显微镜装置以及使用该显微镜装置的荧光观察方法

专利名称：显微镜装置以及使用该显微镜装置的荧光观察方法
技术领域：
本发明涉及一种在生物体组织等的荧光观察等中使用的显微镜装置以及使用了该显微镜装置的被观察物的荧光观察方法。
背景技术：
在分子生物学领域等中，对生物体组织和细胞内离子、分子等的观察是必须的技术。光学显微镜主要用于观察生物体组织。另外，激光共聚焦显微镜用于用光照射生物体细胞的一部分并使其照射位置移动来观察细胞的一部分。作为光学显微镜的主要观察技术之一，有如下一种荧光观察法对生物体组织的细胞内的离子、分子附加荧光色素，对该荧光色素照射激励光，观察被激励的荧光色素所发出的荧光。荧光和激励光的波长是不同的。因而，能够通过对荧光进行分析来检测细胞内分子、测量浓度。因此，荧光观察具有以下优点。(i)离子、分子的大小也能够观察。(ii)能够仅观察特定的离子、分子。(iii)荧光的亮度与离子、分子浓度相应地发生变化，因此能够测量它们的浓度。然而，一般来说荧光观察也具有以下缺点。(i)在激励光的波长处于紫外波段的情况下，激励光对于细胞来说是有毒的。(ii)当持续射出激励光时荧光色素会褪色。褪色是指荧光的强度变弱。当使用能够进行荧光观察的荧光显微镜来观察移动的细胞时，细胞有时会跑出显微镜的视野外而使观察中断。作为这种问题的解决方法，⑴降低物镜的倍率来扩展视野，⑵以机械或化学的方式抑制细胞的移动，( 移动载物台来使细胞的位置处于视野的中心。但是，(1)的方法使空间分辨率降低，O)的方法有可能对细胞产生不良影响。针对上述(3)的解决方法，在专利文献1和专利文献2中公开了一种为了对微小的观察物进行观察而具备对被观察物进行追踪的机构的光学显微镜。这些光学显微镜能够使用透射光来控制细胞位置和观察区域并进行透射光记录。在专利文献3 5中，公开了一种能够使用荧光来控制细胞位置和观察区域并进行荧光记录的荧光显微镜。在非专利文献1 5中，报告了一种将移动的草履虫作为比较大的被观察物固定在视野内来进行观察的方法。作为能够在培养液中自由移动的细胞中的在医学和生物学领域受重视的细胞，可以举出具有能够保护人体免受细菌、病毒伤害的功能的免疫细胞(参照非专利文献6)。与免疫功能有关的细胞内分子大量存在，而为了检测这些分子、测量分子浓度的时间变化，必须使用荧光观察。在免疫细胞中，不怎么附着于载玻片表面而进行浮游的细胞被分类为浮游细胞。皿中的浮游细胞的位置是根据培养液的对流、重力、皿的壁部和底部、水面以及细胞之间的相互作用等而始终改变的。为了观察浮游细胞，也考虑了例如使用非专利文献1中报告的奥先生等人的手法来追踪一个细胞的方法。专利文献1 日本特开平5-80255号公报专利文献2 日本特开平7-2535487号公报专利文献3 日本特开平7461097号公报专利文献4 日本特开2005-214924号公报专利文献5 日本特开2006-292420号公报专利文献6 :W02003/102636号公报非专禾丨J 文献 1 :H. Oku, N. Ogawa, Ishikawa, K. Hashimoto, "Two-dimensional tracking of a motile micro-organism allowing high-resolution observation with various imaging techniques", Review of Scientific Instruments, Vol. 76, No.3,20052 :H. Oku, M. Ishikawa, Theodorus, and K. Hashimoto, "High-speed autofocusing of a cell using diffraction patterns，，,Optics Express, Vol. 14,No. 9, pp.3952-3960,2006非专利文献3 :奥寛雅，石井抱，石川正俊7 4夕π匕‘夕二 7 > 7 ^ — K A ,夕 v^r A，電子情報通信学会誌 D-II，Vol. J84-D-II, No. 6，pp. 994-1002，2001非专利文献4 奥寛雅，石川正俊力口、> 7才一夕·■一 T応答可能&高速匕‘夕3 、巧,用可変焦点 > X O 構造，光学，Vol. 31，No. 10，pp. 758-764,2002非专利文献5 橋本浩一微生物f用0 t 7夕歹^义七> * >夕‘，SORST ” 3 ^ >卜* >水。”