本发明涉及农用化学品领域，更具体地，本发明涉及一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维、制剂、制备及其应用。
背景技术：
极细链格孢激活蛋白是从天然微生物经发酵提取的一种生物活性蛋白质，该蛋白质是由207个氨基酸组成，其理论分子量为mw为22590；等电点为4.43；易溶于水；耐高温，100℃沸水中煮30min仍然稳定，自然光照下2d对效果不产生影响，常温贮存2年稳定，当极细链格孢激活蛋白接触到植物器官表面后，可以与植物细胞膜上的受体蛋白结合，引起植物体内一系列相关酶活性增加和基因表达量的增强，激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长、提高叶绿素含量，提高作物产量，对多种植物病害有较高的防效。然而极细链格孢激活蛋白不能够稳定作用于植株，在遇到气流或暴雨，其易脱离植株，影响极细链格孢激活蛋白发挥作用，此外，在应用过程中需要反复而多次的施用来达到一定的抗病效果。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维，极细链格孢激活蛋白负载在纳米纤维上；所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的载药量为40～60wt％，包裹率为85～100wt％；
其中，载药量按照如下步骤分析得到：
将极细链格孢激活蛋白纳米纤维的质量记为m1，之后进行破碎，使用去离子水洗脱极细链格孢激活蛋白，记录洗脱的极细链格孢激活蛋白m2，载药量(％)＝(m2/m1)*100％；
其中，包裹率按照如下步骤分析得到：
使用去离子水对极细链格孢激活蛋白纳米纤维进行表面洗脱，得到洗脱的极细链格孢激活蛋白质量m3，之后进行破碎，再次使用去离子水进行洗脱，得到极细链格孢激活蛋白质量m4，包裹率(％)＝[m4/(m3+m4)]*100％。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的直径为10～100nm。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备原料包括极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦、1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦和1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液的重量比为(1～6)：(4～6)：1：(90～100)。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述聚合物选自壳聚糖、ε-聚己内酯、聚乙二醇、聚乙内酰胺、纤维素乙酸酯中一种或多种。
本发明第二个方面提供了一种所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入三苯基膦，混合后得到纺丝液；
(2)将纺丝液电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述步骤(2)中电纺的纺丝速率为0.01～0.1ml/min。
本发明第三个方面提供了一种含有所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制剂。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述制剂的剂型选自可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、微囊悬浮剂中任一种。
本发明第四个方面提供了一种所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维在防病、抗逆、促进植物生长发育、改善作物品种、提高作物产量的应用。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本发明提供的极细链格孢激活蛋白纳米纤维的载药量和包裹率很高，纤维直径较低，可以控制活性物质的释放速度，使其在某种体系内维持一定的有效浓度，在一定的时间内以一定的速度释放到环境中，实现缓释的效果，延长相同剂量药物的持效期，提高了利用率，减少用量和施用次数，最终降低成本；
(2)提供的制剂在防病、抗逆，促进植物生长发育，改善作物品质和提高作物产量等方面具有显著的效果，在环境中缓慢释放，减少污染；
(3)提供的极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂不易被外界环境以及微生物破坏而造成活性成分流失；
(4)本发明所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法简单，原料易得；
(5)使用的溶剂为水，污染小且降低成本；
(6)所使用的聚合物有良好的环境相容性，生物可降解，没有残留风险；
(7)提供的纳米纤维机械强度高、直径较小且较为均一，表面张力低，具有极好的渗透性、润湿性、流平性、流变性及分散性；
(8)提供的制剂可防止喷施时在田间被气流和暴雨冲刷，提高药物本身的稳定性，有利于生态环境。
具体实施方式
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
本发明第一个方面提供了一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维，极细链格孢激活蛋白负载在纳米纤维上；所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的载药量为40～60wt％，包裹率为85～100wt％；
其中，载药量按照如下步骤分析得到：
将极细链格孢激活蛋白纳米纤维的质量记为m1，之后进行破碎，使用去离子水洗脱极细链格孢激活蛋白，记录洗脱的极细链格孢激活蛋白m2，载药量(％)＝(m2/m1)*100％；
