用于分析井板、凝胶和斑点的数字成像系统的制作方法

专利名称：用于分析井板、凝胶和斑点的数字成像系统的制作方法
技术领域：
本发明 一般涉及化验分析系统，尤其涉及一种用^产生随机排列 得到样品(例如凝胶内的珠(bead),培养亚内的菌落)或排列成规 则阵列的(例如塑料板中的井，被设置在膜上的斑点)样品的数字图 像的系统和方法。本发明能够产生数字图像并能够进行发出非常低的 荧光、化学光或生物光的样品的自动分析。特別是，本发明被设计用 于分析在井板内和凝胶介质内以及膜上，玻璃上，微型器件或其它栽 体上的样品产生的亮度。
背景技术：
许多化学和分子生物学分析被这样设计，使得在样品内的光反射 作用的吸收、透射或发射发生变化。因此，用于对这些进行定量分析 的仪器必须检测亮度的改变。
一些样品被设置在分立的长颈瓶或小瓶内，而有些样品被设置在 塑料板内，在塑料板上含有许多按一定间隔设置的井。"井板"样品 和在分立容器中的类似的样品相比，生产率高而成本低。标准的井板 在8 x 12ctn的面积内含有96个井。发展趋势是在相同大小的板内含 有较多的井。现在最高的工业密度是384个井。由小的井(微井，例 如每板数千个，其全体积小于每个井1 ul )排列而成的极高密度的 阵列正在研究中，并将作为成熟的微井填充和检测技术在工业上利用。
在扁的载体膜上或在处理过的玻璃条上设置小点(反应处)的网 格。高密度网格可以含有数千个分立的点。网格样品通常涉及和低核 苷酸杂交，以便寻找含有特定序列的基因，或者确定特定基因起作用 的程度。其应用包括库筛选(library screening)，利用杂交排序，
利用杂交诊断以及基因表达的研究。如果能够简单而可靠地对网格进 行分析，高密度网格可以以低的成本提供极高的生产率.因此，在研 究用、于产生、检测和分析基因组序列的高密度阵列的技术的公司引起了相当的重视。
有些样品涉及小的颗粒(一般是由化合物涂敷的珠)，其作为反 应点。可以有数千个珠，每个珠用组合库中的不同的化合物(例如酶 的分子变种)涂敷。这些珠被暴露于井中或凝胶基体中感兴趣的物质 (例如克隆受体)。和靶物质相互作用的珠借助于在每个珠周围的区 域内的荧光发射或吸收进行识别。相互作用的珠被暗的不同亮度的区 域包围着.需要非常灵敏的检测器来识别在和靶相互作用的珠周围的 亮度的微小变化。
把制成溶液的样品涂在基体上，在基体上施加电压。因为蛋白质 和具有不同氨基酸或核苷酸的核酸都具有特征静电荷和分子尺寸，所 以在试样内的元素可以提供其响应所加电压而产生的不同的运动速
度来进行分离。被分离开的元素通过使用同位素标记、焚光标记或亮 度标记被可视化。在许多情况下(例如化学光)，由样品产生的亮度 是很小的。
位于排列成规则阵列的反应点(井，网格内的斑点)的样品可被 称为固定格式的样品。而不规则地分布在凝胶或斑点基体内的样品可 净皮称为自由格式样 品。
固定格式样品通常不利用成^f象来进行化验。相反，自由格式样品 需要使用图像分析系统，其可以对图像内的任何位置的反映进行检测 和定量分析。
被设计用于固定格式样品的仪器一般没有成像功能，因而尚不能 用于自由格式样品。同样，被设计用于自由格式样品的很少的几种成 像仪器尚不能用于井和其它的固定格式的靶。
非成像计数系统(液体闪烁计数器，光度计，荧光偏振仪等)基
本上是光学仪器。它们使用光电倍增管(PMT)检测井内的光透射与 光发射的变化。类似于光度计，这些系统把每个井发出的光集中成一 个数据点。它们不提供关于井内空间变化的信息，也不允许作用点的 充填密度或位置改变。
每个PMT—^^读出一个井，并且在计数系统中，只允许设置数量有限的PMT (在现有的系统中最大为12个)。虽然数量有限的PMT 意味着一次只能读出少数的井，但通过多次移动PMT检测器可以分析 井的阵列。
非成像计数系统的主要优点是它们是一种(按钮)技术(容易使 用)，并且是成熟的。因此，许多这种仪器在工业上是可以利用的， 并且其性能是好的。
计数系统的主要缺点是
a有限的灵活性--只有少数的仪器可以处理384个井，并且绝 对处理不了较高密度的荧光或发光的样品阵列。
b只设计有固定格式用作井或小瓶读取器，并且不能以自由格式 读取样品。
c对于暗的样品，其处理速度慢--虽然在强光下一次扫描几个 井可以^f艮快，但暗的样品要求在扫描内的每个位置花费较长的计数时 间。因为有许多位置要被扫描，因而使生产率降低。
总之，非成像计数系统是不灵活的，并对于有些样品提供有限的 输出。
用于扁的样品的不同于非成像计数器的一种装置是扫描成像 器。扫描成像器，例如分子动态学(MD)风暴，MD荧光成像器，或 Hitachi FMBIO在样品上通过激光束或其它的光束，以逐点的或逐线 的方式激励荧光或反射光。可以使用共焦点的光学系统，通过牺牲速 度和灵敏度来减少焦点之外的荧光(例如Biomedical Photometries MACR0scope)。利用这些装置，通过以串行方式在一段时间对点和线 进行累加而构成图像。
扫描成像器一般用于凝胶或斑点，此时它们提供方便的操作。样 品被插入，并通过小的用户影响(没有聚焦、和调整亮度等)，进 行扫描并得到图像。和非成像计数系统一样，扫描成像器通常是一种 按钮技术。其容易使用以及好的性能导致其越来越多地被用于凝胶和 斑点分析中。
扫描成像器具有4个主要缺点a扫描速度慢。必须使光束和检测器装置在整个样品上通过，同 时在扫描过程中读取数据。扫描一个小的样品至少用5-10分钟。而 扫描一个大的样品要用半小时。这限制了生产率，并且使在扫描处理 期间变化的样品的定量分析复杂化。
b有限数量的的波长。由光学系统提供有限数量的荧光激励波 长，因此，只有有限数量的分析方法可以使用。
c低的灵敏度。大部分扫描成像器比本领域的成像器的灵敏度
低，
d亮度不合适。扫描成像器要求由对样品施加光束而产生的亮的 信号。因此，发射暗的内源性亮度的光的样品(例如涉及荧光素酶或 鲁米诺的反应)不能被成像。
e没有合适的井。只有扁的样品可以被成像。数量有限的共焦点 仪器可以进行光学分段，然后把划分的部分重新构成聚焦的浓的图 像。
一种面成像系统每次把整个样品放在检测器平面上。不需要移动 PMT或扫描激光器，因为照相机并行地使在许多小的检测器元件(通 常是CCD)上的整个样品成像。在同时获取图像之后，从检测器读出 整个图像。读出是一个串行的过程，但是相当快，其速率范围为几千 到几百万个像素/每秒。
面成像系统提供了有些很有吸引力的优点。 a因为一次便使整个样品成像，检测处理可以非常快。 b对于给定的合适的照明系统，可以应用任何激励波长。 c可以对亮度反应(没有入射光而发光)成像，包括闪烁光和生 物光或化学光辉光。
d可以对自由格式或固定格式的样品成像。
亮度成像更容易实现，其中不必施加照明。然而，大多数亮度反 应是很暗的，这使得极其需要现有的面成像技术。标准的对策是使用 用于这些类型的样品的灵敏的、科学等级的CCD照相机。然而，在没 有本发明的情况下，积分照相机不能使许多亮度样品成像。因此，本H明可以使用其它系统不能成像的样品成像。
一般的现有技术的系统对于在平的膜上的亮度样品和在井中的 亮度样品采用面成像。总是使用标准的照相机镜头。井成像的结果是 有缺陷的，其中没有对视差误差进行校正。
有多种关于使用荧光进行面成像的现有技术。荧光显微镜(见
Brooker等人的美国专利5332905 )和常规的凝胶与斑点成像是最常 用的方法。在显微镜方面的现有技术几乎没有什么关系，因为没有提 供对大的样品面积进行成像。
关于大的样品的现有技术主要包括对于常规的凝胶与斑点进行 荧光成像的低成本的商业系统。这些系统可以使用标准的积分的CCD 照相机对大的、亮的面成^f象。然而，它们具有以下主要缺点
a局限于由气体放电灯发射的波长。 一般提供UVA， UVB， UVC与 /或白光灯的一些组合。不能获得其它的波长。
b在化验期间波长不能改变。如果在化验期间波长必须改变(例 如关于用fura-2进行的钙计量)，则不能采用这种装置。
c对于荧光中小的改变不敏感。透射光从样品的正下方进入检测 器光学系统。因此即使非常好的滤光器也不能除去所有的直射光，这 便产生非特定亮度的亮的背景。在荧光中的小的改变(一般是许多样 品的)在非特定背景内被丢失。
d低能的照相机和镜头。只有极少数的系统使用高性能的照相 机。即使这些少数的系统也使用标准的CCTV或照相镜头，这限制了 它们对于亮的样品的应用。
e视差误差使得不能进行精确的井成像。事实上，远心的透镜尚 不能使用，这些系统在对井成像时呈现视差误差。
本发明的新的特征减少了已有的大的荧光系统的缺点。这些新的 特征包括
a照明波长可以被选择，而与气体放电灯或激光器的峰值无关。 b使用计算机控制的滤光轮或其它装置，在化验期间可以改变照C可以检测荧光发射中的小的变化。因为荧光照明是通过外部照
明(epi-illumination)得到的，或者来自脊部源或横向源，直射 激励照明不会进入光学系统。这提供了尽量低的非特定背景。 d对于暗的样品可以使用极高效的照相机和透镜。 e 独特的远心透镜是极快的，并消除了视差误差，从而使得能 够进行精确的井板分析。