勺Λ (6)講演要旨集，pp. 23-26,2007年1月30日非专利文献6 :D. Μ. r ^ ' ^ 会話t ^免疫細胞，日経寸^工> 7，pp. 52-60， 2006年5月号非专利文献7 谷村保明白血球分類O自動化，MEDICAL IMAGING TECHNOLOGY, Vol. 14，No. 1，pp. 14-22，199
发明内容
发明要解决的问题现在，荧光观察参数都是由观察者根据主观经验而决定的。即，并非按照客观的评价来决定该荧光观察参数，而这就是现状。在这种情况下，即使细胞的位置、分布、种类等发生变化，观察者也很难随机应变地调整荧光观察参数。在观察者想要观察大量的细胞而过度扩大激励光的照射范围、照射时间的情况下，会对细胞和荧光色素造成不必要的不良影响。另外，获取到的荧光图像数据的量较大， 分析会花费较多时间。在以往的荧光显微镜中，也通过自动控制激励光的种类、强度来连续地观察细胞内的多个离子、分子的活化状态，并将一次实验中发生的细胞内的多个离子、分子的相互作用汇总来进行可视化。然而，该自动控制是按照预先决定的时序表而进行的，或者是与从荧光图像中得到的细胞信息相结合地进行的。在仅将荧光图像使用于控制的情况下，由于荧光的光强度较弱，因此用于得到控制用的图像的曝光时间变长。即，控制所耗费的时间变长。因此，当细胞移动的最大速度较快时，控制未能有效地起作用的情况变多。这种控制法的主要目的在于对长时间观察原本不移动的细胞时所产生的偏差进行校正。本发明鉴于上述问题，目的在于提供一种显微镜装置以及使用了该显微镜装置的被观察物的荧光观察方法，能够通过将来自被观察物的透射光等使用于控制中，从而在荧光观察时自动控制被观察物的位置、观察区域等。为了达到上述目的，本发明的显微镜装置的特征在于，具备载物台，其载置被观察物；第一光源，其对上述被观察物照射照明光；第二光源，其对上述被观察物照射用于激励荧光的激励光；图像信息检测部，其检测通过上述照明光而得到的被观察物的图像信息； 荧光图像信息检测部，其通过被观察物因激励光而产生的荧光来检测荧光图像信息；以及控制部，其根据上述被观察物的运动模型和从上述图像信息检测部输入的上述被观察物的图像信息来决定上述被观察物的荧光观察区域，在上述荧光观察区域内每隔规定的间隔获取从上述图像信息检测部输入的上述被观察物的图像信息和从上述荧光图像信息检测部输入的荧光图像信息。运动模型是指着眼于被观察物所具有的物理特性或化学特性中的特定维度或特定维度的组合、或者特定维度的权重组合、以预测被观察物在该维度上的时间空间变化为目的的模型。例如，是指表示被观察物的位置、速度、分布、种类、形状、离子浓度、分子浓度中的任一个或它们的组合的时间空间变化的数理模型。在上述结构中，控制部优选按照PID控制等古典控制、最优控制、准最优控制等现代控制、H⑴控制、采样值控制、有限时间整定控制、适应控制等主现代控制理论、神经网络控制、模糊控制、遗传算法控制等智能控制来决定荧光观察区域。PID控制是指按照一种根据与偏差成比例的项、偏差的积分项、以及偏差的微分项中的任一个或它们的组合进行表达的控制规则来进行目标值与输出值的偏差的最小化的控制方法。最优控制是指制作表示荧光观察的效率的评价函数、通过将该评价函数局部最小化或最大化来导出局部最优的控制规则的控制方法。控制部优选按照被观察物的运动模型来决定荧光观察区域的中心位置。控制部优选具备用于控制第一光源的第一光源控制部和用于控制第二光源的第二光源控制部。载物台优选使被观察物的位置移动的三维载物台。荧光图像信息检测部优选具备波长选择单元，该波长选择单元分离出至少一个以上的波长的荧光。优选具备第一针孔和第二针孔，该第一针孔配置于第二光源与被观察物之间，该第二针孔配置于荧光与荧光图像信息检测部之间。优选具备针孔驱动部，该针孔驱动部使第一针孔或第二针孔移动和/或旋转。优选具备配置于第一光源与被观察物之间的物镜以及物镜的驱动部。优选具备配置于在被观察物处产生的光与图像信息检测部之间的成像透镜以及成像透镜的驱动部。优选具备配置于荧光与荧光图像信息检测部之间的成像透镜以及成像透镜的驱动部。优选具备环境控制部，该环境控制部容纳被观察物且充满环境气体。环境控制部控制环境气体的种类、环境气体的温度。作为环境气体，能够利用氮气(单体)、氧气(单
