用于确定并校正显微镜成像光路中球差的装置和方法

专利名称：用于确定并校正显微镜成像光路中球差的装置和方法
技术领域：
本发明涉及用于确定并校正显微成像中的球差的装置和方法，采用包含物镜的显 微镜对样本进行显微成像，承载样本或覆盖样本的盖玻片布置在显微镜的成像光路中。
背景技术：
对于显微分析，待分析的样本通常被放置在盖玻片的上方或下方，或者被放入大 面积的样本室(孔板、微量滴定板、Labtech板)。存在着多种盖玻片的厚度。特别地，在前 述的样本室中，盖玻片的厚度显著地波动。当盖玻片布置在成像光路中时，盖玻片的厚度不 同会负面地影响系统的光学性能。在使用大面积样本室的成像中，盖玻片厚度的变动导致 了消弱的成像质量(特别地，负面影响了对比度和分辨率)。像差，也称作“球差”，可通过附 加的可调校正透镜元件来进行校正。这种透镜元件通常安装在物镜内，通常通过物镜的外 镜筒上称为校正环的元件进行手动调节。理想的情形下，校正透镜元件不能改变已被设定 的焦距。
DE4323721C2涉及这种具有适于不同盖玻片厚度的校正装置的显微镜物镜。该文 献提出具有校正透镜元件的校正底座应可绕光轴径向旋转且可沿光轴轴向地移置。特别 地，存在着两个这种校正底座。据该文献，所提出的特征能够在显微镜物镜内极其均匀并无 干扰地移置校正底座，所提出的物镜能够用于校正Omm至2mm的盖玻片厚度。
DE102007002863B3同样描述了用于显微镜物镜的适于校正盖玻片厚度的调节装 置，该调节装置是手动驱动的。如果在显微分析中使用不同厚度的盖玻片，需对每一新的盖 玻片厚度再次进行手动校正。这不仅耗时而且使得显微镜更加难以操作。
US7593173B2披露了一种用于校正盖玻片厚度的机动调节装置。该调节装置包括 安装在物镜转轮上的驱动马达，其驱动轴可选择地耦合至保持在物镜转轮上的多个显微镜 物镜中的一个。每个显微镜物镜都具有与所述驱动轴相啮合的前述类型的校正环。
已发现，除了上文所陈述的不同的盖玻片厚度和/或盖玻片厚度的变动，在显微 分析中其他的参数也导致了物镜的球差。特别地，这些参数是使用的浸没介质的性质和温 度，以及盖玻片的材料和结构。通常盖玻片由浮法玻璃制造，其也特别地用于LED盖的制 造。这种浮法玻璃存在着不一致的平坦度和同质性。通常为各种目的会在显微镜物镜和盖 玻片之间引入浸没介质(浸没油、水或甘油)，则显微镜物镜被用作浸没物镜，其前方元件浸 入在浸没介质中。油类浸没物镜用于增加可实现的分辨率。通常，水类浸没介质用于观察 活的细胞或组织，以防止所准备的样本变干。一般来说，由于折射率在界面处有大的变化， 浸没介质能够减少对比度较低的反射。特别地，在对准备的样本进行长期持续性成像时，在 分析的过程中各浸没介质的温度会发生改变。这导致了成像质量的相应改变。
下文中，由上述效果所导致的像差被定义为“球差”。已知的用于补偿盖玻片厚度 的方法并不足以消除所有的球差。
因此，本发明的目的之一在于通过基本上自动地校正所产生的球差以增强显微样 本分析中的成像质量。发明内容
根据本发明，提出了一种用于确定显微成像中的球差的方法，采用包含有物镜的 显微镜对样本进行显微成像，承载或覆盖样本的盖玻片被布置在显微镜的成像光路中，测 量光束在物镜光轴之外以偏心的方式被引导穿过物镜到达样本，且在盖玻片和样本的界面 处反射的测量光束被引导穿过物镜到达探测器，探测器获取反射的测量光束的光强分布。 通过定性和/或定量地评价所述光强分布，能够确定球差的存在。
