专利名称：一种超分辨微分干涉相衬显微成像系统及显微成像方法
技术领域：
本发明涉及显微成像技术领域，特别涉及一种基于结构光照明的超分辨微分干涉相衬显微成像系统及成像方法。
背景技术：
基于结构光照明的超分辨显微成像系统能够提高显微成像的分辨率，现有技术中，主要包括两种成像系统。第一种是将结构光照明应用于荧光显微成像的成像系统，它具有较好的对比度，但是，其存在的主要问题如下1)要进行荧光成像，就需要对所观察的样品进行荧光标记，故需要额外的样品制备过程；2)在上述样品制备过程中，需要将染料或荧光团等物质增加到样品中，因而可能会引入一些副效应，如光漂白效应和光毒性效应。第二种是基于结构光照明的散射光成像系统，它无需对样品进行荧光标记，但是，它的成像对比度低，往往需要采用金纳米颗粒辅助成像，或者，需要具有一定对比度的样品来实现高对比度的成像，导致它的适用性较差，例如，在对没有任何处理的生物样品成像时，由于它的成像对比度低，所以无法适用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出了一种无需额外的样品制备过程，无光漂白效应和光毒性等副效应，且成像对比度高的基于结构光照明的超分辨微分干涉相衬显微成像系统及成像方法。本发明提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统包括包含微分干涉相衬成像模块的显微镜，所述成像系统还包括光源、第I透镜、第I反射镜、空间光调制器、第III透镜、挡光板、第IV透镜和CXD，所述空间光调制器的入射角度< 10°，所述空间光调制器每个方向具有三个相位，所述挡光板用于阻挡O级光而允许+1级光和-1级光通过或者阻挡+1级光和-1级光而允许O级光通过，由所述光源发射的光依次经过第I透镜、第I反射镜、空间光调制器、第III透镜、挡光板、第IV透镜后经过所述包含微分干涉相衬成像模块的显微镜后，图像由所述CXD接收。本发明提供的所述的成像系统的显微成像方法包括以下步骤步骤S1:对采集到的原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；步骤S2 :对图像边缘进行轻微切趾，使得由离散傅里叶变换产生边缘伪像最少；步骤S3 :对图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；步骤S4 :由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3X3的线性方程组，分离出O级，+1级和-1级频谱成像信息；步骤S5 由分离出O级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率kQ与初始相位Φ ；步骤S6 :将分离出的+1级频谱平移+Iv将分离出的和-1级频谱平移-1itl ；步骤S7 :将平移后的+1级和-1级频谱与O级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；
步骤S8 :对步骤S7得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得超分辨的微分干涉相衬图像。本发明提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统及成像方法无需额外的样品制备过程，无光漂白效应和光毒性等副效应，且成像对比度高。
图1为本发明实施例一提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统的原理图；图2为本发明实施例二提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统的原理图；图3为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统在光照方向为90°、相位为O时的空间光调制器的控制图像；图4为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统在光照方向为90°、相位为$时的空间光调制器的控制图像；图5为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统在光照方向为
Αητ
90°、相位为+时的空间光调制器的控制图像；图6为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统在光照方向为0°、相位为O时的空间光调制器的控制图像；图7为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统在光照方向为0°、相位为f时的空间光调制器的控制图像；图8为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统在光照方向为0°、相位为*时的空间光调制器的控制图像；图9a为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统对53nm聚苯乙烯小球样品成像的频谱图像；图9b为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统对53nm聚苯乙烯小球样品成像的效果图像；图9c为本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统对53nm聚苯乙烯小球样品成像后，对单个小球的强度分布做高斯拟合得到的曲线图；图9d为传统的微分干涉相衬显微成像系统对53nm聚苯乙烯小球样品成像的频谱图像；图9e为传统的微分干涉相衬显微成像系统对53nm聚苯乙烯小球样品成像的效果图像；
图9f为传统的微分干涉相衬显微成像系统对53nm聚苯乙烯小球样品成像后，对单个小球的强度分布做高斯拟合得到的曲线图。
具体实施例方式为了深入了解本发明，下面结合附图及具体实施例对本发明进行详细说明。实施例一参见附图1，本发明实施例一提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统包括包含微分干涉相衬成像模块的显微镜14，包含微分干涉相衬成像模块的显微镜14包括依次设
置的第V透镜15、第II反射镜16、偏振片17、|波片18、第I棱镜19、聚光镜20、样品台21、 4