6体)、二氧化碳(单体)、空气(混合物)、以及它们的混合气体。环境控制部优选具备能够容纳多个被观察物的容纳部。优选具备被观察物刺激单元，其刺激被观察物。作为施加给被观察物的刺激，例如能够利用电刺激、磁刺激、力学刺激、超声波刺激、温度刺激、化学刺激、光刺激等。作为被观察物刺激单元，例如为了对被观察物施加电刺激和磁刺激，能够利用包括电极、电流、电池、电阻、电容器、磁体、线圈、超导体、理想导体、电导体、半导体、绝缘体、电解质、压电体、 焦电体、强电解质、离子传导体等的电刺激控制装置。例如为了对被观察物施加力学刺激， 能够利用包括短针、探针、致动器、压电体、离心机、配重、弹簧等的力学刺激控制装置。或者，为了对被观察物施加超声波刺激，能够利用电致伸缩振动器、磁致伸缩振动器等超声波刺激控制装置。或者，例如为了对被观察物施加温度刺激，能够利用包括加热器、制冷器、热导体、温度计、热像仪等的温度刺激控制装置。并且，例如为了对被观察物施加化学刺激， 能够利用包括使化学物质的浓度或状态发生时间空间变化的吸移管、泵、注射器、推进器 (Propeller)、螺杆、微流体设备的化学刺激控制装置。例如为了对被观察物施加光刺激，能够利用反射镜、棱镜、滤光器、灯、激光、微波激射器等光刺激控制装置。当然，这些刺激控制装置以及其部件是互补的。例如，光刺激控制装置能够通过对笼状化合物(Caged Compounds)照射光以将其分解，来使细胞内外的化学物质的浓度或状态发生时间空间变化，从而也能够成为化学刺激控制装置。另外，光刺激控制装置能够利用光来加热测量液，从而也能够成为温度刺激控制装置。为了达到上述目的，本发明的荧光观察方法包括以下步骤第一步骤，根据被观察物的图像信息和被观察物的运动模型来决定被观察物的荧光观察区域；以及第二步骤，在荧光观察区域内的规定位置获取荧光图像信息。在上述结构中，优选按照PID控制等古典控制、最优控制、准最优控制等现代控制、H c 控制、采样值控制、有限时间整定控制、适应控制等主现代控制理论、神经网络控制、 模糊控制、遗传算法控制等智能控制来决定第一步骤的荧光观察区域。在第一步骤与第二步骤之间，优选根据被观察物的图像信息和被观察物的运动模型中的至少一个来决定荧光观察区域的中心位置。在第二步骤中，优选获取被观察物的图像信息。优选在荧光观察区域内的每个规定位置重复进行规定次数的各步骤。运动模型的参数优选包括被观察物的位置、速度、分布、种类、形状、离子浓度、分子浓度中的任一个或它们的组合。发明的效果根据本发明的显微镜装置，根据来自被观察物的图像信息和被观察物的运动模型来决定荧光观察区域，因此能够自动进行荧光观察。根据使用了本发明的显微镜装置的荧光观察方法，为了根据被观察物的运动模型导出评价函数和自动控制规则而使用被观察物的位置、分布、种类、状态、离子浓度、分子浓度等作为反馈信息，由此针对被观察物的动态变化也能够随机应变且自动地调整荧光观察参数。


图1是表示本发明的第一实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。
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图2是表示荧光观察区域的模型的图。图3是表示使用了上述第一实施方式所涉及的显微镜装置的荧光观察过程的流程图。图4是表示第二实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。图5是表示第三实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。图6是表示第四实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。图7是表示第五实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。