专利名称：一种用于溴苯腈降解的副球菌属mxx-04及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物技术领域，具体地，涉及一种溴苯腈降解副球菌属MXX-04及其应用。
背景技术：
除草剂的大量使用已经对环境造成了巨大的影响。首先化学除草剂的使用在有效防除杂草的同时，也在一定程度上降低土壤中微生物的数量及土壤中一些酶的活性，从而影响土壤质量及供肥能力，且施药量越大影响越大。其次，除草剂会对地下水造成污染，从而影响人类的健康。溴苯腈以它的辛酸酯、钠盐，钾盐的形式在国外被广泛用作选择性芽后茎叶处理触杀型除草剂。主要由叶片吸收，通过抑制光合作用的各个过程，迅速使组织坏死。本剂主要用于小麦、大麦、黑麦、玉米、高粱、亚麻等作物田间，防除蒺、苋、麦瓶草，龙葵、苍耳、猪毛菜、麦家公、田旋花、荞麦蔓等阔叶杂草。小麦用量为每亩22.5 35g (有效成份);高粱、玉米为每亩18.7 30g ;亚麻每亩不超过18.7g。溴苯腈贮存稳定，和其他除草剂一般不发生反应，除单用外，还可以和多种除草剂混配，扩大除草谱。生物降解是自然界中溴苯腈去除的主要途径，目前国内尚没有溴苯腈高效降解菌的研究报道，因此，从溴苯腈污染的环境中分离出高效降解溴苯腈的微生物菌株，利用微生物的作用修复环境中的溴苯腈污染具有重大的理论意义和潜在的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的溴苯腈降解菌剂，使用 本菌剂可以降解废水中的溴苯腈，使溴苯腈残留量大大降低，使废水达标排放，同时降低处理成本，适用于现代废水处理工艺。本发明提供的溴苯腈降解菌株MXX-04是一株革兰氏染色反应阴性菌，于2013年4月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Paracoccus 5/7.，保藏编号为CGMCC N0.7437,经鉴定为副球菌属CParacocciAs sp.)。主要生物学特性为G—，短杆状，无芽孢，无运动性，氧化酶和接触酶皆阳性。溴苯腈降解菌MXX-04在LB培养基中培养两天后的特征是:菌落为圆形，表面突起，光滑，边缘整齐，乳黄色。本发明提供了所述溴苯腈降解菌MXX-04生产的菌剂。所述溴苯腈降解菌MXX-04生产菌剂的方法，具体为:
O活化培养:将溴苯腈降解菌MXX-04的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数
期；
2)种子液制备:将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期；
3)菌剂制备:将种子液按10%的接种量接入生产罐培养发酵，发酵完成后培养液即为菌剂，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同。步骤I)所述的LB培养基的成分是:酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00 g/L，NaCl10.00 g/L, pH 7.0。步骤2)所述的种子罐所用的培养基配方为:葡萄糖0.8%，(NH4) 2S04 1%，K2HPO4
0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。所述步骤2)中种子罐和步骤3)中生产罐的培养过程中无菌空气的通气量均为1:
0.6-1.2，搅拌速度均为180-240转/分，培养温度均为30_35°C，整个工艺流程培养时间为48-60小时。本发明提供了上述方法所制备的菌剂在溴苯腈讲解中的应用。本发明提供了一种消除溴苯腈污染的降解菌，可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，且该菌能以溴苯腈为唯一氮源进行生长，实验室生物降解实验结果表明，对50mg/L溴苯腈的降解率达到95.3%。该发明生产的降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在含有溴苯腈的环境中推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，具有重要的意义。
图1为菌株MXX-04的菌落照片；
图2为显微镜下降解菌MX X-04菌体结晶紫染色照片；
图3为不加菌株MXX-04的溴苯腈空白溶液液相色谱 图4为菌株MXX-04对溴苯腈的降解效果 图5为MXX-04菌剂的田间实验结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1溴苯腈降解菌MXX-04的分离和鉴定
取溴苯腈富集菌液，进行梯度稀释。稀释液涂布于含50mg/L溴苯腈的无机盐固体培养基上，培养基配方为:每升含 1.5 g K2HP04、0.5 g ΚΗ2Ρ04、0.2 g MgSO4X 7H20、1.0 g NaCl、18g琼脂，pH =7.0，30°C培养数天。从中挑取单菌落，利用HPLC验证其降解效果，将降解效率较高的一株菌株用30%的甘油保存于-20°C冰箱中。其菌落图片见图1，鉴定为副球菌属(Paracoccus sp.);命名为:MXX_04。主要生物学特性为(Γ,短杆状,无芽孢,无运动性，氧化酶和接触酶皆阳性。其结晶紫染色照片如图2所示，能以溴苯腈为唯一氮源进行生长，并将其矿化。在实验室短期摇瓶实验中，30°C、160rpm转速的摇床中培养30h，通过液相测定，结果显示对50mg/L的溴苯腈的降解率达85%。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。实施例2溴苯腈降解菌MXX-04生产菌剂的方法
将本发明的溴苯腈降解菌MXX-04的原种在培养皿上与培养箱中活化，30°C 30h，并测定降解性能，带菌落成熟后接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的IOOOml摇瓶中，LB培养基配方(g/L):酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，pH 7.0，恒
温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为:葡萄糖 0.8%, (MM)2SO4 1%, K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏 0.02%,pH值7.2。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，将上述培养好的摇瓶菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8。将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。实施例3溴苯腈降解菌MXX-04生产菌剂的方法