本发明的主要优点在于它的高速远心透镜，它可以立刻对整个井 板成像，并可以对透明的或不透明的样品提供高效率的外部照明。和 样品耦联的光纤可用于代替透镜耦联。例如，光纤透镜一直被用于运 行在光子计数方式下的图像放大的CCD照相机，用于分析固定格式或 自由格式的数据。这种方法产生好的灵敏度，但是具有以下主要缺 点
a虽然建议系统可用于荧光样品，但局限于透射照明的样品，因 为没有位置用来插入外部照明机构。因此，光纤透镜系统将使灵敏度 变差，并不能用于不透明的样品。许多样品是不透明的(例如许多井 板、尼龙膜)。
b井板是8 x 12cm的，这种尺寸的成像光纤的制造是很困难的和 昂贵的。因此，必须对样品获得若干个小的图像，然后重新组装，以 便本身整个样品。
这种多次获取使得不能使用具有随时间而改变的样品的装置。 一种面成像分析系统(LUANA )被D. Neri等人披露了 ( " Multipurpose High Sensitivity Luminescence Analyzer" ， Biotechniques 20: 708-713， 1996 )，其j吏用冷却的CCD, 侧面安装的光纤照明器和激励滤光轮来实现一些类似于本发明的功 能(波长选择，面成像)。然而，LUANA使用侧面安装的光纤，这在 实验室安装的系统中被广泛使用，并具有被本发明克服的问题。具体 地说，使用侧面安装的光纤提供极不均匀的照明，特别是在利用井板 时。本发明的外部和透射照明系统对扁的样品和井板都提供均匀的照 明。此外，在LUANA的技术中，由于视差而不能对井板的样品成像。另一种系统(Fluorescence Imaging Plate Reader-FLIPR of NovelTech Inc. ， Ann Arbor MI)使用面CCD检测96井板中的荧光。 这种装置是一种非成像计数系统，并使用面CCD代替多个PMT。为了 达到合理的灵敏度，其以96个井的格式运行，并把在每个井内的所 有的像素集中成为一个值。这种装置不适用于亮度成像、自由格式成 像或较高密度的井成像，并且成本非常贵。
有许多现有技术使用成像检测显微装置(例如"基因"检测器) 内包含的样品。 一些基因检测器使用扫描图像仪，并检测由光电倍增 管发出的光。另一些使用面积CCD，检测被直接被设置在CCD上或被 设置在可以放置在CCD上的遮片上的样品点的变化。当固定的靶被限 定时，基因检测器具有大的潜力。例如，为寻找基因组信息而制造一 种遮片，并使该遮片用于筛选大量的血试样。当使其设计的序列具有 高的效率时，遮片必须含有大量的活性点，如果其用于筛选各种序列 的话。具有几千个点的遮片的制造是困难而昂贵的。西此，笫一代基 因检测器将用于篩选非常特殊的核苷酸序列。
显微装置的不灵活性和本发明形成了对比，本发明不需要试样基 片的微观制造。而本发明允许把试样放置在井中、膜上、硅化载片或 其它环境中。几乎任何反应都可以量化。因而，本发明可以用作显微 制造的替换技术。因为本发明是灵活的，并可以分析任何化学样品， 适用于分析研究的所有阶段。其中包括设计原型和质量筛选。因此， 当微观制造不适用或成本—效果比低时，本发明提供了 一种微观制造 的方法。
上述的每种现有技术都是处理成像样品的某些方面。然而，现有 技术没有解决在以低的光值成像大的样品时遇到的所有主要问题。这 些问题是
a需要非常高的检测器灵敏度；
b需要灵活的单色的大面照明；
c必须避免视差误差；以及
d需要更可靠的处理以便发现和量化靶。

发明内容
广义上说，本发明的目的在于提供一种克服现有技术的缺点的用 于化验的成像系统。尤其是旨在提供一种用于对井中或膜上的样品进 行面成像的完整的系统。特别是，本发明提供一种完整的系统，用于 对化学光、荧光、化学荧光、生物光或其它非同位素杂交样品，包括 高密度的斑点阵列，进行成像。
本发明的另一个目的在于，对化学光、荧光、化学荧光、生物光 或其它非同位素样品，包括组合的样品，以自由格式进行成像。
本发明的一个目的在于，提供一种用于对荧光图像数据进行数字 消巻积软件.应用这种软件可以减少闪烁和丢失焦点信息，
本发明还有一个目的在于，提供一种用于对样品成像的方法和系 统，该系统是灵活的、可靠的和有效的，特別适用于低值发射，
本发明提供一种检测器、透镜、成像系统和照明技术的协同的组 合，其可以对利用非成像计数器和扫描图像仪预先获得的样品进行成
像，尤其是，其可以用于固定格式或自由格式，并利用井板或扁的样 品。其能够检测荧光、亮光或透射光。
本发明的特点包括，其检测并量化大的规则排列的靶的阵列，检 测并量化不按规则阵列排列的靶，进行任何数量的按规则排列的样品 的自动分析，从少量的大的井到大量的极小的井或斑点。
本发明的另一个特点是提供一种面照明系统，其使用标准的低成 本的相干滤光器选择激励波长，能够对整个井板或类似尺寸的样品提
供均匀的单色激励；并且在计算机控制下可以对整个井板或类似尺寸 的样品提供不同波长的均匀单色激励。
一种使用本发明的系统提供一种专门设计用于井板格式的样品 的透镜。这种透镜在把光子从样品转移到CCD阵列方面非常有效(是 快的)，最好包括外部照明系统，并可用于非常暗的样品。该透镜还 是远心的。远心透镜具有可以直接射进井板内所有点的性能，并且没 有标准透镜具有的视差误差，
一种优选的系统提供一种远心的高速透镜，其在需要时产生均匀 的外部照明场，透镜配备有内部光纤照明系统，该系统不需要分色镜。透镜的结构最好能够接收一个作为阻挡滤光器(barrier f i 1 ter )的内部相干滤光器.通过透镜的光线当照射到阻挡滤光器上 时几乎平行，使得滤光器工作在其规定的波长和带宽允差下。
本发明的特点在于，其提供一种光汇聚效率高的高速远心透镜或 者标准的摄影透镜。
一种优选的系统提供一种CCD面阵列照相机，其具有高的量子效 率(大约为80% )，和高的灵敏度(16位精度)，使得大多数样品 都可以通过积分而不放大便可以检测。该系统最好具有一个和可选择 的图像放大器耦联的积分冷却CCD照相机.在一个用于极低光强的实 施例中，来自样品的入射的照明被放大器放大，在积分时间内，放大 的光在积分照相机上积累。在积分时间结束时，照相机由一专用控制 器或成4象装置读出，从而重现光图像。可以使用多次曝光，以便增加 照相机的动态范围。提供光密封的样品室，其中可安装所有的照明和 检测元件，并且其中放置样品。
按照本发明的一种系统可以包括平移装置(translation stage)(选择的)，其也位于光密封室内，并用于移动大的样品(例 如22 x 22cm的膜)通过光学系统。本发明通过软件控制该装置的移 动，并由利用平移装置获取的多个"瓦片"形成一个合成的图像。
本发明最好提供有软件控制系统，其校正阴影，几何失真，散焦 和照相机与透镜系统固有的噪声误差；并使用由不同的激励滤光器产 生的多个图像尽量多地除去非规范荧光。
具体地说，本发明提供一种软件，用于利用先前由透镜和检测器 系统测量的光学特性对一个焦面中的图像进行消巻积。应当理解，来 自多个焦面的数据也可以被消巻积。
虽然本发明的优选实施例使用高精度的冷却CCD照相机，但是如
果成本是主要因素，本发明可以使用低成本的照相机构成。在这种情
况下，通过降低图像质量和最终灵敏度，可以实现短的积分时间。


本发明的其它目的、特点和优点从下面结合附图对优选实施例进
、，
行的详细说明可以更清楚地看出，其中困1用于示意地说明按照本发明笫一优选实施例(直立的)的系
统；
困2用側视困示意地说明高速的远心透镜； 困3详细表示透镜的光学以及机械元件和发射滤光器支架； 困4示意地说明按照本发明的系统的笫二实施例，其用于极低的 光，具有设置在透镜和CCD照相机之间的放大器； 困5示意地表示放大器的结构；
困6用侧枧闺示意地表示扩散照明板，表示来自主光纤束的单个 的光纤束如何被取出并被设置在矩形光纤支架内；
图7用顶视图示意地表示扩散照明板，表示来自主光纤束的单个 的光纤束是如何被引入光纤支架内的通道阵列的；
图8是CCD照相机的示意困；
闺9是按照本发明用于进行图像获取和分析的方法的流程图；以及 困IO是说明在图9的处理中用于定位靶的方法的流程困.
图11 - 13是说明图9的详细资料。
具体实施例方式
现在参看附闺，困1示意地表示按照本发明的成像系统1的优选
实施例.系统1大体上包括照明系统IO,被提供在壳体14内的成像
子系统12，以及控制子系统16.成像子系统12包括设置在壳体14
的照相机室20内的CCD照相机子系统18和在照相机室20和样品室
24之间延伸的透镜子部件22.在操作时，照明子系统IO提供被施加
于室24内的样品上所需的光能.由样品发出的光能通过透镜子系统
22被传递到照相机18,在其中形成图像，并将苗像传递到控制子系
统16进行处理.控制子系统16包括照相机控制单元26,其是一种
和特定照相机18以及计算机28匹配的常规单元，计算机28对于控
制单元26编程，并接收来自照相机l8的数据，以便按照本发明进行
独特的控制和处理，
用于照明子系统的光源最好是孤光灯30.来自灯30的光通过液
体光导32被引入光耦合器或滤光轮34.液体光导34的优点在于，
它能传递UV范围内的光，并且比光纤对输入的光的扩散作用强.光耦合器34包括常规的用于标准的一英寸直径的相干滤光器的 滤光器支架(未示出).在优选的结构中，使用计算机控制的滤光轮 代替光耦合器.滤光轮可以包括多个滤光器，在计算机的控制下，它 们可以快速地改变.