图8是表示第六实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。图9是表示第七实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。图10是表示第八实施方式所涉及的显微镜装置的结构的示意图。图11是表示环境控制部的结构的示意图，(A)是平面图，(B)是沿(A)的X-X的截面图。图12是表示能够观察多个被观察物的环境控制部的另外的结构的示意图，(A)是平面图，⑶是沿㈧的X-X的截面图。图13是表示观察开始之后的细胞分布的一例的图。图14是对荧光观察过程中使用了控制量U (k)的实施例的评价函数J和将荧光观察区域宽度固定的情况下的比较例的评价函数J进行比较的示意图。附图标记说明1、30、35、40、45、50、55、60 显微镜装置；2 被观察物；3 :XY 或 XYZ 载物台；4 照明用光源；5 激励用光源；5Α 激励光；6 物镜；7 成像透镜(透射光用)；8、9 滤波器； 10U0A 光学系统；12 成像透镜(荧光用)；15 镜筒部；16 图像信息检测部；17 荧光图像信息检测部；18、19 第一以及第二分束器(分色镜)；20 控制部；21 个人计算机；22 显示装置；23 激励用光源控制部；25 荧光波长选择部；26 第三分色镜；27 反射镜；28 棱镜；29 透镜；32 物镜用驱动部；37 透射光的成像透镜用驱动部；52 荧光用成像透镜用驱动部；53 第一针孔；54 第二针孔；56,58 针孔驱动部；60,80 环境控制部；62 主体部；64,84 容纳部；65 树脂板；66 载玻片；67 树脂膜；67Α 细孔；68 气体配管；68Α 输入侧；68Β 输出侧；69 环境气体；70 保持部件；71,72 玻璃盖片；74 培养液；85 障壁部；86 容纳分区；F 荧光；T 透射光。
具体实施例方式下面，参照附图来详细说明本发明的实施方式。在各图中，对同一或对应的部件使用同一附图标记。(第一实施方式)图1是表示本发明的第一实施方式所涉及的显微镜装置1的结构的示意图。第一实施方式所涉及的显微镜装置1具备载物台3，其载置被观察物2，能够使被观察物2的位置自由移动；光学系统10 ；以及控制部20，其控制载物台3的位置等。光学系统10具有照明用光源4，其对被观察物2照射照明光以检测被观察物2的像、位置；激励用光源5，其照射用于激发出从被观察物2产生的荧光的激励光；镜筒部15， 其配置有用于形成以下光路的光学部件，该光路为照射照明用光源4的光而从被观察物2
8得到透过光T的光路、将激励光5A导向被观察物2的光路以及由被观察物2产生的荧光F 的光路；图像信息检测部16，其检测从镜筒部15射出的来自被观察物2的透射光所形成的图像信息；以及荧光图像信息检测部17，其检测从镜筒部15射出的被观察物2的荧光图像信息。被观察物2例如可以是作为生物试样的细胞等。载物台3上载置被观察物2，通过后述的控制部20来控制被观察物2的位置。该载物台3是所谓的电动载物台，可以是在载置被观察物2的二维平面(X-Y平面)上进行驱动控制的XY载物台，或者也可以是在三维上进行驱动控制的XYZ载物台。三维的驱动也可以由机械手(Manipulator)来进行(参照非专利文献3)。在此，也可以通过控制照明用光源4、激励用光源5的照射位置、后述的针孔所配置的位置来进行观察区域的XY轴方向上位置控制。也可以通过控制后述的物镜、成像透镜、针孔所配置的位置来进行观察区域的ζ轴方向上的位置控制(参照专利文献6、非专利文献2、4)。在照明用光源4是透射光用的光源的情况下，照明用光源4只要是发出包含可由被观察物2吸收的波长或反射的波长的光的光源即可。作为这种照明用光源4，能够使用卤素灯等各种灯、发光二极管、各种激光。为了避免透射光T与激励光5A、荧光F相干扰， 优选利用光学滤波器8等从照明用光源输出的光中滤除与激励光5A、荧光F相同的波长频带。从照明用光源4照射到被观察物2的照明光成为来自被观察物2的透射光T或反射光而被图像信息检测部16所检测。来自被观察物2的图像是所谓的明场像、暗场像等的图像 fn息ο激励用光源5只要是能够激励被观察物2本身或被观察物2所含有的荧光体的光源即可。