将本发明的溴苯腈降解菌MXX-04的原种在培养皿上与培养箱中活化，30°C 30h，并测定降解性能，带菌落成熟后接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的IOOOml摇瓶中，LB培养基配方(g/L):酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S04 1%，K2HP04 0.2%, MgS04 0.05%, NaCl 0.01%, CaC03 0.3%，酵母膏
0.02%，pH值7.5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，将上述培养好的摇瓶菌种按10 %的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为180转/分，无菌空气通入量为1:0.6。将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌,灭菌后冷却至35°C以下,通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.1.2，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为48小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。实施例4 溴苯腈降解菌MXX-04的长期摇瓶实验
在加入葡萄糖的含100mg/L溴苯腈的无机盐培养基中，其配方为:每升含1.50 gΚ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4X 7H20、1.0Og NaClU.0Og (NH4)2SO4 以及 Ig 葡萄糖，pH
7.0，按5%的接种量接种MXX-04，于30°C振荡培养，5d后取样测定。5d后，所测结果如图3与图4所示，与空白相比，处理样品的吸收峰明显下降，溴苯腈降解率达到95.3%。实施例5 MXX-04菌剂的田间土壤实验
实验用大田为I块尺寸为IOmX IOm的耕作土壤,对耕作层土壤松土(松土深度大约20cm)、整平备用。对此耕作土壤施用溴苯腈原药,使溴苯腈初始浓度为50mg/kg,搅拌均勻，喷施含I g/L的葡萄糖水溶液使其含水量达到饱和含水量的60%。然后将1#田平均划分为6块，向其中3块分别加入实施例2所述方法所制备的菌剂60g ;另外3块分别加入同体积的灭菌处理(12rC，30min)的实施例2所述方法制备的菌剂。共两种处理，每个处理均是三个重复。分别于5d、10d、15d、20d、25d、30d后取样测定溴苯腈在土壤中的降解率。由图5可知，加入菌体后，加入未灭活的菌剂的土壤中溴苯腈降解明显，降解率高达97%，加入灭活后的菌剂的土壤中溴苯腈没有明显降解。实施例3所述方法制备的液体菌剂通过实施例5所述的田间土壤实验，结果显示:与实施例2所述方法制备的菌剂相比具有相似的效果，降解率为 99%ο
权利要求
1.一株溴苯腈降解副球菌iParacoccus 577.)菌株MXX-04，其保藏编号为CGMCCN0.7437。
2.一种含有权利要求1所述的溴苯腈降解菌MXX-04的菌剂。
3.权利要求2所述的含溴苯腈降解菌MXX-04的菌剂在溴苯腈降解中的应用。
4.一种权利要求2所述的含溴苯腈降解菌MXX-04的菌剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤: 活化培养:将溴苯腈降解菌MXX-04的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期； 种子液制备:将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期； 菌剂制备:将种子液按10%的接种量接入生产罐培养发酵，发酵完成后培养液即为菌齐U，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同。
5.根据权利要求4所述的含溴苯腈降解菌MXX-04的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤I)所述的LB培养基的成分是:酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00 g/L，NaCl 10.00 g/L，pH7.0。
6.根据权利要求4所述的含溴苯腈降解菌MXX-04的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的种子罐所用的培养基配方为:葡萄糖0.8%，(NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO40.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
7.根 据权利要求4所述的含溴苯腈降解菌MXX-04的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中种子罐和步骤3)中生产罐的培养过程中无菌空气的通气量均为1:0.6-1.2，搅拌速度均为180-240转/分，培养温度均为30-35°C，整个工艺流程培养时间为48-60小时。
全文摘要
本发明提供一种消除溴苯腈残留的降解菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌MXX-04，经鉴定为副球菌(Paracoccussp.)。主要生物学特性为G-，短杆状，无芽孢，无运动性，氧化酶和接触酶皆阳性。该菌能以溴苯腈为唯一氮源进行生长，并将其矿化。在实验室摇瓶条件下该菌株能在24小时之内将100mg/L溴苯腈降解95.3%，解决了环境中溴苯腈难生物降解的问题。
文档编号A62D3/02GK103243056SQ20131020073
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者张永乐, 蔡双梅, 邱沪生, 顾乔梅 申请人:江苏南资环保科技有限公司