专利名称：具有波前传感器的扫描激光显微镜的制作方法
技术领域：
本发明涉及扫描激光显微镜。具体地，本发明涉及具备波前传感器的扫描激光显微镜，以从扫描的像素位置采集波前数据。从波前传感器采集的波前数据可用于产生增强分辨率的图像。
背景技术：
公知的扫描激光显微镜包括照明臂与检测臂。该照明臂产生聚焦的探测光束，其在样本或物体上扫描。在扫描的同时，采集并检测反射的、散射的或发射的光线，以在像素的基础上成像。该显微镜的检测臂可包括光谱滤光镜(用于荧光或光致发光成像)，空间滤光镜(用于共焦成像)和/或偏振分析仪(用于偏振成像)。
扫描激光显微镜的检测臂包括物镜，其采集从照亮点衍射的光线。该物镜采集从低空间频率特征衍射的光线，换言之，来自入射聚焦点区域内物体的较大与较慢的变化特征。光线还从高空间频率特征衍射，其定义为入射聚焦点区域内物体的快速变化特征。来自高空间频率特征的光线以大角度散射，其超过了物镜的直径，并因此采集不到。
在常规的扫描激光显微镜中，为每个像素检测入射到检测器上全部光束。这实际上是检测的光束的空间积分。检测光束的内容受到物镜能力的限制，以采集从物体衍射的光线。该典型的衍射限制，其确定显微镜的分辨率，基于采集到的光线的积分。
在一些公知的扫描激光显微镜中，增加了一种hartmann-shack波前传感器(HSW)测量光束的波前形状，以校正光线误差。hartmann-shack波前传感器包括微透镜阵列与传感器阵列，例如CCD摄像头。微透镜阵列的每个透镜采样入射场并聚焦在传感器阵列的一个点上。传感器阵列检测到的每个点的强度表示采样场的强度，并且每个点的位移表示该子区域(即局部波前斜面)中场相位的梯度。来自hartmann-shack波前传感器的波前形状信息用于驱动显微镜照明臂中的变形反射镜，以降低存在的任何成像失真。在通过失真介质成像样本的情况下，使用波前传感器与变形反射镜是有益的。一个示例是当要成像的物体位于引入球面像差的厚玻璃片之下时。其它应用已经包括了天文学与眼科学。
发明内容
简言之，本发明提供一种扫描激光显微镜，其包括1)用于通过聚焦的探测光束扫描物体的照明臂；2)用于从物体接收光线的检测臂，该检测臂包括a)用于采集并检测来自物体的光线的检测器，以便为多个像素的每一个产生像素数据b)用于检测来自物体的光线相位变化的波前传感器，以为所述多个像素的每一个产生波前数据3)数据处理器，用于基于每个像素的像素数据和波前数据为所述多个像素产生图像数据。
在另一方面，本发明提供一种扫描显微镜，包括1)用于在物体的像素位置上扫描聚焦光点的照明臂；2)用于从照亮的像素位置采集光线的物镜；3)用于在每个像素位置检测采集的光线的波前形状的波前传感器；4)用于通过在每个像素位置检测的波前形状导出该像素位置的图像信息的数据处理器；以及5)用于根据为这些像素位置导出的图像信息，显示该物体图像的显示器。
在另一方面，本发明提供一种物体高分辨率图像的方法，该方法包括1)扫描图像以在多个像素位置产生表示光线强度的像素数据；2)基于该像素数据显示物体图像；3)选择图像的目标区域；4)扫描该图像的目标区域；5)对于该目标区域的每个像素位置，产生该像素位置的波前形状数据；6)基于该目标区域每个像素位置的波前形状数据，为该目标区域的每个像素位置产生图像数据，以及7)基于该图像数据，显示该目标区域的图像。
在另一方面，本发明提供物体的增强分辨率扫描图像的方法，该方法包括1)标识物体的目标区域，其具有小尺度特征；2)通过聚焦光束扫描该目标区域的各个像素位置；3)从这些扫描的像素位置采集光线；4)检测来自这些扫描的像素位置的光线的波前形状；5)通过来自每一像素位置的采集的光线的波前形状确定高频光谱，该光谱对应于从该扫描的像素位置的小尺度特征散射的未采集光线；以及6)基于这些扫描的像素位置的高频光谱，提供目标区域的增强分辨率图像。