作为这种激励用光源5，能够将氙气灯、汞灯等灯、氩激光等各种激光作为激励光 5A。为了使激励光5A不与透射光T、荧光F相干扰，优选通过光学滤波器9等滤除不需要的波长频带。也可以通过未图示的光投射管将激励用光源5导入到被观察物2。镜筒部15构成为包括由第一以及第二分束器18、19、物镜6以及成像透镜7构成的光学部件，以形成使因照明用光源4的光而在被观察物2处产生的光、激励光5A以及荧光F通过的光路。在图示的情况下，示出了倒立型的显微镜装置的一例。在此，因照明用光源4的光而在被观察物2处产生的光也可以不是透射光T而是反射光。第一以及第二分束器18、19也可以配置在镜筒部15中设置的未图示的端口上。分束器18、19能够使用可使照明用光源4的波长与从被观察物2产生的荧光F的波长相分离的分色镜等。在下面的说明中，将分束器18、19作为分色镜来进行说明。第一分色镜18具有反射短波长的光且透射长波长的光的作用，因此激励光5A反射而入射到纸面上方的被观察物2。另一方面，通过利用波长比激励光5A的波长长的光，来自被观察物2的透射光T透过第一分色镜18。第二分色镜19配置于第一分色镜18的下方。透过第一分色镜18的来自被观察物2的透射光T通过第二分色镜19和成像透镜7，从而从镜筒部15射出到图像信息检测部 16。也可以通过事先在成像透镜7与图像信息检测部16之间配置未图示的滤波器，来使透射光T不与激励光5A、荧光F相干扰地入射到图像信息检测部16。透过第一分色镜18的来自被观察物2的荧光F被第二分色镜19反射并通过成像透镜12，之后射出到荧光图像信息检测部17。也可以通过事先在成像透镜12与荧光图像信息检测部17之间配置未图示的滤波器，来使荧光F不与激励光5A、透射光T相干扰地入射到荧光图像信息检测部17。图像信息检测部16具备能够获取基于照明用光源4的光经过被观察物2的透射光T、反射光而得到的图像信息的检测器。在透射光T的光轴上并且在紧挨着检测透射光T 的图像信息检测部16之前设置成像透镜7。检测器中能够使用摄像元件，例如CCD型摄像元件、CMOS型摄像元件。并且，也可以通过例如使用了液氮、珀耳帖元件的冷却装置来对这些摄像元件进行冷却，以提高S/N比(信噪比)并减少噪声。检测器也可以具备进行图像处理的计算机。另外，也可以具备目镜以用于目视观察。荧光图像信息检测部17具备能够获取来自被观察物2的荧光图像的检测器。该检测器能够根据目的而使用银盐相机、摄像元件。作为摄像元件，与图像信息检测部16同样地，能够使用CXD型摄像元件、CMOS型摄像元件。并且，也可以通过使用了液氮、珀耳帖元件的冷却装置来对这些摄像元件进行冷却，以提高S/N比(信噪比)并减少噪声。也可以在荧光F的光路上并且紧挨着检测荧光F的荧光图像信息检测部17之前设置成像透镜 12。另外，也可以具备目镜以用于目视观察。图像信息检测部16用的成像透镜7与荧光图像信息检测部17用的成像透镜12 也可以是不同的透镜。例如，也可以降低图像信息检测部16用的成像透镜7的倍率，同时提高荧光图像信息检测部17用的成像透镜12的倍率。在这种情况下，能够扩大图像信息检测部16所获取的透射光T的图像的视野，并且在荧光图像信息检测部17中能够得到被观察物2的更加扩大的荧光图像。在图1中，为了说明而将透射光T的光路、激励光5A以及荧光F的光路示为不重合，但是这些光路也可以是一致的。在图像信息检测部16与荧光图像信息检测部17之间， 有时会产生视野中心位置以及焦点位置的偏差。在这种情况下，也可以预先测量这些偏差， 将其用作被观察物2的位置控制以及观察区域控制中的偏移。通过施加偏移，能够对视野中心位置、焦点位置的偏差进行校正。通过图像信息检测部16将基于被观察物2的透射光T、反射光而得到的图像信息输入到控制部20。控制部20进行图像信息的处理以及基于图像信息的处理结果的载物台 3的控制。控制部20由电子计算机构成。作为这种电子计算机，能够使用个人计算机21。 个人计算机21具备显示被观察物2的图像等的显示器装置22。个人计算机21对图像信息检测部16以及荧光图像信息检测部17中的摄影的开始和结束、摄影速度、摄影像素数、面元(binning)数、增益、位数等进行控制。