本发明进一步地涉及一种用于确定显微成像中的球差的相应装置，采用包含有物 镜的显微镜对样本进行显微成像，承载或覆盖样本的盖玻片被布置在显微镜的成像光路 中。该装置包括入耦合装置，用于将测量光束耦合入显微镜的成像光路，其使得测量光束在 物镜光轴之外以偏心的方式入射并穿过物镜到达样本；出耦合装置，用于将在盖玻片和样 本的界面处反射的测量光束在穿过物镜后耦合出显微镜的成像光路；探测器，测量光束在 耦合出成像光路后入射其上，探测器获取所述测量光束的(基于波长的)光强分布；评价单 元，用于评价光强分布以确定球差。
根据各独立权利要求、下文的描述及附图，本发明进一步的优点和实施例将显而 易见。
本发明的优点
已发现，以前述方式在盖玻片和样本的界面处反射的测量光束对于说明书介绍部 分所描述的造成球差的原因是敏感的。不存在球差时的理想光强分布的形状因球差的产生 而发生变化，例如由于盖玻片厚度的变化，浸没介质温度的波动或者盖玻片结构的改变。从 而，例如理想光强分布的特定参数可用作控制的变量以补偿偏差，即球差的出现。因而这种 补偿是实时发生的，即(几乎)没有延迟。进一步的优点是，校正出现的球差并不需要知道或 确定盖玻片的厚度、或盖玻片厚度的改变。本发明可用于补偿球差，不论球差是由什么原因 造成的。
可根据多个参数来评价光强分布的形状。主要是描述信号宽度、信号高度或边缘 斜率的变量，它们是特别有用的。例如，可确定分布的半峰全宽。当球差存在时，该宽度会 增加。可选或附加地，可确定光强分布的边缘斜率。可以简单的方式完成，例如通过计算差 商。由于球差，边缘斜率会减小。通过确定最大值可以以简单的方式来确定信号高度。用于 评价信号的基于模型的方法基于将光强分布适配于描述分布的函数，其在技术实施上开销 更大，但在数值上会更稳定。例如，可通过高斯函数来近似化整个信号或部分信号(边缘)， 并从因而确定的值直接获得宽度或边缘斜率的参数。局部适配于其他函数，例如多次方多 项式，也能够评价宽度和斜率。
本发明特别地灵敏，因此在实践中可用于因盖玻片的光学特性发生改变和/或浸 没介质的光学特性发生改变而产生的球差。正如已讨论的，其包含盖玻片厚度的改变或波 动、盖玻片结构或材料的改变、以及浸没介质温度的改变。
可以简单的方式生成用于确定球差的测量光束，例如，通过照明具有下游照明镜 片的狭缝或小孔，从而借由显微镜物镜在样本上(更精确地说，是在盖玻片和样本的界面 上)生成狭缝或小孔的像。
在本发明特别有利的实施例中，用于确定球差的测量光束还可用作三角化(triangulating)自动聚焦单元的自动聚焦测量光束。同样，当存在有用于设置和/或保持物镜焦距的三角化自动聚焦单元时，自动聚焦测量光束也可用于确定球差的测量光束。
三角化自动聚焦装置是已知的，例如，可由US5136149B1得知。DE19537376A1讨论了该US专利文献并涉及自动聚焦原理，本文中称为“三角化”自动聚焦原理。参考附图1来进一步地解释该原理，其相应于根据前述US5136149B1的三角化自动聚焦原理。布置有自动聚焦光源19，自动聚焦测量光束30在偏转并穿过显微镜物镜10后，倾斜入射在物面16 上。自动聚焦扫描单元包含用于探测光束的横向偏移(如下文所述的)的空间分解自动聚焦探测器28，以及用于移动物镜10的马达27。可选地，物面16也可在光轴8 (S卩，图1中绘出的Z方向)的方向上移动以实现聚焦。
图1中仅示意性地绘出的显微镜的其他部件是镜筒透镜12和像面14。采用根据图1的自动聚焦装置，自动聚焦测量光束(标记为30)在A点被分束器20偏转至光束横截面的一半(参考光轴8)。偏转的光束30再由物镜10转向从而在C反射点以角度α偏斜或倾斜地入射至物面16。光束30被反射或传送为反射的自动聚焦测量光束32，随后再次通过物镜10转向、在B点被分束器20偏转至光路的另一侧，参考于相对于光轴8的A点位置。偏转的光束32随后入射在探测器28上，例如位置灵敏探测器(PSD)。其输出的信号基于光束32到达的位置，从而能够确定出位置。