光纤束36把来自光耦合器或滤光轮34的照明传递到不透光的样 品室24内.光纤束36通过遮光板38，其允许光纤束在样品支架聚 焦期间上下移动.此外，来自透镜22内的外照明环光的光纤束40可 以和光耦合器34相连.
描述了 3种形式的照明系统，其中每种形式由单个光纤束输入 光，它们是透射板(42)，透镜外侧的环光(未示出)，和进行外部 照明的透镜(22)内侧的环光44.
透射板是一个矩形室50(见图6和图7),在其内来自光纤束51 的单个光纤52被分开并被转动90度，使得它们沿横向指向样品100.光 纤52以这样的方式被分布在室内，使得它们在照明图形中的阴影最 小，为此，在室的外圃周部分比在其中心部分设置较多的光纤.
矩形室50包括扩散栅54和石英玻璃扩散板56.这些扩散部件 把来自光纤52的单个的光点作为其输入，并在板56的表面上产生均 匀的照明，室50还可以包括暗场阑(dark field stop),以便使 光从侧面进入样品.
外部的环光由和透镜的轴线对准的光纤环构成，其中心具有足够 大以便包围透镜22的孔.环光的工作距离和透镜22的焦距匹配.
内部环光44由光纤环构成，其被设置在远心透镜22的本体内并 和其轴线对准，位于远心透镜的前透镜元件的后方.扩散器、偏振器 或其它的圃形元件可以设置在光纤环44的前方.
样品井板被设置在被安装在光纤室50的支架58内(图6 ).支 架58在其边缘抓住井板.支架58的底部是空的，从而不影响对井的 ，见察.支架58被固定在可以使其沿垂直方向移动的传动装置上.通 过调节传动装置60,支架58相对于透镜22而移动，从而使光集中 在样品上.透镜22是高速远心透镜。透镜具有发射滤光器槽62，其接收3 英寸直径的相干滤光器用于荧光成像。它包括位于前透镜元件后方的 内部光纤环光源44。透镜22在其中部由法兰64 (见图2)被设置在 照相机室内。透镜的后部伸入照相机室20中，提供到发射滤光器槽 62的现成的通路而不干扰样品。透镜的前方伸入样品室24中。
被冷却的CCD照相机18被直接固定在透镜上。因为照相机具 有其自身的室20，所以不用担心在冷却装置、电源和从室内到照相 机控制单元的数据电缆周围的光的泄漏。
所有的控制、成像和分析功能都设置在计算机28中。
用于单色区域照明的标准技术是使用气体放电照明灯(例如UV 光盒)，在发射峰值其可以提供大约5000uW/cm2的表面。灯被涂敷 用于把光发射限制于一个特定峰值的滤光器。虽然相当亮，但气体放 电灯在波长上被限制于由灯内的气体激发的峰值。
除去气体放电灯之外，对于区域照明没有更多的描述。主要问题 是波长的选择，以及把照明光束直接引入集中的光学系统会使灵敏度 变差。为避免这些问题，光可以从上部、从侧面。或者通过暗场或通 过折射进入样品。所有这些技术具有若干限制。侧面安装的光纤照明 器是不均匀的。它们也不适合于井或其它非扁平的样品，因为光以一 定角度进入样品，因而不能穿透靶的深部。折射或暗场照明器需要在 井板处设置空间光学元件，并且不能用于不透明的样品。
一种更灵活的照明系统使用宽带照明光源，并能够通过精密的滤 光器(通常是相千滤光器)可以选择单色照明的任何波长。使用滤光 器是最好的，因为不同的照明器或低成本的可调激光器当在大面积上 扩散时其光输出将不足。
通常选择汞弧或氙弧灯作为基于滤光器的单色激励。弧光灯的优 点在于可以使其输出成为窄的光束，^使得在被散布在样品的整个表面 上之前可以通过小的容易得到的相干滤光器。可以使用透镜或光纤把 单色光从滤光器传输到样品。
本发明比已有的任何装置都更加灵活。其对整个样品表面褲和扩散的穿透照明(通过样品)、脊部照明(通过环光或其它光源)或外 部照明(通过透镜).外部照明是最好的，因为它通常产生较暗的背
景、较宽的动态范围以及在真实状态下更线性的荧光响应.提供大面 积的单色外部照明的能力是本发明区别于现有技术的一个基本因素.
本发明在提供照明方面解决了 3个主要问题.
a滤光器的可利用性-容易以小的尺寸实现的精密的滤光器(例 如10n迈带宽滤光器)不能用于大面照明.这问题通过使用标准的相 干滤光器被解决了.
b照明输出-在8 x 12cm的面积上施加均匀的、单色的和可选择 的照明是本发明的特点.光耦合器或计算机控制的滤光轮接收标准的 相干滤光器，并被用于选择波长.光耦合器或轮可以被设置在专门设 计的光纤板上用于穿透照明，#皮设置在光纤环上或被形成平面光用于 脊部照明，或被i殳置在透镜内的光纤照明装置上，用于外部照明，
c强度大-激励照明被散布在大的面积上(一般96cm2),因为 强度随被照射面积的平方而减少，所以得到的激励强度的确是非常低 的.在许多情况下，发射的荧光将不能用标准的工业等级的被冷却的 CCD照相机检测到，本发明的非常灵敏的检测器能够使大的样品发出 的低的荧光成像，在极低的光的条件下，本发明包括可选择的光放大 系统，其可^L插在透镜和CDD照相机之间(如下所述).
图2表示在远心透镜22内的照明和滤光器元件的总体布置.透 镜内已安装有光纤环光源44，其通过前透镜元件在样品(图2的左 侧)上投射单色照明.环光源的焦面在B，而整个透镜的焦面在B的 前方A.把环光源的焦点置于样品之外的一点上可以减少来自样品的 特定的反射.
发射滤光器槽62使得能够插入相干滤光器，其从输入的光线中 除去激励照明，只剩下由样品发出的荧光.
图3表示远心的大的透镜22的光学元件.透镜具有39个表面，
并具有以下的特征
有效的焦距164.436咖数值孔径.443放大率 0.251. 所有金属内部件的长度和直径精确到土o.oo]。
2. 壳体(3)的内径精确到±0.001 ，至座和接触表面的距离精确到±0.001。
3. 所有的螺紋为每英寸32。
4. 所标尺寸为黑防腐处理后的数值。
4. 材料6061 -T6铝。
5. 图中标有"G"的部分为玻璃透镜。
注意在发射滤光器槽62内光线几乎是平行的.这使得滤光器能 够在其特定的波长和带宽下操作.
虽然本发明可以使用任何透镜，但使用其专门设计的透镜可以得 到最高的灵敏度.这种透镜是髙速的远心透镜，并包括适合于大的样 品的外部照明系统.
外部照明在荧光显微镜中是一种标准的技术，其中小的面积被照 射.照射小的面积的最有效的方式是把二色分光镜置于物镜的后方. 二色分光镜或平面镜是一个局部反射平面，其反射一个波长范围，而 允许另一个波长范围通过.
在显微镜上，照明从側面进入二色分光镜.使二色分光镜具有一 个角度，以便向下通过物镜朝向样品反射激励光，由样品发出的荧光 (其波长比激励光向上偏移)被物镜采集，使其向上通过朝向分色 镜。分色镜对于发射波长是透明的，使得光线通过分色镜向着检测器 平面行进.对于每个激励/发射波长需要不同的分色镜.
在对于大的成像系统应用标准形式的基于二色分光的外部照明 系统时存在的主要困难是
a 二色分光镜至少必须和其必须填满的物镜那样大，照相机透镜 比显微镜物铣大得多，因而需要相当大的二色分光镜.这样大的二色 分光镜是不容易得到的.
b在高速大透镜(macro lens)中，重要的是后透镜元件要固定 在尽可能靠近CCD的位置.在最后透镜和CCD之间的距离的任何增加 都显著地减少工作数量和采集光的效率.因J^，不可能把二色分光镜 设置在透镜的后面.