通过光学系统10将透过被观察物2的透射光T的图像信息输入到控制部20中， 控制部20利用该图像信息来控制载物台3上的被观察物2的位置。在显微镜装置1中，根据从图像信息检测部16输入的被观察物2的图像信息和被观察物2的运动模型来决定被观察物2的荧光观察区域，移动载物台3来在荧光观察区域内的每隔规定间隔的位置上获取从图像信息检测部16输入的被观察物2的图像信息和从荧光图像信息检测部17输入的荧光图像信息。在此，运动模型的参数包括被观察物2的位置、速度、分布、种类、形状、离子浓度、 分子浓度中的任一个或它们的组合。具体地说，为了进行荧光观察，控制部20进行包括如下三个步骤的控制，从而能
10够控制被观察物2的荧光信息的获取，该三个步骤为在第一步骤中，根据从图像信息检测部16输入的被观察物2的透射光的图像信息来决定被观察物2的荧光观察区域，在第二步骤中，按照被观察物2的运动模型来决定荧光观察区域的中心位置，在第三步骤中，以规定的间隔进行荧光观察区域内的荧光观察和明场观察。在此，能够按照后述的最优控制规则等智能控制来决定荧光观察区域。(位置控制算法)首先，根据第一步骤中的被观察物2的透射光的图像信息来对控制被观察物2的细胞位置的方法、即细胞位置控制算法进行说明。在图像信息检测部16中，获取被观察物2的透射光的图像，接着从图像信息中提取图像特征量。通过图像信息的二值化来在存在观察对象的区域中提取图像特征量，此时， 通过使用仅在观察对象刚才存在的区域附近进行提取的自窗口法，能够不被障碍物扰乱地仅提取观察对象(参照非专利文献1)。具体地说，基于上述的二值数据来计算0次、1次、2次矩(moments)作为透射光图像特征量。由控制部20的个人计算机21读出该图像特征量，求出被观察物2的重心和方向。也可以利用卡尔曼滤波器、粒子滤波器等来预测被观察物2的运动。接着，确定载物台3的马达旋转角的目标值，对该马达进行反馈控制，以使被观察物2的重心移动到视野中心。例如，能够使用CTZ载物台作为载物台3。在该反馈控制中， 能够使用利用比例、积分、微分中的任一个或它们的组合的控制手法。另外，为了观察被观察物2的特定部位、或者获取被观察物2的立体图像，也可以有意地确定载物台3的马达旋转角的目标值来对该马达进行反馈控制，以使偏离被观察物 2的重心的特定位置移动到视野中心。也可以使用上述自窗口法以外的方法，例如也可以从被观察物2的衍射像中提取出透射光图像特征量(参照非专利文献2)。为了重构、即再现被观察物2的轨迹，将上述CTZ载物台3的位移信息事先记录在个人计算机21中。由此能够得到被观察物2的轨迹。使用透射光T是为了以高亮度稳定地拍摄成为追踪对象的被观察物2的全部像。 除了透射光T以外，也能够使用来自应用了反射照明(印i-illumination)的被观察物2的反射光。能够使用与照明用光源4同样的光源作为反射光的光源。在这种情况下，来自被观察物2的图像是反射光图像。此外，当对被观察物2过度照射来自照明用光源4的透射光T时，有可能会提高被观察物2的温度。因此，本实施方式的控制部20能够对来自照明用光源4的光的强度、照射时间等进行调整。(荧光观察方法)接着，说明使用了本发明的显微镜装置1的荧光观察方法。将荧光试剂搭载在被观察物2上或注入被观察物2。在被观察物2是细胞的情况下，只要使用hdo-l(AM体，同仁化学研究所)这样的荧光试剂、以适度的浓度施加规定时间即可。hdo-KAM体)不发出荧光F，但是可通过微生物的细胞膜。通过细胞膜的hdo-1 (AM体)利用体内的酯酶而变化为脱AM体。即，当hdo-1 (AM 体)通过细胞膜时，变化为能够发出荧光F但是不能通过细胞膜的hdo-l。hdo-l在与Ca2+离子结合时和离解时发出不同波长的荧光F。处于结合状态和离解状态的hdo-Ι的量根据Ca2+浓度而发生变化。S卩，随着Ca2+ 浓度上升，基于结合状态的hdo-Ι的荧光F增加，相反地，基于离解状态的^ido-I的荧光 F减少。根据该特性，通过对各个波长的荧光F的强度进行比较，能够求出Ca2+浓度。具体地说，在使用后述的显微镜装置40的情况下，能够按波长分出两个波长的荧光观察像，将按每像素计算出的荧光强度比代入预先制作出的标准曲线，则可求出Ca2+浓度。