在另一方面，本发明提供产生物体图像的方法，该方法包括1)通过入射聚焦点照亮物体；2)采集从该物体低空间频率特征衍射的光线；3)测量所采集的光线强度；4)基于采集的光线的波前信息导出物体的高空间频率特征；以及5)基于导出的高空间频率特征，显示物体的增强分辨率图像。
图1为本发明的扫描激光显微镜的方框图。
图2为详细表示扫描激光显微镜检测臂的示意图。
图3A表示利用常规检测方法扫描的物体的共焦图像，具有标识的目标区域。
图3B为目标区域的放大图像，显示了该区域中的像素位置。
图3C为来自图3B像素区域的HSWS图像。
图3D为图3C HSWS图像的局部放大图像。
图3E为根据图3C示出的HSWS波前数据计算的光瞳上的相位图。
图4为表示在扫描激光显微镜中物体上入射聚焦点产生的光线衍射的示意图。
图5为空间频谱图，其表示利用解析延拓法确定与测量的低频谱关联的唯一高频谱。
图6A表示截短的二维高斯强度分布。
图6B表示使用二维解析延拓法确定的高斯延拓曲线。
图6C表示图6A与图6B二维频谱的剖面，说明截短的与延拓的谱。
具体实施例方式
本发明为改进的扫描激光显微镜，其包括用于检测来自物体中目标位置光线相位变化的波前传感器。该相位变化表示在目标区域中每一扫描像素位置处采集的光线的波前形状。通过该波前形状，可导出对应于未采集的散射光线的高频光谱。该散射光线由扫描像素位置的小尺度特征产生。然后基于这些扫描的像素位置的高频光谱，可产生目标区域的增强分辨率图像。
本发明基于这样的承认，即在扫描激光显微镜的检测臂中的采集光线中比在通常使用的显微镜中存在更多的信息。通过与常规检测方法共同使用波前传感器，空间频率超过系统截止点之上的部分可通过可测量的频谱确定，该频谱由通过波前传感器采集的光线表示。通过该导出的较高空间频率信息，可生成目标区域的增强图像。
图1为扫描激光显微镜10的方框图，其提供扫描物体12(或样本)的所选区域的增强分辨率图像。扫描激光显微镜10包括照明臂14，检测臂16，计算机18，以及图像显示器20。
照明臂14提供在物体12上扫描的聚焦探测光束22。照明臂14包括激光器24，在两个方向上扫描光束22的光束扫描仪26，以及用于在物体12上聚焦点S处聚焦光束22的聚焦透镜28。
检测臂16包括物镜30，光束反扫描仪31，分光镜32，检测器34，以及波前传感器36。物镜30采集从物体12反射的，散射的和发射的光线作为光束38。光束反扫描仪31将该光束带回光轴。分光镜32将采集的光束38分离为第一光束38A与第二光束38B。检测器34接收第一光束38A，而波前传感器38接收第二光束38B。
在操作中，聚焦的光束22在物体12上扫描，采集光线38，并且由检测器34同时检测第一光束38A的强度。结果，从检测器34向计算机18提供像素数据，该数据表示从由光束22扫描的每一像素位置接收的第一光束38A的综合强度。计算机18处理该像素数据，以产生在显示器20上显示的图像数据。
然后用户选择图像中的目标区域，以供更高分辨率视图。例如可通过在显示器上目标区域附近绘制方框进行这样的选择。
计算机18然后使照明臂14在目标区域中扫描光束22。在目标区域中的每一个扫描的像素位置，用波前传感器36进行第二光束38B的波前测量，并将其提供至计算机18。波前传感器36优选的为hartmann-shack波前传感器(HSWS)。该波前传感器包括微透镜(或小透镜)阵列，其采样第二光束38B并将每一子区域聚焦至一个点。这产生由CCD摄像头或检测器阵列检测的点阵列。然后基于来自检测器阵列的检测器信号，测量这些点的强度与局部偏移。每个点的强度可用于计算该入射场的模值，而这些点的偏移是波前传感器36处波前梯度的量度。利用计算机18，可采用多种方法测量这些点的强度与局部偏移，包括在美国专利No.6,477,273中说明的质心积分技术，在已公布的美国专利申请2003/0025942 A1中说明的自动门限技术，和在2001年4月26日公布的美国待审批申请No.WO2001 29756，以及在2000年3月31日提交的美国待审批申请No.09/540,472中说明的自动网格技术，所有这些都属于3M innovative Properties Company。