其中，包裹率按照如下步骤分析得到：
使用去离子水对极细链格孢激活蛋白纳米纤维进行表面洗脱，得到洗脱的极细链格孢激活蛋白质量m3，之后进行破碎，再次使用去离子水进行洗脱，得到极细链格孢激活蛋白质量m4，包裹率(％)＝[m4/(m3+m4)]*100％。
极细链格孢激活蛋白能够促进植物根系生长，提高对土壤肥料的利用率；改善果实发育、提高品质；促进花粉受精，提高座果率和结实率；提高叶绿素含量，增强光合作用；改善植物生理代谢作用；增强抗病防虫等抗逆性能。具体地，极细链格孢激活蛋白的功能有：(1)苗期促根：用于处理种子或喷洒苗床，对水稻、小麦、玉米、棉花、烟草、蔬菜、油菜等作物的幼苗根系有明显的促进生长作用，根系鲜重比对照增5％～11％、干重增8％～13％。(2)营养期促长：具有促进细胞分裂与伸长的双重作用，能提高叶片内叶绿素的含量，增强光合作用和增加产量。作物表现为叶色加深、叶面积增大、叶片肥厚、生长整齐。(3)生殖期促实：能提高花粉的发芽率和受精率，从而提高结实率和坐果率，尤其是对弱势部位的提高更为明显；作物成熟期表现为粒数和粒重增加，瓜果类表现为果实均匀，提高产品品质。(4)防病抗虫：能调节植物体内的新陈代谢，激活植物自身的防御系统，从而达到防病抗虫的目的。
在一种实施方式中，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的直径为10～100nm。
在一种实施方式中，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备原料包括极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦、1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液。
本申请人发现当有机羧酸水溶液中有机羧酸的浓度为1.5～10wt％时，电纺效果较好。
优选地，所述极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦和1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液的重量比为(1～6)：(4～6)：1：(90～100)；更优选地，所述极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦和1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液的重量比为3：5：1：95。
在一种实施方式中，所述聚合物选自壳聚糖、ε-聚己内酯、聚乙二醇、聚乙内酰胺、纤维素乙酸酯中一种或多种。
本发明所述聚合物不作特别限定，本领域技术人员根据本申请文件中的记载可作常规选择。
在一种方式中，所述有机羧酸为醋酸和/或甲酸。
优选地，所述有机羧酸为醋酸。
本发明第二个方面提供了一种所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入三苯基膦，混合后得到纺丝液；
(2)将纺丝液电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
在一种实施方式中，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和1.5～10wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入三苯基膦，混合后得到纺丝液；
(2)将纺丝液以0.01～0.10ml/min的速率电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
优选地，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和8wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入三苯基膦，以400～600r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液以0.05ml/min的速率电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
进一步优选地，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和8wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入三苯基膦，以500r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液以0.05ml/min的速率电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
更优选地，所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和8wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入1.2～5wt％三苯基膦的水溶液，以500r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液以0.05ml/min的速率电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
在一种实施方式中，所述电纺的静电压为19～22kv；优选地，所述电纺的静电压为20kv。
在一种实施方式中，所述电纺时喷丝口距接收器距离为18～22cm；优选地，所述电纺时喷丝口距接收器距离为20cm。
本发明所述电纺过程中接收器的种类不作特别限制，可以是平板接收器，也可以是辊筒等可旋转接收器。
在一种实施方式中，所述可旋转接收器转速为900～1100r/min；优选地，所述可旋转接收器转速为1000r/min。
