测定与红细胞相关的物理参数的制作方法
【专利摘要】提供了一种基于数字全息术来测定至少一个红细胞的参数的方法，所述方法包括以下步骤：构建包括表示所述至少一个红细胞的波前的干涉图样，所述干涉图样由所述至少一个红细胞和电磁辐射的相互作用产生，根据所述干涉图样对表示所述至少一个红细胞波前的振幅信息和相位信息进行重构，以及通过对表示所述至少一个红细胞的相位信息和振幅信息进行组合，来测定所述至少一个红细胞的平均红细胞体积和/或平均红细胞血红蛋白浓度和/或氧饱和度和/或平均红细胞血红蛋白。
【专利说明】测定与红细胞相关的物理参数
[0001]发明的【技术领域】
[0002]本发明涉及一种基于数字全息术来测定与红细胞相关的物理参数的方法和设备。【背景技术】
[0003]出于诊断的目的，通常使用的工具为全血细胞计数(CBC)。CBC可以分为用于分析的三个重要的细胞类型，即，白细胞(白血球)、红细胞(红血球)和血小板(凝血细胞)。通过测定红细胞的重要特征(例如平均红细胞体积(MCV)-红细胞的平均体积、红细胞分布宽度(RDff)-红细胞群变异的测量、平均红细胞血红蛋白(MCH)-每个红细胞的平均血红蛋白量、氧饱和度(Stj2)-红细胞中氧所占据的血红蛋白结合位点的比例测量和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)-红细胞中血红蛋白的平均浓度)，可以诊断多种疾病。例如基于MCV的值是否高于或低于预期的正常范围，贫血被分为小红血球性贫血或巨红血球性贫血。目前，这些参数可以通过复杂且昂贵的系统来测量，例如流式细胞仪和共聚焦激光扫描显微镜，或仅能够测量一个参数的系统(例如阻抗体积分析仪)。
[0004]Rappaz 等人的文章“Comparative Study of Human Erythrocytes byDigital Holographic Microscopy,Confocal Microscopy,and Impedance VolumeAnalyzer，，(Journal of the International Society for Advancement ofCytometry, 73A:895_903，2008)中描述的一项技术，说明了数字全息显微镜技术结合去耦过程对于折射率和完整的单个红血球体积的测量的适用性。Rappaz等人的文章“Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of livingcells with digital holographic microscopy” (OPTICS EXPRESS，Vol.13，N0.23，936-9373，2005)进一步对去耦过程做了更详细地解释，其中包含名为“去耦过程”的实验方案，其目的在于根据活细胞的定量相位图像分别测量整体折射率和细胞厚度。
[0005]因此，为了计算红细胞参数(例如MCV和/或MCHC和/或RDW和/或Stj2和/或MCH),必须配制红细胞溶液，并将该红细胞溶液与第二溶液进行交换，其中这两种溶液的折射率必须是已知的。这种方法费力且耗时，对实验技能(例如红细胞不能受到污染)要求高。此外，交换溶液的过程是在测量中通过用户交互增加意外风险的另一步骤。事实上，交换溶液时的另一缺点是，存在于第一溶液样品中的所有红细胞在冲洗掉第一溶液并用第二溶液替换后将可能不再存在，这意味着将会有样品的丢失或污染。溶液交换过程中红细胞的减少，归因于在进行首次测量前红细胞需要沉淀并粘附在观察容器上。如果红细胞不能适当地粘附，它们将松开并随第一溶液冲洗掉和/或移动到新的位置并粘附在观察容器上。这将由于引入伪像，因此影响红细胞的重构波前的质量。此外，流体的交换和存在可能以不希望的方式影响红细胞的形态和/或预期的行为。观察容器也必须只能使用一次，以便不会对测量造成污染(例如通过稀释和/或混合溶液从而影响折射率使其成为未知而非假设的已知因数)。此外，使用所需精度在纳米范围内的一次性消耗品生产具有特定高度的观察容器是非常困难的。