可利用任何适当的方法通过这些局部偏移计算光束38B的实际波前，这样的方法有很多。示例见W.H.Southwell撰写的Wave-frontestimation from wave-front slope measurements，JOSA Vol.70，No.8P.998(1980)。然后通过应用已知的衍射方程，可将波前传感器36处的波前与物镜30处的波前关联起来。这些计算由计算机18执行。处理过程中的下一步包括将物镜30处的波前与物体12处的场关联。一旦对于目标区域中每一像素位置，获得了关于物体12处场的图像信息，计算机18基于从目标区域中像素位置获得的波前形状数据，组合图像数据并使显示器20产生目标区域的增强的或更高分辨率的图像。
图2更详细地表示检测臂16。具体地，照明臂14中光束22示为通过聚焦透镜28聚焦至物体12处像素位置上的点S。来自物体12的衍射光线由检测臂16的物镜30采集，以产生光束38。分光镜38将光束分离为第一光束38A与第二光束38B。检测器34为由透镜40，空间滤光镜42，透镜44以及光电检测器46形成的集成共焦检测器。在图2中，光电检测器46作为分离的检测器示出，以允许差分相位比较成像(DPC)，但也可使用单个统一的光电检测器。检测器34也可为其它形式，例如非共焦检测器。波前传感器36为由小透镜阵列48和CCD检测器阵列50形成的hartmann-shack波前传感器。
如图2中所示，入射到物体12处像素位置上的光束22在数学上可描述为复数场|U1|ejφ1，其中|U1|该场的模值，φ1为该场的相位。像素位置处物体12的空间信息可由复变量t表示。结果，作为入射光束28的结果从物体12衍射的光线为t|U1|ejφ1，其为空间信息t与入射光束|U1|ejφ1的积。
物镜30采集并校准从物体12衍射的光线以产生光束38。光束38的内容可描述为|U2|ejφ2。
在物体12的初始扫描期间，入射光线22在物体12的每个像素位置上扫描。来自物体12的衍射光线由物镜30采集，且光束38被引导至分光镜32。光束38被分离为光束38A与38B。在该第一次扫描期间，光束38A的综合强度由检测器34检测，以在每个像素位置产生像素强度。
图3A表示作为物体12而使用的测试样本的图像。该测试样本在玻璃衬底上包含铬合金特征。在图3A中，在目标区域R周围绘制有矩形框60，选择该区域用于进一步的分析。可通过用户浏览显示器20上的图像并在目标区域附近绘制框60进行手工选择。或者，可通过计算机18基于图像中局部变化的计算机分析，自动选择用于进一步分析的区域。利用计算机18进行自动选择的一种技术是应用Sobel图像分析滤波器，并利用该滤波器选择那些具有高分值的区域。在任一情况中，仅当需要具有小尺度特征的区域和处于特征边缘的区域时，可执行额外的分析。大的均匀区域，例如图3A中央的基本平坦的区域，可能不需要进一步分析。
图3B为图3A的框60中的目标区域R的放大视图。一旦标识目标区域，那么光束22再次在物体12上扫描，但这次仅扫描目标区域。在每个像素位置，使用波前传感器36采集波前数据。图3B中，在矩形框62中示出一个示例像素位置P。