本申请人意外地发现使用聚合物、三苯基膦和有机羧酸水溶液将极细链格孢激活蛋白负载在纳米纤维上，特别是在0.01～0.1ml/min的纺丝速率下纺成纤维，其缓释效果较好，减少了施药次数，本申请人认为可能的原因是在纺丝速率为0.01～0.10ml/min，且聚合物为壳聚糖、ε-聚己内酯、聚乙二醇、聚乙内酰胺、纤维素乙酸酯中任一种，同时在三苯基膦的条件下，得到的极细链格孢激活蛋白纳米纤维的直径较小，载药量较高，同时包裹率高，保证了足够的极细链格孢激活蛋白可以缓慢释放出来，从而提高持效期，可以大大减少农药的总用量，降低成本。
本发明第三个方面提供了一种含有所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制剂。
制剂：为适应治疗或预防的需要，按照一定的剂型要求所制成的，可以最终提供给用药对象使用的药品。如：头孢克肟的剂型有头孢克肟片、头孢克肟胶囊、头孢克肟颗粒。这三种剂型均为头孢克肟的制剂。
本发明所述制剂中极细链格孢激活蛋白纳米纤维的用量可在一定范围内变化，取决于使用的目的、被施用对象及其极细链格孢激活蛋白在纳米纤维中的含量。
本发明所述制剂在实际使用时用常规的方法施用，例如种子处理、喷雾、灌根、浸泡等。
在一种实施方式中，所述制剂的剂型选自可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、微囊悬浮剂中任一种。
本发明中，对于制剂中除极细链格孢激活蛋白纳米纤维外的其它成分无特殊要求，可以根据需要选配本领域常用的成分，例如，乳化剂、分散剂、润湿剂、防冻剂、稳定剂、防腐剂、增稠剂、成膜剂、粘结剂、着色剂和固体惰性载体等。因此，本发明的制剂还含有乳化剂、分散剂、润湿剂、防冻剂、稳定剂、防腐剂、增稠剂、成膜剂、粘结剂和固体惰性载体中的一种或多种。这些成分可以根据制剂的剂型选择常规的用量，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明中，对于上述成分均无特殊要求，可以采用本领域常用的物质重量，例如：
乳化剂可以列举的有脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、烷醇酰胺聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、脂肪胺聚氧乙烯醚、植物油聚氧乙烯醚、多芳基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物、烷基糖苷、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物、聚甘油脂肪酸酯、羟基硬脂酸聚乙二醇酯、烷基苯磺酸盐、聚氧乙烯醚硫酸酯盐、磷酸酯及其盐等。
分散剂和润湿剂可以列举的有聚乙烯吡咯烷酮、马来酸-丙烯酸共聚物钠盐、亚甲基双萘磺酸钠、木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、十二烷基苯磺酸钙、丁二酸酯磺酸钠、拉开粉、月桂醇硫酸钠、烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚等。
防冻剂可以列举的有乙二醇、1,2-丙二醇、丙三醇、异丙醇、二甘醇、氯化钙、氯化镁、乙酸钠、乙二醇丁醚、丙二醇丁醚、乙二醇丁醚乙酸酯、甲酰胺、尿素、硫脲等。
成膜剂可以列举的有阿拉伯胶、动物胶、甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸钠和均聚醋酸乙烯酯等，优选为聚乙烯醇和均聚醋酸乙烯酯两者的混合物。
粘结剂可以列举的有淀粉、预胶化淀粉、明胶、阿拉伯树胶、糊精、石膏、葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙二醇、纤维素衍生物等。
增稠剂可以列举的有天然白土、膨润土、凹凸棒土、海泡石、硅酸铝镁、黄原胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、海藻酸钠、甲壳素、羊毛脂、松香、羧甲基纤维素、酚醛树脂等。
固体惰性载体可以列举的有淀粉、粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、轻质碳酸钙等。
稳定剂可以列举的有环氧大豆油、环氧亚麻仁油、环氧妥尔油、环氧化甲基硬脂酸酯、二环氧基丁基硬脂酸酯、环氧化脂肪酸辛基酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、邻羟基二苯甲酮、水杨酸苯酯等。
防腐剂可以列举的有山梨酸及其盐、丙酸及其盐、去水乙酸及其盐、苯甲酸及其盐、对羟基苯甲酸及其盐、卡松、巯基苯并噻唑、苯并异噻唑啉酮等。
本发明所述含有所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制剂的制备方法本领域技术人员根据制剂的剂型进行常规选择。
本发明第四个方面提供了一种所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维在防病、抗逆、促进植物生长发育、改善作物品种、提高作物产量的应用。
抗逆是植物对抗不良的外部生物或非生物因素所具备的如抗旱、抗盐碱、抗涝、抗风、抗冻、抗病虫害等的能力。
实施例
在下文中，通过实施例对本发明进行更详细地描述，但应理解，这些实施例仅仅是示例的而非限制性的。如果没有其它说明，下面实施例所用原料都是市售的。
实施例1
本发明的实施例1提供了一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维，所述极细链格孢激活蛋白负载在纳米纤维上。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备原料包括极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦、1.5wt％浓度的有机羧酸水溶液，其重量比为2.5：5：1：98.5。