在散焦情况下，即根据图1的示例中物面16移至平面16’，自动聚焦光束30直至在反射点D处才反射,相对于C点,光束不仅在光轴8的方向上发生了移动,横向上也移动了。非常明显地，相应的反射光束32’到达探测器28上的不同位置，因此相较于聚焦位置输出了修改的信号。因而可测量散焦的程度。借由相应的调节或控制单元，通过相应控制马达27，在Z方向上(即，在光轴8的方向上)移动物镜透镜可补偿散焦情形。
由DE3219503A1可得知用于入射光显微镜的相似的自动聚焦装置，其根据上述的三角测量原理运行。US2004/0113043A1描述了一种相似的自动聚焦系统，其采用半阻挡的测量光束通过红外光在待显微分析的物体上生成测量狭缝，并使用CCD阵列传感器作为探测器。在该US文献中，相应探测的信号和实际的聚焦位置之间的关系由图示出。 W02007/144197A1也涉及通过三角测量方法的自动聚焦。DE102008018951A1涉及基于这种自动聚焦的显微镜，其包括聚焦保持单元。
因此，在已包含有三角化自动聚焦装置的显微镜中可以特别有利地实施本发明。 扩展对自动聚焦测量光束的评价，使得不仅测量和分析其位置，还测量和分析其光强分布。 根据光强分布确定的参数随后可用来消除产生的球差。
本发明还特别地适于连续校正已确定的球差。基本上有两种方法适用于此
一方面，通过上文所述的物镜中校正透镜元件对所产生的球差进行补偿。有利的是，以机动的方式控制该校正透镜、且通过消除球差所引起的与理想光强分布(目标值)的偏差的控制环来使得控制信号可用。前述的光强分布参数之一，例如边缘斜率，可作为控制环的输入变量。以合适的方式调节该校正透镜元件直至边缘斜率为理想光强分布的边缘斜率的值。
另一方面，使用自适应镜片对所产生的球差进行补偿，该镜片布置在与物镜光瞳共轭的平面中且被控制以补偿球差。因此，这种情况下在物镜之外实施校正。
根据本发明的装置包括入耦合装置，用于将测量光束耦合入显微镜的成像光路，使得测量光束在物镜光轴之外以偏心的方式穿过物镜入射至样本上。提供出耦合装置，用 于将在盖玻片和样本的界面处反射的测量光束在穿过物镜后耦合出。入耦合装置和出耦合 装置有利地包含一公共二向色分束器。二向色分束器被设计为对使用的测量光束的波长 (例如，红外的)是反射性的，而对样本反射或发射的剩余光的光谱是透射性的。入耦合装置 和出耦合装置包含有其他的光学元件以至所需的程度，例如透镜或光束偏转器(反射镜)。 该公共的二向色分束器有利地布置在显微镜筒和显微镜物镜之间的显微镜成像光路中。借 由出耦合装置，自所述界面反射的测量光束在穿过物镜之后被引导至探测器上或在探测器 上成像，所述探测器装备有允许获取测量光束的光强分布的探测器表面。这种探测器充分 地已知，例如，以CCD相机的形式。评价单元，集成在探测器中或可选地与该探测器分离，设 计为评价由探测器获取的测量光束的光强分布。
当不存在球差时，相较于存在球差时获取的分布，光强分布具有“原始形状”，即最 大边缘斜率、最小可能的半峰全宽以及最大的光强信号电平。评价单元被设计为确定光强 分布的参数。可能的参数是已提及的参数中的一个或多个，例如半峰全宽、边缘斜率以及最 大光强值。
根据第一实施例，如上所述，为补偿已确定的球差，显微镜物镜中具有用于补偿球 差的校正透镜元件，并提供控制单元以调节校正透镜元件。具有相应控制单元的这种校正 透镜元件作为盖玻片厚度校正本身是已知的。
提供与评价单元通信以传送表示光强分布的参数的信号的调节单元，从而实施自 动调节以补偿确定的球差，调节单元又与前述物镜校正元件的控制单元通信以传送调节信 号以执行校正元件的调节直至确定的球差被补偿。