波前传感器36以点阵列的形式为目标区域中扫描的每个象素位置产生图像。图3C表示从图3B的像素位置P产生HSWS图像64的示例。
图3D表示图3C的HSWS图像64的子区域66。在图3D中可以看出，每个点的强度不同，并且这些点的位置偏移是可检测的。在每一像素位置，产生HSWS图像，通过其可测量并存储点强度和点位置偏移。
通过点偏移(相位梯度)与强度信息，可确定波前强度与波前形状。图3E表示特定像素位置的光瞳上的相位图68。本发明利用此相位信息提供额外的信息，该额外的信息将提高显微镜10的分辨率超过常规的衍射限制。
图4表示当物体12在聚焦点S由聚焦光束22照亮时，一些光线如何被采集，而另一些光线如何未被采集。检测器34与波前传感器36仅能够直接分析由物镜30采集的光线。来自物体12的散射光线70未被采集。高空间频率特征(换言之，在物体12上照亮的像素位置中小的与快速变化的特征)将以大的角度衍射或散射。散射至这些较高角度的光线70包含关于物体12的高空间频率分量的信息，但由于其未被物镜30采集，因此散射的光线70丢失。
如果能够确定这些高空间频率分量，那么可实现显微镜10分辨率的增加，超过常规衍射限制。本发明基于这样的承认，即通过利用来自波前传感器36的数据分析波前形状，可导出关于高空间频率分量的信息，并可将其于提供较高分辨率的图像。
在本发明的优选实施例中，基于来自目标区域中像素位置的波前传感器数据，使用解析延拓法确定高空间频率分量。解析延拓法包括利用频谱的低频部分中的信息，确定超出系统截止点的频谱部分。图5通过频谱模值作为空间频率的函数图，表示解析延拓法的概念。图5显示延伸至系统截止点82的低频率谱80。在超出系统截止点82的更高频率，表示了三个可能的频谱84，86以及88。
在这里考虑的情况中，系统截止点由物镜30的最大采集角度确定，其与透镜30的数值孔径NA相关。如图5所示，可能存在多个高频频谱84，86，以及88与低频频谱80(其由波前传感器30测量)匹配。然而，如J.L.Harris撰写的Diffraction and Resolving Power，JOSA Vol.54，No.7，pp.931-936(1964)中首次示出，如果空间频率(或角度)谱是解析的(对于电磁场是如此)，并且在空间上有界的(通过聚焦点S的有限尺寸是如此)，则存在唯一的高频频谱(例如频谱86)与测量的低频频谱80相匹配。另外，该频谱的高频部分可通过已经测量的低频频谱计算得到。
物镜30用作光学信息的低通滤光镜。它截短了衍射光线的角度谱。然而，由于可测量的频谱是解析的，且物体在空间上有界，因此可计算得出唯一的频谱延拓。这意味着可导出较高的空间频率，以产生更好分辨率的图像。
图6A-6C显示的图像表示二维解析延拓。图6A表示截短的二维高斯频谱强度分布，而图6B表示利用二维解析延拓法延拓的同一强度分布。
图6C表示通过二维频谱的一维剖面。原始的“真实”频谱为二维高斯的。曲线90通过连接原始频谱的离散采样点(由圆圈表示)形成，其非常像由波前传感器36测量的频谱。如图6C中所示，这些采样点受限于低空间频率带宽中。然后将这些点用作解析延拓例程的输入，以产生延拓的频谱92。该延拓的频谱与原始的或“真实的”频谱在由曲线90表示的带宽受限的测量之外匹配。这表明解析延拓法可用于生成超出系统带宽限制之外的信息。在本发明中，来自波前传感器36的信息是描述散射光线的平面波的角度频谱的低频部分，并且在图4中示出的大角度光线70是计算机10利用解析延拓法解出的光线。
延拓频谱所在的空间频率根据显微镜10的具体设计计算得出。首先，延拓频谱中空间频率的数量与原始频谱中空间频率的数量(其对应于通过波前传感器36测量的点的数量)相等。其次，延拓频谱所在的最大空间频率根据原始频谱中空间频率测量的数量，和“边界区域”的延拓计算得出，其中，在“边界区域”之外，测量的信号可设置为0。具体地，如果在x方向存在m个空间频率测量(从-m/2延拓至+m/2)，且在距聚焦点中心M之外没有信号，则可解出最大空间频率为fmax＝(m/2)/M。