不仅是Ca2+离子，通过交换显微镜装置1中的滤波器9以及分色镜18、19、26，也能够利用以其它离子、分子为对象的荧光色素。(荧光观察区域的控制算法)说明用于使用显微镜装置1来减少荧光观察张数以及增加能够进行荧光观察的细胞数的控制。作为该控制，为了进行荧光观察而进行载物台3的Z轴方向、即成像透镜7的位置的时间变化，更具体地说是荧光观察区域宽度的时间变化。作为荧光观察的顺序，最初决定进行荧光观察的区域。图2是表示荧光观察区域的模型的图。图的斜线所示的位置表示进行荧光观察的区域。对该观察区域进行等分。分割的宽度d(在此，d>0)是根据所观察的对象而决定的。接着，在观察区域的各点进行荧光观察。然后，在间隔数十秒的时间之后，重新设定观察区域，进行荧光观察。将这种观察重复T次(在此，T > 0)。—张荧光观察中照射激励光5A的时间e( > 0)与观察点的数量N(k)(在此，k > 0)相乘后得到的值eN(k)为一次荧光观察中照射激励光5A的总时间。e是可变且能够扩大的，但是在此为了简单而将其设为固定。通过下述(1)式来给出第K e {0,1,…，T-1} 次的荧光观察的区域宽度。[数1]2x(k) = N(k)d (1)当荧光观察时间从第k次的试验转变到第k+Ι次的荧光F时，将x(k)更新为 x(k+l)。导入通过下述(2)式给出的J(T)来作为荧光观察的评价函数。[数2]S[\k)-ry\k)] (2)在此，q( > 0)、r ( > 0)分别是与荧光观察所需的时间和所观察的细胞数有关的权重。y(k)是在荧光观察区域宽度&(10内进行荧光观察的细胞数。在( 式中，荧光观察张数N(k)越少，(2)式的右边部分越小，进行荧光观察的细胞数y(k)越多，(2)式的右边部分越小。另一方面，当N(k)变少时，y(k)也变少。因而问题被转换为找出使评价函数J(t)最小化的荧光观察参数N(k)的问题。根据⑴式，N(k)与x(k)存在⑴式的关系，因此下面求出x(k)的最优控制规则。利用下述(3)式来更新时刻k下的x(k)。[数3]
权利要求
1.一种显微镜装置，其特征在于，具备 载物台，其载置被观察物；第一光源，其对上述被观察物照射照明光；第二光源，其对上述被观察物照射用于激励荧光的激励光；图像信息检测部，其检测在上述被观察物处产生的基于光的图像信息；荧光图像信息检测部，其检测在上述被观察物处产生的基于荧光的荧光图像信息；以及控制部，其根据上述被观察物的运动模型和从上述图像信息检测部输入的上述被观察物的图像信息来决定上述被观察物的荧光观察区域，在上述荧光观察区域内每隔规定的间隔获取从上述图像信息检测部输入的上述被观察物的图像信息和从上述荧光图像信息检测部输入的荧光图像信息。
2.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，上述控制部按照最优控制、准最优控制等现代控制来决定上述荧光观察区域。
3.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，上述控制部按照上述被观察物的运动模型和上述被观察物的图像信息中的至少一个来决定上述荧光观察区域的中心位置。
4.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，上述控制部根据上述被观察物的运动模型和上述被观察物的图像信息中的至少一个来控制上述载物台使其对上述被观察物进行跟踪，并且控制上述被观察物的荧光信息的获取。
5.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，上述控制部通过PID控制等古典控制来控制上述载物台，该PID控制为基于上述图像信息的比例、积分、微分中的任一个或它们的组合的控制。
6.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，上述控制部具备用于控制上述第一光源的第一光源控制部和用于控制上述第二光源的第二光源控制部。
7.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，上述载物台是使上述被观察物的位置移动的二维或三维载物台。