c在常规的外部照明系统中，二色分光镜通过整个透镜反射激励 光.为此，激励照明的传输极大地受到在透镜中使用的玻璃的光学特 性的影响.UV外部照明需要非常贵(并且难于加工)的石英光学玻璃，这些光学玻璃可以制成小尺寸的而用于显微镜物镜，但是，用于 本发明所述的大尺寸的情况将是非常贵的。
d 二色分光镜吸收光。 一般地说，其效率为80 - 90 % 本发明的独特的性能在于其不需要二色分光镜。远心透镜是大 的，因而有余地在其本体内安装照明装置，照明装置被如此安装，使
得其在前透镜元件处从后方直接照射。这样便照到样品，而不需要反 射的二色分光镜。通过透镜被反射回的任何杂散的激励照明都通过位 于照明光源后方的发射阻挡滤光器被除去。
此外，透镜被如此设计，使得只有15个内部透镜元件中的1个 处于内部照明器的前方。其优点在于，可以减小内部闪烁和反射。同 等重要的是，只需要前方透镜对于UV是透明的。 一个UV透明的透镜 是贵的，但是并不至于不能接受。
透镜的前方元件被这样计算，使得把光源聚焦在样品的平面之 外。光源不聚焦在样品平面内能够减小反射。因为许多井板由抛光的 塑料板制成，因而易于发生镜面反射，这是一个重要特征。
这种透镜是高效的。透镜的汇集F〃是4. 5。这意味着汇集的空 间角是0. 03891 sr ，汇集效率是0. 03891/4p=. 3096%。预期的透射 值是0. 85-0.90，给出的整体汇集效率为0.263-0. 279%。和F/1. 2 照相透镜相比，利用本透镜的预期的改进大约为340 %。
本透镜是远心的，远心透镜没有视差误差。利用标准透镜得到的 深色的图像和窄的靶呈现视差误差。在图像中心的圆的靶被认为是真 正的圓形。然而，透镜以一定角度射进横的靶。因此，这些横的耙被 看作是月牙形的。在许多情况下，根本看不到井的底部。远心透镜在 井板的整个面积上汇集平行光线。因而，不以一个角度射进任何井 中，因而没有视差误差。
本发明的透镜的主要优点在于，内光束在适合于插入阻挡滤光器 的位置被准直。即，透镜是这样计算的，使得大致在透镜筒的中部的 一点上，光线几乎是平行的。在这一点上，透镜中安装相干滤光器。 ^^，光器用于除去激励照明和其它的非规范光。在这一点上被准直的光束这重要的，因为相干滤光器必须以垂直"f进入的照明的方式被安 装。如果进入的照明处于一个角度，则滤光器通过的波长将发生变 化。在本发明中，当光线射到滤光器上时，它们几乎是平行的，从而 产生尽可能好的性能。
远心透镜具有固定的视野(在这种情况下直径大约为14. 5cm)， 但是，如果需要对较大的样品成像，在不透光的室内可能要安装电动 的平移台。在计算机的控制下，平移台使样品相对于透镜而移动。在 每次移动之后，获得一个"瓦片"。当对整个样品完成成像之后，所 有的瓦片被重新组合(由软件)成一个大的图像，从而保持远心度、 无视差误差以及在整个表面的高分辨率。
图4表示图1的系统的一种改型，其中增加了选择的放大器70, 以便提供用于对极低的光成像的另一种系统。在其它各个方面，该系 统和图1的系统基本相同。放大器70被安装在远心透镜22和CCD 照相机18之间。
图5表示GEN 3型的放大器70，其包括光敏阴极72，微通道板 (MCP)74，荧光屏76，和真空密封的本体或壳体78。高速远心透镜 22(图2， 3)置于部件70的前方。在其输出侧，透镜被聚焦在阴极 72的输入窗上，从而把样品图像传递给部件70。光敏阴极72被这样 选择，使得其与照到其上的光强成正比地反射电子。MCP 74位于真 空密封本体78内，在阴极72和荧光屏76之间，并在每端和阴极72 相连。MCP 74具有小直径的MCP通道，其每个涂敷有镓的砷化物。 从阴极72发射的电子沿着MCO通道被向着荧光屏76加速。当来自阴 极的电子沿着小直径的通道被加速时，它们撞击涂敷的通道壁，从而 产生附加的电子。当附加的电子离开MCP通道时，它们撞击荧光屏 76，从而在输出窗产生样品的放大的图像。该图像通过透镜80和照 相机中的CCD元件84耦联。
已经发现，使用Extended Blue GEN 3图像放大器比使用其它图 像放大器的优点在于，其在输出屏上提供的图像是锐的，具有小的阴 影误差，并且比GEN 1和GEN 2放大器的噪声小。不过，可以理解，随着较好的放大器的研制，它 们可以用于本发明中。
积分照相机18被这样配置，使得在输出窗78上产生的被高度放 大的图像通过中间透镜80被聚焦在CCD元件84上。对于低光强样品 的图像，照相机18的CCD元件84积分一段时间。在这段积分时间内， 来自输出窗的入射到CCD元件84的光子作为负电荷(信号)被存储 在CCD元件84的大量单独的区域中。在CCD元件84的每个单独区域 中的电荷量被累积如下，
信号=入射光x量子效率x积分时间
来自放大器70的入射光的相对强度越大，存储在CCD元件84的 相应区域中的信号越大。
对于最低的光强的情况，因为闪烁接近样品，本发明允许光放大 器被插入透镜和CCD照相机之间，这种光放大器是一种图像放大器。 例如，在Simonet的美国专利5204533中披露的放大提及把图像放 大器和CCD照相机相连。图像放大器一般包括光阴极、荧光屏和连接 在光阴极和荧光屏之间的^:通道板(MCP)。利用这种类型的装置， 可以得到高达大约为90000的光放大倍数。
利用被插入光路链中的放大器，本发明成为一种图像放大的CCD (ICCD)照相机。在ICCD照相机中，图像在3个或4个平面中产生。 在这些平面的每个上，具有一些量子效率的损失。因此，图像放大器 工作在高的增益下，以便克服在光路链内的信号损失。在极高的放大 倍数下，噪声和通过MCP的离子反馈是如此严重，使得不可能进一步 改进灵敏度。即使工作在最大的增益下，常规的图像放大的CCD照相 机因灵敏度不足而不能使最暗的样品成像。
对于一般极暗的样品，大多数ICCD照相机不能产生图像，或者 只能产生极浅的图像，其中难于把靶和背景区别开来，并不能给出靶 的强度的真正范围。在最坏的情况下，则根本不能把靶和背景区别开 来。
常规的图像放大的CCD照相机使用等于一个电视帧的积分时间。 短的积分时间允许放大器用于标准的低成本的视频照相机，例如被用于电视工业中。、换句话说，放大器用门进行控制，以便使用极短的积
分时间(例如1 msec)。使用门进行控制使得放大器可以用于光子 计数方式。
本发明提供了两种可以使用放大的光的方法。 一种优选的方法涉 及在被冷却的CCD照相机上连续积分放大器的输出。这种方法是快速 高效的，但具有有限的动态范围。可以使用放大器的冷却，或不同时 间的多次曝光，以便改进动态范围。笫二种方法涉及观察一个较短时 间内的放大器输出和光子计数。这种方法慢得多，但是具有宽的动态 范围。本发明可以根据样品的要求来选择两种方法之一。
现有技术中存在在井板分析成像中使用放大的CCD照相机的技 术。Martin和Bronstein ( 1994 )以及Roda等人(1996 ) i寸论过利 用放大的CCD照相机进行化学光样品成像。只有亮的样品可以看到。 没有提供对于深的井在没有视差误差的条件下，或者对样品施加单色 激励进行成像。
Rushbrooke等人的美国专利4922092 ( 1990 )披露了使用和特 殊光纤透镜耦联的图像放大的CCD照相机。光纤透镜包括在井阵列和 放大器的输入端之间传输光的光纤束。虽然由Rushbrooke披露的发 明是无视差的，并且适用于标准的96或384井板，但是其不能对本 发明所述的很高密度的井阵列成像。此外，由Rushbrooke披露的发 明缺少照明能力。它也不能对自由格式的样品成像，因为在输入光束 之间具有被寻址的空间。和光纤相反，本发明通过使用透镜输入，允 许自由格式成像。
总之，本发明的本实施例允许使用置于透镜后方的选择的放大 器，用于检测最低光强的样品。当被放大时，该装置可以运行在连续 积分或光子计数方式下。
利用图4和图5所示的系统，只有CCD检测器被冷却。这对于大 多数应用是足够的。不过，应当理解，放大器光阴极72也可以被冷 却，借以改进放大器的信噪比。类似地，整个光敏装置(放大器+ CCD) 可以被冷却。不过，冷却整个光敏装置的缺点是会降低在光纤输出窗i的荧光的效率.
虽然高质量的工业等级的CCD照相机可以检测大约50个入射到 CCD的光电子(和设置的检测可靠性有关)，但在成像照明下的样品 时，这一表示性能的数据是不精确的。实际性能被整个光路链的发射 与收集性能以及CCD照相机的性能复杂化了。因此，应该超出检测器 的QE，并检查整个系统的传输效率。
有3个因素决定检测器系统的传输效率(产生的光电子/发射的 光子)。它们是透镜的光汇集效率，CCD检测器的量子效率和透镜的 透射率。可以按下式计算产生的光电子数
Npe= T * <j)detector *C- e. *Nphotons
其中
t是透镜的透射率，对于本发明的透镜大约为85 - 90 。/。
<j)是CCD检测器的量子效率， 一般为35 - 40 %,在本发明的情 况下高达80%，以及
c. e.是透镜汇集效率，对于高速摄影透镜，其小于.1%,在本发 明的情况下大约为1. 2%。
在一般的工业等级的CCD照相机系统中，使用可得到的最快的摄 影透镜(fl.2),并利用高质量的冷却检测器，CCD对于由试样中的 点光源产生的大约5000 - 10000个光子将产生1个光电子。
本发明的透镜提供大约0. 271%的汇集效率。CCD检测器的效率大 约是其它CCD的两倍。其结果是本发明在理论上，对于由试样中的点 光源产生的大约500 - 1000个光子将产生1个光电子。这一很高的传 输效率使得能够进行利用现有技术的系统不能成像的样品的检验。