在校准目标上各个点产生一系列HSWS图像。图7A与7B表示通过来自校准目标的数据重建的点。图7A表示通过HSWS数据重建的聚焦点，而图7B表示利用解析延拓法通过延拓的HSWS数据重建的同一点。很明显，通过解析延拓数据(图7B)重建的聚焦点比通过采集的HSWS数据(图7A)重建的聚焦点窄得多，这正是所期望的。然而，即使是采集的HSWS数据也比常规扫描显微镜具有更多信息的潜力。换言之，即使利用采集数据，在目标区域中，以像素为基础，通过来自波前传感器36的数据，也可获得更大的分辨率。解析延拓法还提供更好的图像增强。
本发明的显微镜提供包含高空间频率特征的区域的增强分辨率图像。标识目标区域之后，在该目标区域中扫描物体。在扫描的目标区域中的每一像素位置采集的波前数据用于生成并增强显示的图像。
在替换实施例中，扫描激光显微镜10表示为具有展开的结构，其中照明臂14与检测臂16是分离的。本发明同样适用于折叠结构，其中，光线从该物体反射，且照明臂与检测臂共享各个部件。
对于本领域的技术人员，本发明的各种修改与替代是显而易见的，而不脱离本发明的范围与原理，并且应当理解，本发明并不过多地限制于上述解释性的实施例。
权利要求
1.一种扫描激光显微镜，包括用于通过聚焦探测光束扫描物体的照明臂；用于从该物体接收光线的检测臂，该检测臂包括用于采集并检测来自该物体的光线的检测器，以便为多个像素的每一个产生像素数据，以及用于检测来自该物体的光线相位变化的波前传感器，以便为多个像素的每一个产生波前数据；以及数据处理器，用于基于每个像素的像素数据和每个像素的波前数据，为该多个像素产生图像数据。
2.如权利要求1所述的扫描激光显微镜，其中，该检测臂包括物镜，用于采集来自该物体的光线；以及分光镜，用于将来自该物镜的光线分离为引导至该检测器的第一光束与引导至该波前传感器的第二光束。
3.如权利要求2所述的扫描激光显微镜，其中，该波前传感器包括微透镜阵列，用于将第二光束聚焦为点阵列；以及检测器阵列，用于检测这些点。
4.如权利要求3所述的扫描激光显微镜，其中，该数据处理器根据从检测器阵列接收的传感器信号产生该波前数据。
5.如权利要求4所述的扫描激光显微镜，其中，该数据处理器导出波前数据信息，该信息涉及从与波前数据关联的像素位置的小尺度特征散射的未采集的光线，并基于该信息，产生用于增强分辨率图像的图像数据。
6.如权利要求5所述的扫描激光显微镜，其中，该数据处理器利用解析延拓法导出该信息。
7.如权利要求1所述的扫描激光显微镜还包括显示器，用于基于来自数据处理器的图像数据显示该物体的图像。
8.如权利要求7所述的扫描激光显微镜，其中，该数据处理器基于像素数据产生第一图像数据，并基于波前数据产生第二图像数据。
9.如权利要求8所述的扫描激光显微镜，其中，显示器基于第一图像数据显示该物体的第一分辨率图像，并且基于第二图像数据显示该物体目标区域的第二较高分辨率图像。
10.如权利要求9所述的扫描激光显微镜，其中，该数据处理器控制照明臂扫描目标区域，以产生该第二图像数据。
11.如权利要求10所述的扫描激光显微镜，其中，该数据处理器基于该第一图像数据选择该目标区域。
12.如权利要求10所述的扫描激光显微镜，其中，该数据处理器基于用户输入选择目标区域。
13.如权利要求1所述的扫描激光显微镜，其中，该照明臂包括激光器，用于产生光束；透镜，用于将该光束聚焦至物体处的入射聚焦点；以及扫描仪，用于扫描穿过该物体的入射聚焦点。