8.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，上述荧光图像信息检测部具备波长选择单元，该波长选择单元对至少一个以上的波长的荧光进行分离。
9.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，还具备第一针孔和第二针孔，该第一针孔配置于上述第二光源与上述被观察物之间， 该第二针孔配置于上述荧光与上述荧光图像信息检测部之间。
10.根据权利要求9所述的显微镜装置，其特征在于，还具备针孔驱动部，该针孔驱动部使上述第一针孔或上述第二针孔移动和/或旋转。
11.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，还具备配置于上述第一光源与上述被观察物之间的物镜以及该物镜的驱动部。
12.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，还具备配置于上述被观察物处产生的光与上述图像信息检测部之间的成像透镜以及该成像透镜的驱动部。
13.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，还具备配置于上述荧光与上述荧光图像信息检测部之间的成像透镜以及该成像透镜的驱动部。
14.根据权利要求13所述的显微镜装置，其特征在于，还具备环境控制部，该环境控制部容纳上述被观察物且充满有环境气体。
15.根据权利要求14所述的显微镜装置，其特征在于，上述环境控制部具备能够容纳多个上述被观察物的容纳部。
16.根据权利要求1所述的显微镜装置，其特征在于，还具备被观察物刺激单元，该被观察物刺激单元刺激上述被观察物。
17.一种被观察物的荧光观察方法，获取被观察物的图像信息和该被观察物的荧光图像信息，该荧光观察方法的特征在于，包括以下步骤第一步骤，根据上述被观察物的图像信息和上述被观察物的运动模型来决定上述被观察物的荧光观察区域；以及第二步骤，在上述荧光观察区域内的规定位置处获取上述荧光图像信息。
18.根据权利要求17所述的被观察物的荧光观察方法，其特征在于，按照诸如PID控制等古典控制以及诸如最优控制、准最优控制等现代控制来决定上述第一步骤的荧光观察区域。
19.根据权利要求17所述的被观察物的荧光观察方法，其特征在于，在上述第一步骤与上述第二步骤之间，根据上述被观察物的图像信息和上述被观察物的运动模型中的至少一个来决定上述荧光观察区域的中心位置。
20.根据权利要求17所述的被观察物的荧光观察方法，其特征在于，在上述第二步骤中，获取上述被观察物的图像信息。
21.根据权利要求17 20中的任一项所述的被观察物的荧光观察方法，其特征在于，在上述荧光观察区域内的每个规定位置处将各上述步骤重复进行规定次数。
22.根据权利要求17所述的被观察物的荧光观察方法，其特征在于，上述运动模型的参数包括上述被观察物的位置、速度、分布、种类、形状、离子浓度、分子浓度中的任一个或它们的组合。
全文摘要
提供一种控制细胞等被观察物的位置和控制荧光记录的显微镜装置以及荧光观察方法。显微镜装置(1)具备载物台(3)，其载置被观察物(2)；被观察物(2)的照明用光源(4)；激励用光源(5)，其对被观察物(2)激发荧光F；图像信息检测部(16)，其检测基于在被观察物(2)处产生的光T的图像信息；荧光图像信息检测部(17)，其检测基于荧光F的荧光图像信息；以及控制部(20)，其根据被观察物(2)的运动模型和从图像信息检测部(16)输入的被观察物(2)的图像信息来决定被观察物(2)的荧光观察区域，在荧光观察区域内每隔规定的间隔获取从图像信息检测部(16)输入的被观察物(2)的图像信息和从荧光图像信息检测部(17)输入的荧光图像信息。
文档编号G02B21/00GK102216827SQ20098014545
公开日2011年10月12日 申请日期2009年6月10日 优先权日2008年9月13日
发明者五十岚康伸, 出口雄规, 小原健, 桥本浩一, 铃木健史 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构