在图4和图5所示的实施例的另一个实施例中，系统包括一个扩 充的蓝色型GEN 3图像放大器。其它类型的放大器虽然不如这种的 好，但也可以使用。3种主要类型的放大器(GEN1， GEN2 ， GEN 3) 的区别在于其元件的结构和构成元件的材料不同。在GEN 1放大器 中，入射到光阴极上的照明以正比于入射信号的强度的速率产生发 射。然后，从光阴极发射的电子通过高压电场被加速，并使瓜铮电聚焦或近聚焦在荧光屏上聚焦。荧光屏可以是视频照相机的输入窗(如
同硅放大的耙照相机)，或者可以直接观看。GEN l具有一些几何失 真，并且具有相当低的量子效率(大约10% )。
GEN 2放大器类似于GEN 3，在成像管内在阴极和阳极之间具有 MCP。和GEN l放大器相比，GEN 2放大器较小，噪声较低，并具有 较高的增益。不过其量子效率相当低(一般在20%以下)，并且其 易于具有差的对比度传输特性。与此相反，GEN3放大器管具有大约 30%的量子效率或更高(需要小的增益)，并具有很高的固有对比度 传输特性。关于最近型号的GEN 3，其增益值大约和GEN 2的相等(可 得到的极限增益值大约为90000 )。因此，GEN 3放大器比GEN 2放 大器易于产生较好的图像。当由于成本或特殊的设计特点而需要时， 也可以使用其它形式的放大器。可以使用具有高的固有增益的类似装 置(例如电子照射的后部照明的CCD检测器)代替图像放大器。
本发明的CCD照相机18可以使用锁定于图像放大器中的门控电 源的积分时间，其结果是照相机可以以非常短的时间间隔被读出。使 用门控和快速读出的特点，并使放大器运行在最高的增益下，或者利 用中间放大器，可以使本发明作为常规的光子计数照相机那样被操 作。因而，本发明的系统可以有利地用于微弱样品的直接成像，或者 通过使其操作方式从积分变为门控而作为光子计数照相机。
图8示意地表示CCD照相机18。照相机18包括位于照相机快门 后面的CCD元件84。为了减少由CCD内的电子产生的暗噪声CCD元 件84 ;故安装在散热器88上，散热器88又和Peltier冷却元件以及 用于提供增强的热耗散的液体循环系统呈导热连接。使透镜位于快门 上方，以便使图像聚焦在CCD元件84上。在除去摄影透镜装置之后， 高速远心透镜22 (图2和图3)直接利用螺丝固定在照相机本体上。 类似地，图像放大器70 (当存在时)被直接固定在照相机本体上。
面成像系统使用CCD阵列形成图像。影响CCD阵列检测少量的输 入光子数的能力的因素包括量子效率、读出噪声和大多数成像阵列的 小的尺寸(例如2. 25cm2)。量子效率(QE)表示CCD中的光检测器把入射的光子转换成电子 空穴对的能力。消费等级的CCD的QE—般大约为12-15%。标准的 工业等级的CCD照相机的QE大约为40%。数量非常有限的薄的背后 照明的CCD在峰值检测波长下的QE可以达到80%。
读出噪声来源于CCD的输出前置放大器，其测量每当一个或几个 CCD元件的电荷被传递给它时所产生的电压中的小的改变。读出噪声
直接和读出速率有关，在使用慢的读出速率时被减少。
暗噪声是由在CCD中由热而产生的电荷而产生的。通过增加背景
电平，暗噪声减少动态范围。可以从图像中减去恒定的暗噪声值，但 是暗噪声也具有不能被减去的随机噪声分量。这一分量加于检测器的 噪声值上。通过冷却CCD而使暗噪声减少。
CCD元件的尺寸和其存储光电子的能力(被称作井容量)有关， 因而和其动态范围有关。在阵列中的每个CCD元件越大，元件的井容 量和动态范围越大。宽的动态范围允许检测器用于较长的曝光时间而 不饱和，因而增强了极小信号的检测。此外，较大元件的信噪性能本 来就好于较小的元件。大多数面成像系统使用相当小的CCD。这对于 其中离散的CCD元件是大的装置产生有限的分辨率，并对于其中离散 的CCD元件是小的装置产生有限的动态范围。具有有限的动态范围的 装置不能达到16位的精度，因而必须用于相当亮的样品(例如荧光 显微镜，UV凝胶，很亮的化学光)。
本发明包括祐L设计用于减少刚刚述及的所有问题的CCD系统。这 种CCD阵列通常是大的(6.25cm2)和效率高的(大约80%的量子效 率)。其结果是获得了具有宽的动态范围的极高的检测器灵敏度(16 位)。优选的支持电子部件包括高精度的数字化器，其具有最小的读 出噪声。照相机最好被冷却，以便减少暗噪声。
在照相机内附带地提供有机电快门，用于限制图像在CCD元件上 曝光。照相机最好是薄的，背后照明的1024 x 1024个像素的黑白照 相机，具有异步复位功能和高的量子效率。通过设置在照相机控制电 路内的数字化电路和设置在计算机内的接口卡，照相机提供16位的数字信号输出。来自CCD的数据以200000个像素/秒的速率 皮照相机 控制单元数字化，并被直接传递到计算机存储器。
在积分间隔之后，CCD照相机接收来自计算机的触发脉沖，以便 启动机电快门的曝光。随着快门的闭合，图像被从CCD传递到计算机 的内部帧緩冲器。
虽然这种照相机可以在不冷却CCD元件的情况下使用，但是通过 使用具有整体冷却的元件的CCD照相机，可以实现扩展的积分间隔。 积分的有效性受冷却程度的限制。利用无制冷的液体冷却装置，可以 达到大约-50"C (环境温度以下)的检测器温度。在这个温度下，暗 噪声的累积速率大约为7-10个电子/秒。这种冷却具有成本低并且 容易实现的优点。
不过，应该理解，如果使用制冷的液体或深冷的冷却剂，可以实 现更长的积分时间。
控制系统16包括控制单元26和计算机28。照相机控制单元是 一个由照相机18的制造者提供的用于控制照相机的可由计算机控制 的单元。计算机28最好是一种常规的运行在Windows环境下的计算 机，并被编程用于实现按照本发明的图像获取和分析。
基于照相机的成像系统缺少在一般的计数或扫描系统中使用的
按钮操作。照相机聚焦、调整曝光时间等可能都不方便。
实际上，成像本身比对井内的一种靶进行计数复杂得多。非成像 计数系统具有相对简单的任务。它们只需要控制扫描过程，控制内部 校准以及产生表示每个井的小的数据点阵列。其可以采用以下的操作 步骤
a相对于内部标准校准检测器。
b照明一个井。
c在照明的井上放置PMT。
d读出井
e把数据传递到分散板上。 f照明下一个井并重复。面成像系统具有复杂得多的任务。对一^K井板成像可以包括以下
步骤
a在整个井板上提供足够的照明。
b控制高性能的照相机。
c存储几何和密度校正系数。
d对样品成^f象。
e校正几何和密度变量。
f如果需要，按照样品内的标准校正图像。
g定位每个井并对强度量化。
h把数据传递到分散板上。
如果成像系统配置有用于完成上述b-h功能的软件，则可以仅完 成这些任务。本发明包括这种软件。
具体地说，本发明的一个方面是一种软件，其通过使用两个图像 对于非规范背景校正荧光。第一个图像由这样二个激励滤光器形成， 其在激励非规范荧光的同时激励尽可能少量的规范焚光。第二个图像 由这样一个激励滤光器形成，其尽可能多地激励规范荧光，而尽可能 少地激励非规范荧光。借助于从规范的图像中减去非规范图像而形成 最佳的规范荧光图像。
图9是说明由用于控制系统1并从中获取数据的计算机28执行 的主要处理的流程图。在处理开始之后，4吏用照相机18在块200获 取样品的图像。用于获取样品的偏图像的处理是已知的。这种偏图像 考虑在获取图像时由系统本身引入的所有的严重失真和误差。利用一 种已知的方法，在步202获取样品的偏图像。
在步204，获取非规范图像。这种图像确定非规范元素例如基片 对于图像的贡献。这一步被表示为选择的，因为只有在样品必须被照 明以便获得样品图像的情况下才进行，在这种情况下， 一些光也从非 规范元素反射。在另一方面，如果样品是图像的光源(例如化学光)， 则不获取非规范图像。类似地，块206的步骤是选择的，因为它涉及 获取非规范偏图谬，在块208，从样品图像中1^去或减去样品偏图像。在块210从非 规范图像中减去非规范偏图像。这得到两个图像，其中偏置的影响已 得到补偿.在块212,从补偿的样品图像中除去补偿的非规范图像， 从而产生工作图像，其中样品的作用被分离。本领域的技术人员应该 理解，如果不进行步204和206,则步210和212也不进行。
在除去偏置之后，使用已知的方法提供各种其它的校正(例如起 源于透镜的几何失真)。
在步214，操作者向计算机输入标准的"网格"间距和"测试模
板"。网格间距是在基片上样品试样的标准的心对心间距。"测试模
板"是相应于膜上的一个点、板上的一个井或类似的靶的单个靶的标
准规定(例如根据形状和面积)。 一般的测试模板是一个圆形的区域，
并对于样品中的每个靶有一个测试模板。网格由一个矩阵构成，其中 含有对于每个靶的一个测试模板。
选择地，操作者也可以定义一个"锚点"(anchor point)的阵 列。样品可以包括数千个可能样品的阵列。在一些情况下，这些阵列 的大部分将被填充，在另一些情况下，则只有一小部分被填充。在相 当少的试样点被填充的情况下，样品将包括预定的"锚点"，以便帮 助系统确定测试才莫板的位置。在大部分可能的试样点被填充的情况 下，试样本身提供足够的填充，以便定位测试模板，因而不需要锚点。
在块216，产生具有规定的网格间距的规定的测试模板并被叠加 在工作样品图像上。此时，操作者可以对测试模板的叠加的网格选择
地提供手动调节，以便使其和实际样品在总体上对齐。操作者应当这 样作，例如，借助于利用鼠标移动整个阵列，然后"抓住"规范的测 试模板并使其在样品上的合适的靶上对准中心。例如，操作者可以借 助于使网格的4个角上的测试模板在样品的合适的靶上对准中心来 进行整体对准。虽然不重要，但是这手动调整将加速并简化由计算机 28进行的处理。
在块218进行如下所述的处理，以便确定测试模板相对于可能的 耙的实际位置的更精确的位置"在块218处理的开始，确定是否靶或锚点已被充分地识别或确定.如果靶已被4艮好地确定，则控制转移到
块222,在其中测试模板的阵列和确定的耙对齐，但是如果锚点已被 很好地确定，则控制转移到块220，在其中测试模板的阵列和锚点对 齐；否则，控制则转移到块224，在其中预定的网格间距和阵列的测 试模板被利用。应该理解，在一些情况下，可能需要把阵列和锚点对 齐然后和靶对齐。