为此，评价单元产生例如表示光强分布的边缘斜率的信号。如果存在球差，边缘斜 率(实际值)将偏离边缘斜率的最佳值(目标值)，则调节装置产生与该偏离值相关的、用于 控制单元的调节信号或调整信号，以调节显微镜物镜的校正元件。调节装置执行该调节直 至实际值和目标值之间的偏离为零，即确定的球差被补偿。
根据另一实施例，如上所述，为补偿已确定的球差，在光路中布置自适应镜片以补 偿球差。可使用的自适应镜片例如为可变形反射镜，通过布置在其后侧的激励器，上镜面可 连续地变形。借由相应的控制单元对激励器进行控制。这种可变形反射镜是已知的，下文 中不再进一步描述。该可变性反射镜优选地布置在物镜光瞳中。由于物镜光瞳本身难以接 近，必须布置在与其共轭的平面中，并在物镜之外。这可使用传送镜片或所谓的中继光学系 统来实现。由于在物镜之外校正球差，自聚焦重叠位置也必须被、设置在物镜光瞳的共轭面 之后。而二向色分束器的布置和自聚焦系统的构造则不受其影响。
同样地，如果提供与评价单元通信以传送表示光强分布的参数的信号、且与自适 应镜片的控制单元通信以传送控制信号或调节信号从而控制自适应镜片直至确定的球差 得到补偿的调节装置，则可通过控制环自动地补偿确定的球差。
关于调节系统的细节，参考关于对物镜的校正透镜元件的控制单元进行控制的调 节装置的描述。需要强调的是，在原理上用于补偿确定的球差的两个实施例并不相互排斥， 即可同时提供校正透镜元件和自适应镜片。相应的调节装置可分别地提供，也可合并至一 公共的调节装置。
在如上所述的特别有利的实施例中，评价单元被设计为不仅评价光强分布，并且确定光强分布的空间位置及探测器的探测器表面上该空间位置的任何改变。
此外，评价单元设计为特别地基于光强分布的位置的改变生成散焦情形的自聚焦 参数。如前所述，根据三角化自聚焦原理，横向的位移与散焦情形相关联。因此，相应设计 的评价单元(“合并的评价单元”)不仅适于确定球差，还适于确定散焦情形。
为了消除散焦情形，即设置或保持焦距，有利的是另外提供自聚焦控制单元以设 置显微镜的焦距，例如通过相应地移动物镜中的透镜元件或整个物镜或物面。另外，提供与 评价单元通信以传送自聚焦参数的信号、且与自聚焦控制单元通信以传送另一信号的自聚 焦调节装置，从而执行聚焦调节直至存在的散焦情形得以消除。
当然，前述用于补偿球差的调节装置可与自聚焦调节装置一起构成一个公共单 元。相似地，为补偿球差用来控制物镜的校正元件或自适应镜片的控制单元可与为设置显 微镜的焦距的自聚焦控制单元可构成一个公共单元。最后，用于生成光强分布参数(可选地 用于生成自聚焦参数)的评价单元可与获取光强分布(可选地用于确定光强分布的位置)的 探测器构成一个单元。
可以理解，在不背离本发明范围的情况下，上述特征和下文中仍将解释的特征不 仅用于所表明的各个组合中，还可用于其它的组合或分离使用。特别地，本发明并不限于特 定的显微术方法。换句话说，其还可用于宽场显微术(所谓的成像物体视场的“典型”显微 术)和采用成像光束扫描物体并由单个成像点集合成像的扫描显微术。采用已知的扫描显 微术方法(共焦、多光子、二次谐波、三次谐波及相干反斯托克斯拉曼散射[CARS])测量来自 物体的光的功率电平，其为扫描光束位置的函数。这可使用必需的空间分辨探测器来实施。
基于示例性的实施例，附图中示意性地绘出本发明，且下文中将参考附图详细地 描述本发明。


图1示意性地绘出根据现有技术的三角化自聚焦装置的例子。
图2示意性地示出根据本发明的用于确定显微成像中的球差的装置的实施例。
图3示意性地示出根据图2且补充有三角化自聚焦装置的设备的实施例。
图4示出当球差存在时(图4a)和当球差不存在时(图4b)的典型的光强分布。
图5示意性地示出根据图3且具有三角化自聚焦装置和用于补偿球差的自适应镜 片的装置。
具体实施方式