所述聚合物为纤维素乙酸酯；所述有机羧酸为醋酸。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和1.5wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入1.2wt％三苯基膦的水溶液，以500r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液在0.05ml/min的速率，20kv静电压，20cm接收距离，1000r/min的可旋转接收器转速的条件下，电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维应用在防病、抗逆、促进植物生长发育、改善作物品种、提高作物产量。
实施例2
本发明的实施例2提供了一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维，所述极细链格孢激活蛋白负载在纳米纤维上。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备原料包括极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦、10wt％浓度的有机羧酸水溶液，其重量比为1：5：1：90。
所述聚合物为纤维素乙酸酯；所述有机羧酸为醋酸。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和10wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入5wt％三苯基膦的水溶液，以500r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液在0.03ml/min的速率，20kv静电压，20cm接收距离，1000r/min的可旋转接收器转速的条件下，电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维应用在防病、抗逆、促进植物生长发育、改善作物品种、提高作物产量。
实施例3
本发明的实施例3提供了一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维，所述极细链格孢激活蛋白负载在纳米纤维上。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备原料包括极细链格孢激活蛋白、聚合物、三苯基膦、10wt％浓度的有机羧酸水溶液，其重量比为3：5：1：95。
所述聚合物为纤维素乙酸酯；所述有机羧酸为醋酸。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和8wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入5wt％三苯基膦的水溶液，以500r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液在0.05ml/min的速率，20kv静电压，20cm接收距离，1000r/min的可旋转接收器转速的条件下，电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维应用在防病、抗逆、促进植物生长发育、改善作物品种、提高作物产量。
实施例4
本发明的实施例4提供了一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维，所述极细链格孢激活蛋白负载在纳米纤维上。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备原料包括极细链格孢激活蛋白、聚合物、1.5wt％浓度的有机羧酸水溶液，其重量比为2.5：5：98.5。
所述聚合物为纤维素乙酸酯；所述有机羧酸为醋酸。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和1.5wt％浓度的有机羧酸水溶液中，以500r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液在0.05ml/min的速率，20kv静电压，20cm接收距离，1000r/min的可旋转接收器转速的条件下，电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
本实施4无法得到极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
实施例5
本实施例5提供了一种极细链格孢激活蛋白纳米纤维，其具体实施方式同实施例2。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制备方法，其包括下面步骤：
(1)将极细链格孢激活蛋白溶于聚合物和10wt％浓度的有机羧酸水溶液中，之后加入5wt％三苯基膦的水溶液，以500r/min的搅拌速率搅拌均匀后得到纺丝液；
(2)将纺丝液在0.15ml/min的速率，20kv静电压，20cm接收距离，1000r/min的可旋转接收器转速的条件下，电纺成极细链格孢激活蛋白纳米纤维。
所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维应用在防病、抗逆、促进植物生长发育、改善作物品种、提高作物产量。
实施例6
本发明的实施例6提供了一种含有所述极细链格孢激活蛋白纳米纤维的制剂，其剂型为可湿性粉剂，按总和100wt％计，制剂还包括10wt％亚甲基双萘磺酸钠、3wt％十二烷基硫酸钠、3wt％滑石粉、硅藻土补足余量。
所述制剂的制备方法包括下面步骤：按质量称取亚甲基双萘磺酸钠、十二烷基硫酸钙、滑石粉和硅藻土，将上述物料投入高速万能粉碎机进行混合和初步粉碎，然后使用气流粉碎机再次进行混合和粉碎，最后加入极细链格孢激活蛋白纳米纤维，搅拌混合均匀，即为极细链格孢激活蛋白纳米纤维可湿性粉剂。
实施例7