一旦测试模板和粑对齐之后，则在各个测试模板内的测量对于不 同的条件被解码。例如， 一个测试可能采取n个条件中的任何一些条 件，因而块226的处理可以在每个测试时对于这些条件中的一个对试 样进行解码。实际的处理根据统计进行，并且由一个关于判定二进制 决定的一个简单例子可以得到最好的理解。不过，本领域的技术人员 应当理解，所述的处理实际上可被用于解多个条件处理。在最简单的 情况下，二进制决定是"yes"或"no"的决定，其可以和某个条件 的有无相关。按照块226的处理，测量样品的每个测试的实际值，对 于一组试样确定平均与标准偏差，这便得到工作统计分布。然后对于 由操作者选择的任何置信度值进行"yes"或"no"的解码。操作者 选择置信度值使得确定一个门限值(例如根据所述的值确定一个与分 布曲线的平均值的标准偏差的计算数)，并且在门限值以上的任何信 号被认为是"yes"，而在门限值以下的任何信号则被认为是"no"。
报告。可以设想这可以是一个任何形式的写软件的报告，其向操作者 提供在制备所需格式的报告时的基本的灵活性。 一旦报告被产生，处 理就告结束。
作为附录A所附的资料更详细地说明了图9的处理。 图IO是说明图9的块222中进行的处理的流程图。 在开始处理之后，在块300计算图像背景和噪声。在块302，确 定是否需要网格对于靶的阵列进行组对准。这可通过操作者观察或者 通过系统进行。这一检验的目的在于确定网格是否和整个靶对齐。如 果由系统完成，则利用常规的用于检验两个规则形状的图形是否对齐的程序完成。如果确定组已被充分地对齐，则控制转移到块306。 在块304进行组对齐。这个操作的目的在于使检测模板网格和各
自的靶粗略地对齐。这可根据整个网格或由操作者选择的部分网格进
行。除去使ID在整个网格上最大之外，这对齐可以通过下面讨论的
关于块306用于使ID最大的处理完成。
在块306，在每个测试模板的区域内进行台阶状的处理，以便由
式(1)确定在测试模板内产生最大集成密度ID的点
ID ( xO， y0 ) =J"S "o,y。) D ( x， y ) w ( x-xO， y-yO ) dxdy ( 1 )
其中(xO，yO)是测试模板的中心点；
S ( xO， y0 )是在(xO， y0 )的测试模板面积；
D (x，y)是在(x，y)的密度值(例如增量剂)；以及
w( x， y )是加^又函数(例如在(0， 0 )具有其最大值的二维Gaussian
函数)。这对每个测试模板产生一个"A位置"，它是在式(1)中
提供最大值的位置。在块306之前的测试模板的位置则称为"G位置"。
在块308,在A位置和G位置之间进行置信度加权，以便达到每 个测试模板的中心的最后位置。对于A位置的置信度加权系数是信噪 比的形式。即，在每个点的ID值正比于在那一点的ID值和对那点在 块300确定的值的比。实际上，加权系数被用于确定沿着位置A和位 置G之间的直线的测试中心的位置，从而加权确定该点和位置A接近 的程度。
虽然详细说明了本发明的优选实施例，但本发明不限于此。本领 域的技术人员可以作出各种改变和改型。本发明的范围由所附权利要 求限定。附录A
1.引言
分子生物学、化学和自动化方面的快速进步正在从总体上对生物 医学，特别是对药物新发明方面发挥着深刻的影响。由于某些公司对 新技术接受得非常快，加大了对所有的竟争者的压力。人人都想降低 发现和评估潜在治疗指标所需的费用并加快其速度，结果导致了药物 科学的一个新领域-生物分子筛选-的迅速成长。生物分子筛选可以 被定义为对大量化合物的潜在药物学效应进行迅速而有效的实验室 试验。
生物分子筛选的成长是组合化学、生物学多重接受法、分子基因 学和其它领域中的新事物和新理解的必然结果。例如，组合化学家可 以从一个简单化合物开始，由它产生出成千上万种具有潜在重要性的 化合物。必须对所有这些化合物，或它们的一个重要亚群，做生物活 性试验。另一个例子是发现、检测和研究化合物和基因之间的相互作 用的特征。
组合化学、分子基因学和其它应用的要求已经导致了筛选技术的 一个特殊领域-高工效筛选(HTS)-的发展。HTS与通常定义的生 物分子筛选没有本质的区别。我们可以把它看成是从筛选法而来的 "减重高速汽车"，其中相当多的开销和努力花费在提高测试化合物 的速度上。检定化学、检测系统、自动化/机器人以及生物信息学中 的最优秀的技术都在HTS中扮演了自己的角色。
能够使检定化学最有效率的一种途径是使检定形式小型化。例 如将从96个井板改成384个就增加了单位面积里的检定位。可以 断言将会很快出现更高密度的微井形式。微井检定将紧随着其它筛选 方案的引导，利用显微加工装置或布点机器人在固体载体上提供非常 密集的DNA克隆阵列(例如Beattie等，1995; Eggers等，1994;Oirapko等，1989， 1991; Lamture等，1994; Lipschutz等，1995; Maskos和Southern,1992;Mason,Rampal和Coassin,1994;Pearson 和Tonucci, 1995; Pease等1994; Saiki, Walsh, Levenson和 Erilich， 1989; Schena， Shalon, Davis和Brown, 1995; Southern, Maskos和Elder, 1992 )。
一个典型样品中的目的基因数目在迅速增加。今天的显微加工示 范装置含有大约1000 - 20000个格网元素(简要评介见Southern, 1996 ).布点检定通常获得高得多的密集度。在我们的档案中有一些 图片，是在一张约20x20厘米大的膜上容纳了多于50000个同位素标 记的cDNA点状杂交斑。我们还看到过用非同位素方法获得的高得多 的密集度，在这种方法中密集度的集中不受同位素辐射发散的限制。 由于微板、膜或其它媒体上愈来愈密集地布满检定位，导致了等间隔 格网模式检定位的高密集度。这就是通常所谓的"高密集度格网"。
分析井采用的传统方法(一般是基于光电倍增管的计数器)常常 不适于高密度格网。计数装置必须一个接一个地为各个格点编址，无 法处理小检定位构成的大阵列。与此相对照， 一个基于照相机的成象 系统同时适于高密度格网和自由形式的样品(即那些不是等间隔模式 的样品)。自由形式样品的例子包括在分析亚中的组合液滴检定、組 织培养中的细胞级检定和克隆检定等等。
图象和筛选技术之间的界面还处于形成阶段，其技术刚刚达到可 以使用的程度。显微制造、非人造阵列(比如膜、微井)和检测技术 方面的革新将与图象分析结合，成为新的筛选法在排序、诊断和接合 方面的有力工具。
图象与库筛选
分子基因学，或DNA分子水平的基因研究涉及到特定基因编码的 DNA的分离和特征化。最基本的目的基因是与疾病和病理学过程相关 的基因组。例如大多数癌症都来自于非遗传性基因突变(体细胞突 变)，这种突变导致细胞功能失常。如果一个特定基因的改变常常与一种特殊的癌症相关，那么这种基因的变化或许就能够被用襄检测这 种癌症。基因工程技术也可以用来研究基因及其编码蛋白的功能、批 量生产稀有蛋白和创造基因紊乱的动物模型。所有这些的出发点就是
cDNA和基因组库的筛选。我们为简单识别出那些与我们的探针杂交 的克隆而进行筛选，或为识别那些响应某些无关变量(比如两个细胞 林)而改变了基因表达的克隆而进行筛选。
DM库筛选的最普通的应用就是识别和分离对应于一个感兴趣的 特定基因的克隆。为了从一个特定的基因分离出克隆，必须有一个 可用于这个基因的探针。然后对DNA库进行筛选以得到包含有与探针 杂交序列的克隆。
为感兴趣的基因而分离克隆的DNA的第一步是将一个库里的分立 克隆涂抹到一个空模子里，在这个模子的各位置上放置一个分立克 隆。位于各位置上的克隆可以是已知的克隆，正象当我们有一个科斯 质粒，或YAC，或BAC克隆的有序阵列时那样。这种方法有一个优点， 即同时复制基因并标注它在染色体上的位置。由于这样的库常由基因 语图构成，基因位置的识别就可以给出与已^L标注在染色体同一区域 的遗传性疾病的可能的联系。另外，克隆还可以构成一个特殊库的非 有序取样(存在多余部分和重迭部分)。
分立的克隆的库^L复制在一个固态载体上，具有代表性的固态栽 体是滤膜。用精密的布点机器人能使整个库在很少的膜上按高密集度 格网涂抹开。因为库中的各个克隆可能只包含感兴趣的基因的一种蛋 白或者一个特殊的基因可能在库中未被充分表达，为了有更多的的机 会找出正(互补)克隆，需要筛选出数万甚至数十万个分立的克隆。 结果是针对一种特定基因的被标记的探针将只与数千个可能的目的 基因中的少数几个克隆相互作用。
为识别正克隆，我们将点状斑的高密集度格网与 一 个被标记的探 针杂交。典型的探针是一个DNA的小片段或者合成的已知排序的低核 苷酸。杂交阶段利用了强有力的排序特性和互补核酸单链之间的高亲 和性。这一过程的目标是确定我们膜上的库是否包含了与我们探针的已知排序互补的排序。如果有，就能获得这个杂交的排序，并用它把 我们的注意引向包着较小的杂交部位的基因组的未知部分。
使克隆与探针的杂交度可视化是成象系统的职责之一。高密集度 格网可以用同位素或非同位素成象使其可视化。对于同位素标记的探 针，磷成象板技术是最方便和精确的信号检测方法。非同位素的检测 可以用一个灵敏的数字照相机和化学发光剂或荧光标记来实现。我们
建议用我们的Tundra超低光成象系统来达到这一 目的。无论我们的 标记物是什么，结果都是 一幅高集密度格网的图象。在典型的筛选 研究中，这种图象包含了成千上万个未标记的点和几个标记过的点。 分析这个图象来别识正的命中点是成象系统的主要功能之二 。