图1示出了根据现有技术US5136149B1的三角化自聚焦装置，在说明书中已结合 本发明特别有利的实施例进行了详尽的描述。
图2示意性地示出了根据本发明用于确定显微镜I的显微成像中的球差的装置的 优选实施例，其中仅示出了必需的部件(下文中将描述)。样本9放置在承载样本9的盖玻 片2上。盖玻片2放置在显微镜I的成像光路7中。显微镜物镜被标记为10。镜筒透镜 12仅是示意性地绘出。其它的细节，例如目镜、图像获取探测器、变焦系统等未示出，因为它 们对本发明来说不是必要的。本领域技术人员可从现有技术中获知这些单元。
样本9可涉及在较长时间段下进行观察的活细胞。沿X-Y方向，即在垂直于图2的平面的面内对样本9的扫描也是可能的。采用这种典型的显微分析，基于被分析的样本 位置盖玻片2的厚度发生变化。另外，盖玻片2的材料结构在X-Y平面内可能是不均匀的。 当使用浸没物镜时(未示出)，在盖玻片2和物镜10之间存在着浸没介质，在显微分析期间， 浸没介质中的温度可能会波动。上述所有的改变都表现出盖玻片或浸没介质的光学特性的 改变，对光学成像质量产生不利的影响(“球差”)。
为探测和确定球差，发自测量光源129的测量光束130被以偏心的方式引导，即在 物镜10的光轴8之外，穿过物镜10到达样本9上。在盖玻片2和样本9的界面116上反射 的测量光束132通过物镜10被引导至探测器128上。为此而生成测量光束130，例如，通过 具有下游(未示出)照明光学器件的狭缝(未示出)。狭缝的图像被制造在所述界面116上。 入耦合装置将测量光束130耦合入显微镜I的光路中，这种情况下，入耦合装置大体上包括 偏转元件13及二向色分束器120。另一方面，出耦合装置将反射的测量光束132耦合出，出 耦合装置大体上仍包括前述的二向色分束器120和示意性绘出的透镜15。透镜15将狭缝 成像在探测器128的敏感探测器表面上。探测器128获取到所述测量光束的光强分布，并 由下游的评价单元6进行评价。
有利的是，选择测量光束130的波长在显微观察样本9的光谱范围之外。例如，来 自红外区域的波长对测量光束130是有利的。二向色分束器120对测量光束130和反射的 测量光束132的波长区域是反射性的，而对光谱的剩余区域是透射性的，特别是对显微分 析样本9的光谱是透射性的。以这种方式，传输的观察光束被偏转元件11偏转至镜筒透镜 12。
附图4中示出由探测器128获取的反射的测量光束132典型的光强分布。附图4a 示出了存在球差时的光强分布(沿探测器的X方向绘出光强I)，附图4b示出了没有球差的 光强分布的最优情况。从而，附图4b示出了光强分布的目标值，而附图4a示出了光强分布 可能的实际值。
参考附图2，评价单元2评价光强分布(见图4a)的实际值，并在其与光强分布的目 标值(根据图4b的最优值)发生偏离时确定球差。球差可以是由上述的原因造成的。为定 量地评价存在的球差，需定量和/或定性地评价光强分布的信号形状。为此，评价单元6确 定光强分布的参数，特别地，获取的光强分布的半峰全宽、边缘斜率和/或信号最大值。“边 缘斜率”指的是在分布的特定点上光强信号的斜率，例如在半峰全宽区域或可定义的信号 值，例如在探测的光强最大值的百分之30处的斜率。例如，有益的是使用光强分布的单侧 边缘斜率，从评价单元6向调节装置5发出作为调节信号的相应输出信号。
例如，在调节装置5中存储有最优或“原始”光强分布的单侧边缘斜率作为目标值 (举例来说，根据图4b的目标值)。根据单侧边缘斜率实际值与目标值之间的偏差，调节装置 5向用于物镜10的校正透镜元件3的控制单元4传送设定信号，其中校正透镜元件3是用 于校正盖玻片厚度的可移动的透镜元件。控制单元4相应机动地调节校正透镜元件3。从 而，在不改变物镜10焦距的情况下校正了球差。需指出的是本发明该实施例的优点是任何 原因造成的球差都可以得到补偿。特别地，无需定量地感知盖玻片厚度的变动或改变就可 以校正盖玻片厚度。一旦对校正透镜元件3施加控制，就以控制环的形式感知并评价光强 分布的新的实际值。如果仍偏离于目标值，则继续对校正透镜元件3进行控制，直至球差被 补偿。