[0006]因此，一种测定上述参数的改进方法是有利的，并且特别是更快、更容易和更可靠的方法是所期望的。
【发明内容】
[0007]因此，本发明寻求单独地或以任何组合的方式来减轻、缓和或消除一个或多个上述缺点。特别地，本发明的一个目的可以为在不需要交换溶液和/或存在溶液的情况下，测定红细胞的平均红细胞体积、红细胞分布宽度、平均红细胞血红蛋白、氧饱和度和平均红细胞血红蛋白浓度。
[0008]根据本发明的第一方面，上述及其他目的通过一种基于数字全息术来测定至少一个红细胞的参数的方法来解决，该方法包括以下步骤:
[0009]构建包括表示所述至少一个红细胞的波前的干涉图样，所述干涉图样由所述至少一个红细胞和电磁辐射的相互作用产生；
[0010]根据所述干涉图样对表示所述至少一个红细胞波前的振幅信息和相位信息进行重构；以及
[0011]通过对表示所述至少一个红细胞的相位信息和振幅信息进行组合，来测定所述至少一个红细胞的平均红细胞体积和/或平均红细胞血红蛋白浓度和/或氧饱和度和/或平均红细胞血红蛋白。
[0012]文章“Comparative Study of Human Erythrocytes by Digital HolographicMicroscopy, Confocal Microscopy, and Impedance Volume Analyzer，，中公开了一种不涉及或使用振幅信息的方法。Rappaz等人的文章中所建议的方法涉及使用在使用不同的样品液体时获得的两个不同的图像，并利用这些图像的差异能够测定平均红细胞体积和平均红细胞血红蛋白。然而，本发明涉及一种将振幅信息和相位信息结合起来使用的方法，其创建了仅从一个图像(即不使用例如不同的细胞液体)测定参数的基础。本发明的此优点及其他优点在下面进一步公开。
[0013]通过本发明的方法，通过使用两个或多个波长的重构的振幅信息和/或相位信息来测定氧饱和度。
[0014]本发明的方法在不需要交换溶液和/或存在溶液的情况下，能够测定红细胞的平均红细胞体积、红细胞分布宽度、平均红细胞血红蛋白、氧饱和度和平均红细胞血红蛋白浓度。Rappaz等人的方法并非如此。另外，通过去除交换溶液的过程，显著降低了对用户所需的实验技能的要求，且由于用户处理不当而造成样品污染的风险也降低了。此外，不需要交换溶液，减少了测定所述参数的时间，原因在于根据本发明的方法仅需对干涉图样进行一次检测并对表示至少一个红细胞的振幅信息和相位信息进行重构来测定所述参数。本发明的方法从而可以以非常快的速率来研究现象，其中该速率主要取决于检测干涉图样的数字检测器的获取速率。
[0015]根据本发明，使用了振幅信息和相位信息二者。因此可以直接根据一个图像来确定每个像素的厚度进而折射率。由于折射率应仅取决于血红蛋白，根据本发明可以从血液中测定所需的参数，例如红细胞的平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度、氧饱和度或平均红细胞血红蛋白。因此，根据本发明的一个特定实施例，对表示所述至少一个红细胞的相位信息和振幅信息进行组合，涉及测定包含至少一个红细胞的样品的折射率。根据又一实施例，所述方法通过仅创建一个用于测定所述参数的图像来实施。下面对此进行进一步讨论。
[0016]另外，本发明的方法去除了对一次性观察容器的需要和将红细胞粘附到所述观测容器上的需要。而且，在根据本发明的方法中，由于单次检测的要求，去除了在交换溶液时由于红细胞的可能移动或从观察容器中冲洗掉而引起的伪像。根据本发明的方法，由于使用了振幅信息和相位信息，不需要具有明确高度的观察容器和具有已知折射率的溶液。该方法由于能够促使流体结合至少一个红细胞，还允许至少一个红细胞存活于类似体内的环境中。