图象分析涉及点的定位、杂交强度的定量化和正负命中点的解 析。最困难的方面是点的定位。因为篩选一个库通常只在图象上产生 很少几个可见的点，根据强度对正的目的基因进行定位看起来很容 易。在这种情况下，我们将"盯住"图象，并设置一个只选命中点的 水平(阈值)。在库筛选中比在基因表达研究(见后)中更适合采用 按照密度值选取命中点的方法，但它却不是一种选取命中点的好方 法。这是由于以下原因
1. 本底和标记强度的变化常常在为命中点定义一个单一的密 度值时导致某种不确定性。考虑与克隆杂交的探针的情况，如果 这个克隆是具有弱的、但真正与探针同系的染色体的重要的克隆， 它将呈现微弱斑点，其强度仅仅稍高于那些负点的强度。如果做正 点选择时采用简单的密度截断，这个点就很可能被丢掉。
2. 密度标准在进行定量和评估之前就消除了目的基因。因此我 们是在主观判断(点看上去较暗或较亮)的基础上，而不是在定 量数据的基础上检测命中点。
作为对照，我们的软件利用格网的等距离间隔在识别命中点之前 给所有的格网元素定位和定量。这种方法(固定采样探针的策略)在 过滤器上使用特殊的"锚"点来提供特别的参考点。利用这些点，这个软件就能标识在各个和每+秦网元素上的克隆。这个软件还能对局 部本底变化、照明不均和其它误差源进行修正。
有了这些已定位和进行过本底修正的格网元素，系统就从所有的 元素读取数据。格网中的每个目的基因都被定量化并被输入这个格网 的数据库.利用这些数据，就可以使用客观的统计方法来识别正命中 点。例如，我们能够比较所有格网元素的强度，并选取那些与全平均
信号的差别大于10倍标准偏差单位的信号。统计方法的使用确保用
客观标准将所有的正命中点，甚至那些不能被视觉分辨的正命中点识 别出来。
最后，这个软件提供方便的图形输出，以易于理解的方式显示结 果，同时还提供全部数字数据，可以将它们输出到你的数据处理软件 去。
基因表达研究
基因表达研究的目的是找出那些在两种或两种以上条件下其表 达有所差异的基因。例如，我们可以对比这样两种情况下的基因表
达 一种是对照细胞中的基因，它们来自于有病的细胞系；另一种是 暴露在药剂之下的同种细胞中的基因。传统的评估基因表达的方法是 基于对分立的基因在RNA水平上按次序地分析或者一次进行少量的 分析。与此相对照，使用高密集度格网允许同时研究上千种基因的 表达。基因表达研究与库筛选的主要区别在于我们不是寻找几个识别 与特定的已知排序杂交的命中点，而是评估大量基因被表达的程度。 基因表达是用复杂的探针混合体与cDNA库的杂交来研究的。库 被复制布点，以产生两套或更多的同样的高密集度格网。在研究中 不同的探针由各种条件下分离出的RNA分别衍生出来。各RNA样本实 际上都是许多mRNA分子的复杂混合体，这些分子对应于不同基因的 产物。在这个复杂混合体中起作用的mRNA分子的数量反映了分立基 因的表达水平。表达水平越高，混合体中的分子越多。放射性的或生物素基的核酸参与(利用用反转转录酶)产生复杂 探针的过程。杂交后特殊基因的活性正比于在高密集度格网的各斑点 上检测到的信号。
与只有少数斑点杂交的库筛选不同，在基因表达研究中大多数斑
点都与RNAs的混合体杂交。所以识别所有格网斑点的位置并不困 难。成象系统利用实际斑点矩阵的信息来排列取样格网。基因表达 研究中的真正问题在于数据量之巨大。多个膜上的高密集度格网可能 包含几万个斑点，各斑点的表达值都必须被保留。图象分析软件要设 计成能够处理如此大量的数据集，并且能够对不同条件下的各数据集 进行比较，这一点非常重要。我们的软件就具备了这些能力。
比较不同条件下的表达并非一个微不足道的问题。各个格网的信 号的绝对强度都与众不同，所以我们不能简单地做跨样品的信号强度 比较。我们的软件提供了很多使无关的跨膜变化最小化的方法。例 如，我们可以在各格网内定义内部标准(一个特殊的基因，或者所有 基因的平均表达水平)。在将强度值对内部标准归一化之后，就可以
对强度值进行跨格网的比较了 。另 一个办法是比较两种条件下的差 值，用差值的分布来确定命中点。差值的分布不受膜之间差异的影 响，而且还有一些其它的有益的统计特性。利用这些方法以及包含在 我们软件中的其它方法，我们就能执行不同类型的必然因果关系数据 分析来得到比较基因表达的最佳方法。
大型基因表达研究的结果构成一个巨大的数据集。因此排列并处 理这个数据集的数据管理功能非常重要。我们的单元显示功能创建可 以被直接输入你的公司数据结构的矩阵。
2.高密度格网软件的细节
分段
在分析高密度格网之前必须完成三个主要任务1. 识别各格网元素(我们将称其为目的基因)以便了解它在矩 阵中的位置。这种识别必须考虑到格网创建中的某些变易。
2. 量化各目的基因的密度(反映杂交强度)。这可能需要做密 度标准校正，和/或某种形式的本底修正。
3. 选取感兴趣的目的基因。 一旦量化了目的基因密度，我们就 能记录各个和每个目标，从而分析不同样品的基因表达。或者我们 可以从这个大阵列中仅仅选取有限数量的感兴趣的目的基因(常 常叫做命中点).
分析的第一步总是目的基因识别。从本底中辨别目的基因的过程 被称为分段。
人工分段
最简单的分段形式是圏定各个目的基因， 一次一个。方法是用鼠 标将圆圏放到各个目的基因上。击鼠标的键，就会显示出目的基因的 强度和位置。
在典型的库筛选中，在大范围的清晰的衬底上有少量明显可见的 点指明了命中点。点击这些明显的点(以产生它们的位置码)好象是 一种可接受的检测方法。可是，即使命中点是清晰可见的，人工分段 也是不可行的。问题在于将这些命中点分配到格网中合适的位置的过 程。将任何点分配到格网中合适的位置首先涉及到这些点的检测和排 列。当然，你可以手工点击所有这些点，但这将非常费时间。想象一 下尝试圈定1000个目的基因，再考虑许多实验室希望在不远的将来 达到100, 000个目的基因。
自动分段
自动分段无需人工指导来发现目的基因。你的自动分段系统的质 量决定了它的成功与否。如果正确地实施了自动分段，它就能提供一 个识别和分析千万个目的基因的迅速和方便的方式。如果实施得不正确，自动分段会产生许多伪正点和伪负点，这就需要再加上后扫描编 辑.最坏的情况下，差的自动分段会产生错误的數拔.
自动分段的标准方法是给目的基因指定一个特定的密度范围.这 个过程叫做阈处理.处于这个密度范围内的象素被归为目的基因.处 于这个范围之外的的象素被归为本底.
如果目的基因是不同大小和不同形状的，并且/或在困象中不占 固定的位置，则一个简单的密度阈是最好的选择.例如一个用同位素
粒)就会出现在困象中的任何位置上.我们可以对这个图象进行处理
使得这些颗粒可见度最高，设置一个密度阙值(例如50灰度级)， 然后检测比这个阁值更暗的象素颗粒.
与此对照，用格网，目的基因被固定大小并被规则排列(困U).
我们能够利用这种规则排列的优点来使分段更加精确和有效.实际 上，单一的密度阈值在格网图象中是不够的.变化的局部本底(如左 上部和右下部的密度不同)和规定辨别目的基因的强度水平方面的不 确定性会使其失效.我们的经验是在大多数格网分析的形式下，密度 阈处理是高度主观和棘手的任务.
困11: ^V孕乂？rf々^^^^^谬^^"^厍，2^尹"^W^
^^#,^《义</、^/攻赵.i多尹《《 ^^《放疾逸4'糸见
4,抓
用固定的取样探针分段
所幸的是格网能被十分客观和比无规目的基因更有效地分析.我 们知道目的基因的间距、数量和直径，因此不需要以密度作为目的基 因识别的唯一工具.AIS/MCID使用固定取样探针的方法代之.
使用固定取样探针时，格网定义决定分段处理.固定的取样探针 被(自动)放置在格网的各个位置上.这样做的困难在于实际的样品 很少是完全等间距的.我们将发现布点机器人迷路、复制偏离或一些 其它的因素导致格网的变化.因此用固定取样探针方法分段需要分为两步.首先，用格网定义的点的位置来复制格网，然后系统用一些相
当复杂的算法对实际目的基因进行自动格网排列(图12).
图12: —^逸^/X^^义/^e戚^^來4V7;sf岸丄遂W《 i遂W多《J 云7在f炎政2
比起用扫描来找出超过密度阈值的目的基因的方法，使用固定取
样探针方法有几个优点
1. 我们检测每个目的基因并将其定责化，包括所含数据在 本底水平或近本底水平的那些基因.
2. 对每个目的基因的检测允许我们使用客观的统计程序 (代替主观的密度阈)来定义命中点.
3.我们能在任意数量的实验条件下跟踪给定的目"基因， 包括那些没有明显活化目的基因的实验条件.这在基因表达研 究中是十分重要的。
构造和排列格网
格网是用键盘上输入的间隔参数(点与点之间的距离和组与组之 间的距离)来构造的。以规定的间隔定出格网的原形，并从这个原形 出发形成整个格网.
精细排列
某些格网取样探针很可能没有准确地放在分配给它的位置上，要
解决这个问题，可以实行自动排列.在这个过程中，模糊逻辑算法将
各分立格网元素放置在最符合实际图象数据的位置上.如果需要进一
歩排列，可以用鼠标把任何格网元素或元素组拉到位。 丝
不是所有的样品都有可以用来做精细排列的可见的点，在库筛选 中， 一般是在相当大的格网上只有少数几个可见点。在这种情况下， 精细排列算法缺乏足够的数据而无法工作，除非在格网上加上已知的参考点。这些被称为"锚"的参考点包括一个可见的目的基因，并被
用来指导自动排列.例如，我们的布点机器人创建一个舍6144个分 立点的格网，我们可以在四个角和其它更有意义的位置的点上放进易 于检测的数量的标记。当我们创建格网时，AIS/MCID将用这些锚作 为参考点来实施自动排列，
详尽模式和筛选模式
详尽模式-基因表达
详尽模式获取格网中各个和每个目的基因、的值，详尽模式给出目 的基因的完全描述，并允许直接在多至四个格网之间做比较.可是， 数据表里常包含成千上万个数字，这会降低你的系统的速度。 一般地 说，对于几个各有5000点的阵列还没有什么问题.但是管理非常多 的点(例如30，000或更多)就会限制容许能力.扫描格网不是主要 问题，而仅仅核算一个舍有50， 000个数字的数据表就要花费一些时 间。如果数据管理证明速度太慢，考虑改用筛选模式.