附图3示出根据附图2且补充有三角化自聚焦装置的装置。相同的部件被标识为相同的附图标记。为避免赘述，根据附图2的装置不再讨论，参考对附图2的解释。
理论上根据附图2的用于确定并补偿球差的装置也可用做三角化自聚焦装置。同样，三角化自聚焦装置也可用于根据附图2的用于确定并补偿球差的装置。
这种情况下，测量光束30同时作为如图1所示的自聚焦测量光束30。二向色分束器120相应于图1中的分束器20。盖玻片2和样本9的界面116相应于图1的物面16。 根据图2的探测器128被设计为获取反射的测量光束132的光强分布，在图3中还额外地是空间分解探测器。这种空间分解探测器不仅探测光强，还探测测量光束的位置。例如可使用CXD线型摄像机或CXD矩阵摄像机。在探测器128的下游是合并的评价单元26，其确定探测器获取的光强分布从而确定球差，还确定光强分布的空间位置。因此，合并的评价单元26生成表示相应参数的两个信号，即光强分布的参数和散焦情形的参数。相应的信号被引导至调节装置5 (参见附图2)和自聚焦调节装置25。因此，如结合附图2所描述的，能够补偿球差。另外，借由自聚焦调节装置可消除在显微分析中发生的散焦情形。为此，自聚焦调节装置25向自聚焦控制单元24传送基于散焦情形参数的定位信号。自聚焦控制单元 24例如可为图1示出的马达27，或是可以向这种马达施加控制。在根据图3的示例性实施例中，自聚焦控制单元24在Z方向上(B卩，平行于光轴8)移动物镜10从而抵消散焦情形。 可以控制环的方式连续地进行自动聚焦。
当然，图3示出的调节装置5和25可合并为一个公共的调节装置。相反，图3示出的合并的评价单元26可由两个独立的评价单元构成。
附图5示意性地示 出根据图3的为补偿成像光路的球差的装置，其包括具有关联的控制单元51的自适应镜片52，此外还装备有三角化自聚焦装置。相同的部件被表示为相同的附图标记。为避免赘述，根据附图3的装置不再讨论，参考对附图3的解释。
在该示例性实施例中，用于确定球差的测量光束130同时作为如图1所示的自聚焦测量光束30。二向色分束器120相应于图1中的分束器20。盖玻片2和样本9的界面 116相应于图1的物面16。根据图2的探测器128设计为获取反射的测量光束132的光强分布，在图5中还是空间分辨探测器。这种空间分辨探测器不仅探测光强，还探测测量光束的位置。例如可使用CXD线型摄像机或CXD矩阵摄像机。
这里使用的自适应镜片是可变形反射镜52，通过相应布置在其后侧的激励器，该反射镜的上镜面侧可连续地变形。通过相应的控制单元51对激励器(未示出)进行控制。 可变形反射镜52布置在与物镜光瞳共轭的平面中。为此提供有中继光学系统53 (也称为传送镜片)。相应的中间像被表示为54。附图标记55表示其他的偏转元件。附图标记120 仍表示二向色分束器(参见附图2)。
在探测器128的下游是合并的评价单元26，其不仅评估探测器获取的光强分布从而确定球差，还确定光强分布的空间位置。因此，合并的评价单元26生成表示相应参数的两个信号，即光强分布的参数和散焦情形的参数。相应的信号被引导至调节装置50 (参见附图2)和自聚焦调节装置25。
为评价存在的球差，需定量和/或定性地评价光强分布的信号形状。为此，评价单元26确定光强分布的参数，特别地，获取的光强分布的半峰全宽、边缘斜率和/或信号最大值。“边缘斜率”指的是在分布的特定点上光强信号的斜率，例如在半峰全宽区域或可定义的信号值，例如在探测的光强最大值的特定百分比处的斜率。例如，有益的是使用光强分布 的单侧边缘斜率，从评价单元26向调节装置50发出作为调节信号的相应输出信号。
