的降解。同时它作为一种小分子容易进入细胞并被代谢，能提高菌 体的生长和代谢活力。所以1，4_ 丁二醇能提高细胞对PVA的降解活力和细胞的生长活力，从而从整体上提高PVA的降解速度。本发明提高混合微生物对PVA的降解速度，平均PVA降解速度从0. 049g/L/h提高 到了 0.547g/L/h，这为消除PVA所导致的环境污染提供了一种方法。本发明还具有操作简 单、原料价格便宜、效果明显等优点。
图1PVA降解速度曲线(■ PVA(对比)/ PVA+1，4_ 丁二醇)和单位细胞PVA降 解速度曲线(□ PVA (对比)/〇PVA+PVA+1，4- 丁二醇)。图2细胞生长曲线(DCW - □-实施例3/-— □-—实施例2)和PVA降解曲线 (PVA -A-实施例3/-— A -—实施例2，单位细胞PVA降解速度■实施例3/ 实施例 2/ ▲对比)。
具体实施例方式对比例1.培养基组成基础培养基(g/L)酵母粉2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1， FeS04 7H200. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 灭菌 15min。微生物培养方法3L发酵罐装1. 5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接种150mL液体种子后，pH通过添加2. Omol/L HC1和2. Omol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min_3L/min) 控制在60%饱和度，温度控制在30°C。结果见表1，在不添加1，4- 丁二醇的情况下，混合体系发酵结束后，平均PVA降 解速度为0.049士0.0013g/L/h。在此发酵条件下，静止细胞对PVA的平均降解速度为 0.025士0. 0005g/L/h。表1不同发酵条件下1，4_ 丁二醇对混合微生物体系降解PVA的影响
实施例1 分批补料发酵法1培养基组成基础培养基(g/L) :PVA 1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )5.0，酵母 粉 2. 0，K2HP04 1.0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1，FeS04 7H20 0. 05，CaCl20. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 灭菌 15min。1，4-丁二醇补料培养基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0
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微生物培养方法3L发酵罐装1. 5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接种150mL液体种子后，pH通过添加2. Omol/L HC1和2. Omol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min_3L/min) 控制在60%饱和度，温度控制在30°C，在发酵36h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁结果见表1，在发酵36h向发酵液中一次性添加7. 65g/L 1，4_ 丁二醇的情况下，混 合体系发酵结束后，平均PVA降解速度为0. 073士0. 0015g/L/h，是对比的1.5倍。在此发酵 条件下，静止细胞对PVA的平均降解速度为0. 029士0. 0003g/L/h，和对比基本一致。实施例2 分批补料发酵法2培养基组成基础培养基(g/L) :PVA 1799 (平均分子量113kDa，醇解度99. 0% )5. 0，酵母粉 2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1，FeS04 7H20 0. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 灭菌 15min。1，4-丁二醇补料培养基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0微生物培养方法3L发酵罐装1. 5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接种150mL液体种子后，pH通过添加2. 0mol/L HC1和2. 0mol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min_3L/min) 控制在60%饱和度，温度控制在30°C，在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁结果见表1，在发酵21h向发酵液中一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇的情况下， 混合体系发酵结束后，平均PVA降解速度为0. 150士0. 0021g/L/h，是对比的3. 1倍，是实施 例1的2. 1倍。如图1所示，在此发酵条件下，细胞对PVA的总降解速度显著高于对比；但 单位细胞对PVA的降解速度和对比无显著差异。实施例3 连续补料发酵法培养基组成基础培养基(g/L) :PVA 1799 (平均分子量113kDa，醇解度99. 0% )5. 0，酵母粉 2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1，FeS04 7H20 0. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 灭菌 15min。1，4-丁二醇补料培养基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0。1，4-丁二醇流加培养基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0。微生物培养方法3L发酵罐装1. 5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接种150mL液体种子后，pH通过添加2. 0mol/L HC1和2. 0mol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min_3L/min) 控制在60%饱和度，温度控制在30°C，在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁 二醇，然后在发酵30h向发酵液中连续流加1，4_ 丁二醇，流加速度为0. 3g/L/h。如图2所示，在连续补料发酵法的情况下，在Oh到48h实施例3和实施例2在PVA降解速度上无明显差距。但在48h到60h，实施例3单位细胞PVA降解速度得到了显著提 高，这说明实施例3显著提高了细胞对PVA的降解活力，同时实施例3也显著提高了总的细 胞量，所以混合微生物对PVA的总降解速度得到了显著的提高。结果见表1，实施例3的平 均PVA降解速度为0. 547士0. 0027g/L/h，是对比的11. 2倍。
权利要求
一种提高PVA降解速度的发酵方法，其特征在于，在混合微生物降解PVA的过程中添加1，4-丁二醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4_丁二醇的方法为在混合 微生物发酵36h向发酵液中一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4_丁二醇的方法为在混合 微生物发酵21h向发酵液中一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4_丁二醇的方法为在混合 微生物发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁二醇，然后在发酵30h向发酵液中 连续流加1，4_ 丁二醇，流加速度为0. 3g/L/h。
全文摘要
本发明公开了一种提高PVA降解速度的发酵方法。通过在发酵过程中添加1，4-丁二醇，提高了PVA降解速度。通过分批补料发酵方法和连续补料发酵方法，平均PVA降解速度分别达到了0.073g/L/h、0.150g/L/h和0.547g/L/h，与不添加1，4-丁二醇相比，平均降解速度分别提高了1.5倍、3.1倍和11.2倍，为消除PVA所导致的环境污染提供了一种可行的方法。本发明还具有操作简单、原料价格便宜等优点。
文档编号A62D101/28GK101850167SQ20101018131
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者唐波, 堵国成, 张东旭, 陈坚 申请人:江南大学