详尽模式在基因表达研究中和杂交筛选的某些情形中是最有用 的。这两种应用都不仅仅涉及简单辨别明显的命中点和本底。因此， 了解格网的每个点的反应如何是十分有用的。
库筛选模式
库筛选模式一次分析一个格网，并只显示这个格网中的命中点。 当只有小比例的格网元素包舍标记时，采用用库筛选模式从大量库藏 中筛选未知的基因，
筛选使用与详尽模式类似的逻辑结构，即要在统计分段之前扫描 并量化所有的数据.不同之处在于我们想要从相对干净的样品中辨别 出少数几个标记过的命中点.不需要记录那些未标记的格网位置，因 为它们只会减慢系统的响应。在筛选分段之后，未被选中的就被丟掉了，只有命中点被保留下 来。由于数据表中只显示命中点，数据管理就快得多了.
详尽模式和筛选模式小结
详尽模式和筛选模式的不同在于格网被量化之后发生的事情.详 尽模式记录每个目的基因的值，以便你能进行必然因果关系的数据分 析。与此相对照，库筛选模式只记录有效命中点。它在目的基因的分
布中设置一个截断点(比如高于平均值5倍的标准偏差)以选择有限 数量的命中点供进 一步注意。只有超过截断点的那些目的基因才显
示在数据表中。
选择感兴趣的目的基因统计分段
在详尽棋式和筛选模式中，初始的分段步脒都使用固定取样探针 和自动排列以从格网中各个和每个目的基因产生数据.一旦目的基因 被分了段，并对它们的密度或体积进行了量化，就会使用不同程序来 选择感兴趣的目的基因.
我们用统计分段这个术语来描绘这个过程，在这个过程中，我们 从全一点中选择有限数量的命中点(筛选模式)，或从一个样品到另 一个样品跟踪基因表达中最重要的差别(详尽棋式).我们可以将统 计分段定义为统计推理在目的基因的自动界定上的应用.
筛选
考虑这样一个实验我们用探针从三个细胞林中筛选一个cDNA 库.这些库被点到三个识别腹上(20￡探针/膜)，每个膜是一个细 胞株.在杂交过程之后，我们检查三个腹上的射线自显影，并断定所 有的细胞林都显示出与库中的两个克隆强的杂文.但是，笫三个细胞 抹(C林)还显示出与另外一个克隆的杂交(强度稍弱)(困13). 这可能是C林与另两林不同，但我们如何得知呢？
围13:,豕#^(三々^^^一#^ c"W^.摩i;^45^诈卓 4滞,^發^Jt,浙谢#^^^7^^—,^發《^克r^^T逸^ f乂一^S^ 4V7;Tr^"农2,^^,二,^發W^^逆可能影响我们关于第三个克隆的判断的几个因素
1. 第三个克隆可能与C株剧烈地杂交，但与A林和B株较弱地杂交。
2. 第三个克隆专门与C林杂交，但杂交信号弱.
3.制备中可能包舍一些模糊点，它们使得对第三个克隆的翻 译复杂化了。
在上迷情况下，我们可能没有一个非黑即白的判定，而是做出要 对笫三个克隆加以注意的决定。这个信号强度是否足以作为命中点？ 简单地设置一个"看起来不错"的密度阈是相当武断的，
为了帮助你做出客观的决定，系统找出并计算出所有目的基因的 强度，数据中包括那些只有本底强度的目的基因、那些比本底稍高但 仍很弱的目的基因以及那些具有足以被肉眼所见的更强烈的探针-克隆相互作用的目的基因.
一旦我们有了完备的数据集，我们就能用基于方差统计的程序来 判别各个观察到的强度是命中点的几率，基于方差的判别与简单的仅 仅在密度的基础上检测命中点的阈值判别不同，它将各个目的基因的 密度与所有目的基因的分布特性相比较.命中点是那些最与众不同的
目的基因。这样做的逻辑是与其它目的基因非常不同的目的基因可 能是应该研究的。这种基于方差的阈值的方案是非常有效的(运用统 计学)和易于实施的。
详尽模式和基因表达
统计分段在示踪基因表达时很有用，在这些研究中，我们通常跨 多个格网比较给定克隆探针的反应强度，那些被实验操作(例如使用
潜在的药品化合物)增强或抑制的反应是感兴趣的反应，用统计分段 分析这种研究方案的步骤如下1. 测量所有目的基因的密度，跨若干样品来量化基因的表达 水平，各个样品对应不同的实验条件，
2. 计算出每对目的基因的差值记录.现在我们有了在各种实 验条件下各目标克隆的差值分布，
3. 计算差值记录分布的平均值和SD (标准偏差)。
4. 统计分段阶段，选择差值记录高于或低于平均值几倍SD 单位的目的基因，这些目的基因可以被归为命中点.作为基于 方差的判别，这个命中点的选择过程在总体密度上是与格网之 间的差异无关的。
5. 以一种叫做元素显示(见下文)的形式显示目的基因。
小结
统计分段是统计推理在格网数据分析上的应用。它的优点在于为 判别目的基因提供了客观的标准，并且它允许我们对数据进行跨样品 的比较。之所以有后一个优点是因为基于方差的分析使无关因素(如 影印效果、曝光时间)的影响减至最小。
总的来说，统计分段是从大量数据中提取有效命中点的 一种客观 的程序。统计分段的中央优点是
a) 我们能有据地提出用来分辨命中点的标准；
b) 我们能使外部处理变量的效应最小化，以简化跨格网的比较。
快速数据通讯元素显示
格网分析会产生大量的数据点。这些数据可以用你认为合适的任 何方式来描迷，例如，向Excel输出数据矩阵，按照杂交强度排列，
并用排列好的数据表来传达你的结果，
另一个选择是创建元素显示.这是一种图形图象，它用不同方式 标记有限数量的感兴趣的目的基因.例如，在筛选研究中，命令元素显示去标记密度高于点密度平均值六倍SD单位以上的点，元素显示 将你的注意从常规过程的上千个点引向最相关的数据点(图4),
当然，对一个干净的膜和一个二进制标记(通或断)，可能不需 要元素显示.我们可以只看原始困象来了解哪个点是命中点，可是当 样品不干净，或存在标记强度梯度时，元素显示就变得非常有用了， 在这些情况下，肉眼趋向于不确定，让计算机以颜色代码和易懂的方 式来显示命中点就较容易.
元素显示在详尽模式跨两个或更多的样品做比较时特别有用 格 网和格网之间的平均目的基因强度、本底水平和其它因素都趋于不 同，因此，要跨样品对特殊格网格点的相对强度做出视觉判断是非常 困难的。与此对照，因素显示清晰地显示出格网之间的变化。任何统 计分段的输出都可以用单幅元素显示概括出来(图5 ).
本底偏差的影响
任何形式的分段都会受本底的影响.理想地，本底水平低，而且 为常数.低本底改善灵敏度。常数本底简化目的基因检测.不幸的是， 几乎没有低的和常数的本底.因此AIS/MCID提供了本底变化的修 正.
无#~正 无本底#~正 选点 指定特定的点(如各序列的左上部位)来
抑制本底。
围绕象素 系统查看各点的外边界，并从这些围绕象
素计算这个点的本底。 用户选棒 你定义一个或多个用来做本底修正的样
品区
图象处理 一些图象处理功能，当图象中点与点之间
本底不同时能有效除去本底. 上迷所有的修正方法都存在各自的弱点*最好的选则是将原始样 品的本底最小化.小结髙密集度格网研究方案
1. 快速自动大格网分析
在一个格网上可以放置任意数量的目的基因.可以用任何媒体做 格网矩阵(如膜、凝胶、微滴定板)。
2. 自动铺展、排列和本底修正
格网被按照用户输入的间隔建立(铺展)起来。格网铺展开后，
自动排列成图象中最佳数据位置并消除本底.
3. 详尽和篩选模式
每次扫描都读取所有的格网无素。但是我们可以选择保留并显示 所有的数据，或仅仅保留和显示那些被定为命中点的数据.保留所有 的数据允许做非常广泛的必然因果分析，而只保留命中点可以节省时 间.
4. 统计分离
命中点是由它们在所有格网元素的分布中所处的位置来自动确 定的。这个程序是客观并易于证明的。
5. 跨样品比较目的基因
统计分离使处理因素的影响最小化，并允许进行跨样品比较.例 如，我们可以在各包含5, 000个点状斑的一个对照膜和三个实验膜之 间比较杂交强度的增减。
6. 元素显示
这些简化图形显示能显示被减少为少量彩色代码的命中点的一 个或多个点阵。
权利要求
1. 一种用于化验的成像方法，包括维持试样在一个多样品板上作为样品，其中至少一个第一样品在一个井中；将该板定位在远心透镜下适于成像所述多样品板的位置；将由所述远心透镜的外部照明系统产生的光向所述多样品板传送；利用上述远心透镜从该第一样品采集光；将所采集的光通过所述远心透镜传送到一个图像检测装置；以及从该图像检测装置的输出生成所述多样品板的一个图像。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像检测装置是一个CCD照相机。
3. 如权利要求2所述的方法，其中在所述板上的所有样品都包 含在井中，并且所述的电子透镜用于从所有的样品中采集光。
4. 如权利要求l所述的方法，其中在所迷板上的所有样品都包 含在井中，并且所迷的电子透镜用于从所有的样品中采集光。
全文摘要
本发明披露了一种电子成像系统，用于评定矩阵中的比色的荧光或亮度信号的强度，所述矩阵由井，微井，在膜上、凝胶上或其它样品上的杂交斑点。该系统包括非常灵敏的面积CCD检测器(18)，具有外部照明(44)的高速远心透镜(22)，反射/透射照明系统，照明波长选择装置(34)，和光密封分室(24)。使用计算机和图像分析软件控制硬件，校正和校准图像，并检测和量化图像内的靶。
文档编号G02B13/14GK101419170SQ200810130469
公开日2009年4月29日 申请日期1997年8月12日 优先权日1996年8月16日
发明者刚 孙, 彼得·拉姆, 罗尔夫·米勒, 肯尼思·R·卡斯尔, 蒂莫西·奥姆斯比 申请人:Ge保健尼亚加拉公司