例如，在调节装置50中存储有最优或“原始”光强分布的单侧边缘斜率作为目标 值(举例来说，根据图4b的目标值)。根据单侧边缘斜率实际值与目标值之间的偏差，调节 装置50向控制自适应镜片52的反射表面的形变的控制单元51传送设定信号。控制单元 51相应机动地调节或变形自适应镜片52。从而，在不改变物镜10焦距的情况下校正了球 差。本发明该实施例的优点是任何原因造成的球差都可以得到补偿。
一旦调节自适应镜片52，就以控制环的形式连续地感知并评价光强分布的新的实 际值。如果仍偏离于目标值，则继续对控制单元51进行控制，其以控制的方式使自适应镜 片52的反射表面发生形变，直至球差被补偿。以这种方式可连续的补偿球差。
另外，借由自聚焦调节装置，在显微分析中发生的散焦情形得到补偿，焦距被保持 为恒定。为此，自聚焦调节装置25向自聚焦控制单元24传送基于散焦情形参数的定位信 号。自聚焦控制单元24例如可为图1示出的马达27，或是可以向这种马达施加控制。在根 据图3的示例性实施例中，自聚焦控制单元24在Z方向上(即，平行于光轴8)移动物镜10 从而抵消散焦情形。可以控制环的方式连续地进行自动聚焦。
图5示出的装置显著
部件列表
I显微镜
2盖玻片
3校正透镜元件
4用于3的控制单元
5调节装置
6评价单元
8光轴
7成像光路
9样本
10物镜
11偏转元件
12镜筒透镜
13偏转元件
14像面
15透镜
16，16，物面
19自聚焦光源
20分束器，二向色
24自聚焦控制单元
25自聚焦调节装置
26合并的评价单元
27马达0089]28自聚焦探测器0090]30自聚焦测量光束0091]30，30’传送的自聚焦测量光束0092]50调节装置0093]51用于52的控制单元0094]52可变形反射镜，自适应镜片0095]53中继光学系统0096]54中间像0097]55偏转元件0098]116界面0099]120分束器(二向色)0100]128探测器0101]129测量光源0102]130测量光束0103]132反射的测量光束0104]α角度0105]Z方向0106]C反射点0107]D反射点0108]A偏转点0109]B，B，偏 转点
权利要求
1.一种用于确定显微镜成像光路(7)的球差的方法，其中采用包含物镜(10)的显微镜(I)对样本(9 )进行显微成像，承载或覆盖样本(9 )的盖玻片(2 )被布置成像光路中， 其中，测量光束(130 )在物镜(10 )的光轴(8 )之外以偏心的方式被弓I导穿过物镜(10 )到达样本(9)上，在盖玻片和样本(9)的界面(116)处反射的测量光束(132)被引导穿过物镜(10)到达探测器(128)上，该探测器(128)获取反射的测量光束(132)的光强分布，以及 根据所述光强分布，定性和/或定量地确定球差的存在。
2.根据权利要求1的方法，其中根据信号的形状来评价该光强分布。
3.根据权利要求1或2的方法，其中对光强分布的评价包含确定光强分布的半峰全宽和/或光强分布的边缘斜率和/或光强分布的最大值。
4.根据权利要求1至3中之一的方法，其中确定由盖玻片(2)的光学特性的改变，特别是盖玻片厚度的改变和/或盖玻片结构或材料的改变所造成的球差，和/或由浸没介质的光学特性的改变，例如浸没介质的温度的改变所造成的球差。
5.根据前述任一权利要求的方法，其中测量光束(130)还作为与显微镜(I)相关的三角化自聚焦单元的自聚焦测量光束(30)。
6.根据权利要求1至4中之一的方法，其中使用三角化自聚焦单元以设置和/或保持物镜(10)的焦距，其中三角化自聚焦单元的自聚焦测量光束(30)还作为用于确定球差的测量光束(130)。