14.一种扫描显微镜，包括照明臂，用于在物体的各个像素位置上扫描聚焦光点；物镜，用于采集来自照亮的像素位置的光线；波前传感器，用于检测在每个像素位置采集的光线的波形；数据处理器，用于根据在每个像素位置检测的波形，导出该像素位置的图像信息；以及显示器，用于基于为各个像素位置导出的图像信息，显示该物体的图像。
15.如权利要求14所述的扫描激光显微镜，其中，该波前传感器包括微透镜阵列，用于将第二光束聚焦为点阵列；以及检测器阵列，用于检测这些点。
16.如权利要求14所述的扫描显微镜，该数据处理器根据波前形状导出空间频率信息，该信息涉及从与波前形状关联的像素位置的小尺度特征散射的未采集的光线，并基于该空间频率信息，产生用于增强分辨率图像的图像信息。
17.如权利要求16所述的扫描显微镜，其中，该数据处理器利用解析延拓法导出该空间频率信息。
18.如权利要求14所述的扫描显微镜，其中，该数据处理器控制照明臂，以扫描该目标区域。
19.如权利要求18所述的扫描显微镜，其中，该数据处理器自动选择目标区域。
20.如权利要求18所述的扫描显微镜，其中，该数据处理器基于用户输入选择目标区域。
21.如权利要求14所述的扫描显微镜，其中，照明臂包括激光器，用于产生光束；透镜，用于将该光束聚焦至物体处的聚焦光点；以及扫描仪，用于扫描穿过该物体的聚焦光点。
22.一种物体高分辨率成像方法，该方法包括扫描该物体，以产生表示多个像素位置处的光线强度的像素数据；基于该像素数据，显示该物体的图像；选择该图像的目标区域；扫描该目标区域；为该目标区域的每个像素位置产生该像素位置的波前形状数据；基于来自该目标区域的各个像素位置的波前形状数据，为该目标区域的每个像素位置生成图像数据；以及基于该图像数据显示该目标区域的图像。
23.如权利要求22所述的方法，其中，选择目标区域是基于用户输入。
24.如权利要求22所述的方法，其中，选择目标区域是基于像素数据的分析。
25.如权利要求22所述的方法，其中，为该目标区域的每一像素位置生成图像数据包括导出高频频谱，并基于该高频频谱生成图像数据，其中，该高频频谱对应于从每个像素位置的小尺度特征散射的未采集的光线。
26.一种产生物体增强分辨率扫描图像的方法，该方法包括识别具有小尺度特征的物体的目标区域；利用聚焦光束扫描目标区域中的像素位置；采集来自扫描的像素位置的光线；检测来自扫描的像素位置的采集的光线的波前形状；根据来自每个像素位置的采集的光线的波前形状确定高频频谱，该高频频谱对应于从扫描的像素位置的小尺度特征散射的未采集的光线；以及基于扫描的像素位置的高频频谱，提供目标区域的增强分辨率图像。
27.一种产生物体图像的方法，该方法包括用入射聚焦点照亮物体；采集从该物体低空间频率特征衍射的光线；测量采集的光线的强度；基于采集的光线的波前信息，导出该物体的高空间频率特征；以及基于该导出的高空间频率特征，显示该物体的增强分辨率图像。
全文摘要
物体的增强分辨率图像由扫描激光显微镜(10)产生，该显微镜包括用于通过聚焦探测光束(22)扫描物体(12)的照明臂(14)以及用于接收来自该物体的光线的检测臂(16)。该检测臂包括采集并检测来自该物体(12)的光线的检测器(34)，以为多个像素产生像素数据。此外，该检测臂包括用于检测来自该物体的光线相位变化的波前传感器(36)，以为扫描的像素位置产生波前数据。通过在每一像素位置采集的光线的波前形状，可确定高频频谱，其对应于从该像素位置的小尺度特征衍射的未采集的光线。基于这些扫描的像素位置的高频频谱，产生目标区域的增强分辨率图像。
文档编号G02B21/00GK1784624SQ200480012465
公开日2006年6月7日 申请日期2004年4月2日 优先权日2003年5月9日
发明者马修·R·C·阿特金森 申请人:3M创新有限公司