物镜22、第II棱镜23、分析片24、筒镜25。该成像系统还包括光源1、第I透镜2、第I反射镜5、空间光调制器7、第III透镜8、挡光板9、第IV透镜13和(XD。空间光调制器7的入射角度< 10°，空间光调制器7每个方向具有三个相位，挡光板9用于阻挡O级光10而允许+1级光11和-1级光12通过或者阻挡+1级光11和-1级光12而允许O级光10通过。由光源I发射的光依次经过第I透镜2、第I反射镜5、空间光调制器7、第III透镜8、挡光板9、第IV透镜13后经过包含微分干涉相衬成像模块的显微镜14后，图像由CXD接收。实施例二参见附图2，本发明实施例二提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统与本发明实施例一提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统的区别仅在于，于第I透镜2和第I反射镜5之间还依次设置有第I光阑3和第II透镜4，第I反射镜5和空间光调制器7之间还设置有第II光阑6。由光源I发射的光依次经过第I透镜2、第I光阑3、第II透镜4、第I反射镜5、第II光阑6、空间光调制器7、第III透镜8、挡光板9、第IV透镜13后经过包含微分干涉相衬成像模块的显微镜14后，图像由CXD接收。从而提高光源I的有效利用强度。其中，作为光源I的一种具体的实现方式，光源I可以为LED光源。其中，作为空间光调制器7的一种具体的实现方式，空间光调制器7的照明方向包括90° (其三个相位的控制图像分别如图3 5所示)和0° (其三个相位的图像分别如图6 8所示)。本发明提供的成像系统的显微成像方法包括以下步骤步骤S1:对采集到的原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响。步骤S2 :对图像边缘进行轻微切趾，使得由离散傅里叶变换产生边缘伪像最少。步骤S3 :对图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息。步骤S4 :由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3X3的线性方程组，分离出O级，+1级和-1级频谱成像信息。步骤S5 由分离出O级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率kQ与初始相位Φ。步骤S6 :将分离出的+1级频谱平移+Iv将分离出的和-1级频谱平移-1v步骤S7 :将平移后的+1级和-1级频谱与O级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽。
步骤S8 :对步骤S7得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得超分辨的微分干涉相衬图像。为了测试本发明提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统及显微成像方法得到的图像分辨率的提高，图9a 9f显示了 53nm聚苯乙烯小球样品结构光照明超分辨微分干涉相衬和传统微分干涉相衬显微成像同一视场的图像。其中，传统微分干涉相衬成像是通过使用上述提到的O级光作为均匀照明光源获得的。本发明提供实施例提供的超分辨微分干涉相衬成像明显地扩大了相干传递函数(见图9a和图9d)，因此相应的频谱也扩宽了。因此本发明提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统及显微成像方法得到的图像显示了更优的分辨率。在传统微分干涉相衬成像中无法分辨开的靠的很近的两个小球，在本发明提供的超分辨微分干涉相衬成像中可以很容易分辨为两个小球(见图％和9e中白线框所框出的部分)。为了定量表明分辨率的提高，图9c和9f显示了本发明提供的超分辨微分干涉相衬成像与传统微分干涉相衬成像沿图％和9e中白虚线框所框出的部分单个小球的强度分布，并做高斯拟合。拟合结果显示本发明提供的超分辨微分干涉相衬成像的半高全宽为190± 18nm,而传统微分干涉相衬成像的半高全宽为380±17nm。故本发明提供的超分辨微分干涉相衬成像分辨率突破了衍射极限，约为传统微分干涉相衬成像衍射极限的两倍。本发明实施例提供的超分辨微分干涉相衬显微成像系统及成像方法避免了结构光照明荧光显微超分辨成像中样品制备过程及可能由样品制备带来光漂白和光毒性等副效应，同时解决了结构光照明散射光成像低成像对比度的问题，从而实现了对没经过任何处理的生物样品进行高对比度的超分辨成像。以上所述的具体实施方式
，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式
而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种超分辨微分干涉相衬显微成像系统，包括包含微分干涉相衬成像模块的显微镜，其特征在于，还包括光源、第I透镜、第I反射镜、空间光调制器、第III透镜、挡光板、第IV透镜和CCD，所述空间光调制器的入射角度< 10°，所述空间光调制器每个方向具有三个相位， 所述挡光板用于阻挡O级光而允许+1级光和-1级光通过或者阻挡+1级光和-1级光而允许O级光通过，由所述光源发射的光依次经过第I透镜、第I反射镜、空间光调制器、第III透镜、挡光板、第IV透镜后经过所述包含微分干涉相衬成像模块的显微镜后，图像由所述CXD接收。
2.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述第I透镜和第I反射镜之间还依次设置有第I光阑和第II透镜，由所述光源发射的光依次经过第I透镜、第I光阑、第II透镜、第I反射镜、空间光调制器、第III透镜、挡光板、第IV透镜后经过所述包含微分干涉相衬成像模块的显微镜后，图像由所述C⑶接收。
3.根据权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述第I反射镜和空间光调制器之间还设置有第II光阑，由所述光源发射的光依次经过第I透镜、第I光阑、第II透镜、第I反射镜、第II光阑、 空间光调制器、第III透镜、挡光板、第IV透镜后经过所述包含微分干涉相衬成像模块的显微镜后，图像由所述CCD接收。
4.根据权利要求1 3中任一所述的成像系统，其特征在于，所述光源为LED光源。
5.根据权利要求1 3中任一所述的成像系统，其特征在于，所述空间光调制器的照明方向包括90°和0°。
6.基于权利要求1 5中任一所述的成像系统的显微成像方法包括以下步骤步骤S1:对采集到的原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；步骤S2 :对图像边缘进行轻微切趾，使得由离散傅里叶变换产生边缘伪像最少；步骤S3 :对图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；步骤S4 :由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3X3的线性方程组，分离出O 级，+1级和_1级频谱成像信息；步骤S5 :由分离出O级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率kQ与初始相位Φ ；步骤S6 :将分离出的+1级频谱平移+1 ，将分离出的和-1级频谱平移-1 ；步骤S7 :将平移后的+1级和-1级频谱与O级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；步骤S8 :对步骤S7得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得超分辨的微分干涉相衬图
全文摘要
本发明公开了一种超分辨微分干涉相衬显微成像系统，包括包含微分干涉相衬成像模块的显微镜，还包括光源、第Ⅰ透镜、第Ⅰ反射镜、空间光调制器、第Ⅲ透镜、挡光板、第Ⅳ透镜和CCD。同时，本发明还公开了基于该成像系统的显微成像方法。该成像系统及成像方法无需额外的样品制备过程，无光漂白效应和光毒性效应，且成像对比度高。
文档编号G02B21/36GK102998789SQ20121059317
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者曾绍群, 陈建玲, 吕晓华 申请人:华中科技大学