7.根据前述任一权利要求的方法，其中确定球差后，沿光轴移动物镜(10)中的校正透镜元件(3)，从而补偿球差。
8.根据前述任一权利要求的方法，其中确定球差后，控制布置在与物镜光瞳共轭的平面中的自适应镜片(52 )，从而补偿球差。
9.一种用于确定显微镜成像光路(7)的球差的装置，其中采用包含物镜(10)的显微镜(I)对样本(9 )进行显微成像，承载或覆盖样本(9 )的盖玻片(2 )被布置成像光路中， 其特征在于 入耦合装置(13，120)，用于将测量光束(130)耦合入显微镜(I)的显微镜成像光路(7)，其使得测量光束(130)在物镜(10)的光轴之外以偏心的方式入射并穿过物镜(10)到达样本(9)上； 出耦合装置(120，15)，用于将在盖玻片(2)和样本(9)的界面(116)处反射的测量光束(132)在穿过物镜(10)后耦合出显微镜(I)的显微成像光路； 探测器(128)，出耦合的测量光束(132)在其上成像，该探测器(128)获取所述测量光束(132)的光强分布； 评价单元(6)，根据该光强分布定性和/或定量地确定球差。
10.根据权利要求9的装置，其中该入耦合装置和该出耦合装置包括分束器(120)。
11.根据权利要求9或10的装置，其中该评价单元(6)能够确定光强分布的参数，特别是光强分布的半峰全宽和/或光强分布的边缘斜率和/或信号电平。
12.根据权利要求9至11中之一的装置，其中物镜(10)中设置有校正透镜元件(3)，以补偿球差，设置控制单元(4 )以调节该校正透镜元件(3 )。
13.根据权利要求11和12的装置，其特征在于用于接收评价单元(6)的输出信号的调节装置(5)，该信号表示光强分布的参数，调节装置的输出信号作为调节信号施加至物镜(10)的校正透镜元件(3)的控制单元(4)，从而调节该校正透镜元件(3)直至确定的球差得以补偿。
14.根据权利要求9至11中之一的装置，其中在与物镜光瞳共轭的平面内布置自适应镜片以补偿球差，设置控制单元以对该自适应镜片(52 )进行控制。
15.根据权利要求14在其引用权利要求11时的装置，其特征在于接收评价单元(26)的输出信号的调节装置(50)，该信号表示光强分布的参数，该调节装置(50)的输出信号作为调节信号施加至自适应镜片(52)的控制单元(51)，从而对该自适应镜片(52)进行控制，直至确定的球差得以补偿。
16.根据权利要求9至15中之一的装置，其中该评价单元(6，26)能够确定探测器(128)的探测器表面上的光强分布的空间位置及其改变。
17.根据权利要求16的装置，其中该评价单元(6，26)能够基于光强分布的位置的改变生成当前散焦情形的自聚焦参数，且由此能够得到调节信号，使用该调节信号能够修正聚焦位置直至当前散焦情形得以消除。
全文摘要
本发明涉及一种用于确定显微镜成像光路(7)的球差的方法，采用包含物镜(10)的显微镜(1)对样本(9)进行显微成像，承载或覆盖样本(9)的盖玻片(2)被布置成像光路中，测量光束(130)以偏心的方式在物镜(10)的光轴(8)之外被引导穿过物镜(10)到达样本(9)上，在盖玻片和样本(9)的界面(116)处反射的测量光束(132)被引导穿过物镜(10)到达探测器(128)上，探测器获取反射的测量光束(132)的光强分布，根据所述光强分布，定性和/或定量地确定球差的存在。
文档编号G02B21/24GK103048779SQ201210390508
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月15日 优先权日2011年10月14日
发明者W·奈彼尔, T·鲍尔, P·尤特诺伊尔 申请人:徕卡显微系统复合显微镜有限公司