本发明的实施例7提供了一种含有极细链格孢激活蛋白的可湿性粉剂，按总和100wt％计，可湿性粉剂还包括8wt％木质素磺酸钠、4wt％拉开粉、5wt％膨润土、高岭土补足余量。
所述可湿性粉剂的制备方法包括下面步骤：按质量称取极细链格孢激活蛋白、木质素磺酸钠、拉开粉、膨润土和高岭土，将上述物料投入高速万能粉碎机进行混合和初步粉碎，然后使用气流粉碎机再次进行混合和粉碎，即为极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂。
性能评估
1.载药量：记录实施例1～3和5得到的极细链格孢激活蛋白纳米纤维的质量m1，之后分别进行破碎，用去离子水洗脱极细链格孢激活蛋白，分别得到极细链格孢激活蛋白的质量m2，载药量(％)＝(m2/m1)*100％。
2.包裹率：使用去离子水对实施例1～3和5得到的极细链格孢激活蛋白纳米纤维进行表面洗脱，得到洗脱的极细链格孢激活蛋白质量m3，之后进行破碎，再次使用去离子水进行洗脱，得到极细链格孢激活蛋白质量m4，包裹率(％)＝[m4/(m3+m4)]*100％。
3.纤维的直径：实施例1～3得到的极细链格孢激活蛋白纳米纤维的直径采用下面方法进行测试：利用s-3400n型扫描电子显微镜(sem)，观察制备的极细链格孢激活蛋白纳米纤维，并通过软件nanomeasurer对sem图像随机取点来测量纳米纤维的平均直径。
4.对灰葡萄孢真菌病的控制效果：采用盆栽接种试验。将5％实施例6中极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂和5％实施例7中极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂分别稀释500、1000倍后以喷雾法处理黄瓜幼苗，以叶片上附有细密水滴且不流淌为宜，用无菌水作对照。每个处理设置3个重复，每个重复10株黄瓜幼苗，3天后，在所有处理的黄瓜幼苗上接种带灰葡萄孢活孢子的菌片，接种后调查每片叶片的枯斑数，计算枯斑数抑制率，公式如下：
枯斑抑制率(％)＝(对照枯斑数/叶-使用极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂或极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂处理枯斑数/叶)/(对照枯斑数/叶)*100％，抑制率结果以平均值计。
5.田间药效试验：选择品种、长势和耕作方式一致的黄瓜种植区，于黄瓜结瓜期，病害发生初期开始第1次喷实施例6和实施例7得到的制剂。以后每隔7d喷1次，共喷3次，以叶面雾滴均匀为宜。处理制剂为3％实施例6中极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂稀释1000倍液、3％实施例7中极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂稀释1000倍液和清水。第1次施药前调查病情指数，并于第3次施药后7d调查病情指数，45天后调查防治效果。每小区对角线5点取样，每点选2株，共10株。调查全株叶片，根据病叶分级标准记录叶部发病情况。病叶分级标准：0级(无病斑)；1级(病斑面积占整个叶面积的5％以下)；3级(病斑面积占整个叶面积的6％～10％)；5级(病斑面积占整个叶面积的11％～25％)；7级(病斑面积占整个叶面积的26％～50％)；9级(病斑面积占整个叶面积的50％以上)。相关公式如下：
公式中ck0为空白对照区施药前病情指数；ck1为空白对照区施药后病情指数；pt0为实施例6或实施例7处理区施药前病情指数；pt1为实施例6或实施例7处理区施药后病情指数。
表1
表1为实施例1～3和实施例5得到的极细链格孢激活蛋白纳米纤维的测试结果，从表1的测试结果中可知本发明提供的极细链格孢激活蛋白纳米纤维的载药量和包裹率很高，纤维直径较低，可以实现缓释的效果，延长相同剂量药物的持效期，提高了利用率，减少用量，最终减低成本。
表2
表2为实施例6和实施例7得到的制剂对灰葡萄孢真菌病的控制测试结果，从表2的测试结果中可知极细链格孢激活蛋白对黄瓜具有保护作用，可以通过提前施用极细链格孢激活蛋白来提高黄瓜幼苗对灰霉病的控制效果，而且从表2中也可以得到极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂对黄瓜灰霉病具有较高的杀菌活性，纳米纤维制剂的两个稀释梯度的抑制率均分别高于可湿性粉剂，且随着供试制剂浓度的提高，抑制率随之增加。
表3
表3为实施例6和实施例7得到的制剂对黄瓜灰霉病的防治效果，从表3的测试结果中可知3％极细链格孢激活蛋白制剂稀释1000x倍液和3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂稀释1000x倍液都有较好的诱抗效果。第3次施药后7d调查，纳米纤维制剂和可湿性粉剂的防效分别为80.74％和61.04％；第3次施药后45d调查发现3％极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂的防效仍在80％以上，说明极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂有较长的持续诱抗作用。比较两种剂型的极细链格孢激活蛋白可以发现可湿性粉剂的防治效果和持续诱抗作用远没有纳米纤维制剂好，说明两者在相同剂量下使用，纳米纤维制剂更能提高药物利用率，同时也延长了药物的持效期，可以大大减少农药的总用量，降低成本。
本发明制备的极细链格孢激活蛋白纳米纤维制剂不仅可以在病害发生之前施用来起到保护作用，还可以在发现病害后对作物进行治疗作用，控制病害的发生从而提高作物本身的抗性，促进植物生长发育，改善作物品质和提高产量，同时延长了相同剂量药物的持效期，提高药物利用率，减少农药总用量，从而降低成本，为经济、安全、环境友好型极细链格孢激活蛋白推广应用提供新途径。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。