[0017]根据第二方面，提供了一种用于基于数字全息术来分析包含至少一个红细胞的样品的装置。该装置包括:至少一个光源，其被布置为创建至少一个物体光束和至少一个基准光束，其中所述至少一个物体光束和所述至少一个基准光束是相互相干的；用于将所述样品暴露于所述至少一个物体光束的工具；用于将通过了所述样品的所述至少一个物体光束和所述至少一个基准光束进行叠加从而产生干涉图样的装置；被布置为检测所述干涉图样的传感器；及处理单元，其被布置为根据所述干涉图样对表示所述至少一个红细胞的物体波前的相位信息和/或振幅信息进行重构，以及根据所述相位信息和/或振幅信息对平均红细胞体积和/或平均红细胞血红蛋白浓度和/或平均红细胞血红蛋白和/或氧饱和度进行测定
[0018]第一方面的特征和优点一般适用于第二方面。下面更详细地公开了本发明的其他特征和优点。 【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是根据本发明的方法的流程图。
[0020]图2是在透明生物体通过前后的物体光束的波前的示意图。
[0021]图3是根据本发明的红细胞模型的一个实施例和方法的概念性示意图。
[0022]图4是根据本发明的一个实施例的装置的示意图。
[0023]本发明的优选实施方式的详细描述
[0024]如图1中的流程图所示，提供了一种基于数字全息术来测定至少一个红细胞的参数的方法，所述方法包含以下步骤:
[0025].构建干涉图样，所述干涉图样包含表示所述至少一个红细胞的波前，所述干涉图样由所述至少一个红细胞和电磁辐射的相互作用产生；
[0026]?根据所述干涉图样对表示所述至少一个红细胞波前的振幅信息和相位信息进行重构；以及
[0027].通过对表示所述至少一个红细胞的相位信息和振幅信息进行组合，来测定所述至少一个红细胞的平均红细胞体积和/或平均红细胞血红蛋白浓度和/或氧饱和度和/或平均红细胞血红蛋白。
[0028]根据本发明的方法的一个特定实施例，电磁辐射具有在可见光谱范围内的波长。根据本发明的方法的其他实施例，可以使用例如在红外和/或X射线和/或紫外光谱范围内的电磁辐射。电磁辐射由能够辐射至少一个波长的辐射源产生。例如，产生在光谱范围内的辐射的电磁辐射源可以是例如任何类型的激光源，例如二极管或He-Ne激光器。优选使用二极管激光器。[0029]在根据本发明的方法的一个实施例中，相互相干的至少一个物体光束和至少一个基准光束，是通过将从相干光源发出的光束分成两个光束(例如通过分束器)生成的。物体光束和基准光束是相互相干的，这意味着它们在这一过程内具有相同的频率且具有恒定的相位关系。
[0030]物体光束穿过包含在观察容器中和/或上的至少一个红细胞，该观察容器适于包含所述至少一个红细胞且能够允许电磁辐射穿过所述观察容器和包含在观察容器中和/或上的所述至少一个红细胞。观察容器优选能够允许电磁辐射穿过观察容器且对辐射没有或具有很小的影响或具有已知的辐射干扰效应。观察容器还可以包含能够突出显示至少一个红细胞的所需物理特性(例如形态变化和/或折射率变化)的介质。观察容器还可以包含使至少一个红细胞保持在所需状态(例如在磷酸盐缓冲盐水和/或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水和/或Hank’s缓冲盐溶液和/或细胞生长培养基(例如在有或无补充剂的RPMI1640)的溶液中保持死的和/或活的和/或生长的和/或萎缩的状态)的介质。
[0031]基准光束不受包含在观察容器中和/或上的至少一个红细胞的影响，原因在于基准光束是沿与物体光束不同的光路引导的(例如通过反射镜或光纤)。
[0032]如图2所示，物体光束50在穿过包含在观察容器58中和/上的至少一个红细胞55之前具有已知的波前51。当物体光束50穿过至少一个红细胞55时，至少一个红细胞55将吸收物体光束的至少一部分强度，并且物体光束50由于其穿过至少一个红细胞55，与周围光束相比将经历一个光程长度差。由已知的物体光束波前51和至少一个红细胞55之间的相互作用产生的物体波前52将因此发生相移，且其振幅将受到来自至少一个红细胞55的吸收的影响。类似地，基准光束(未示出)也具有已知的波前，该波前因此不受至少一个红细胞的影响。光路被定义为物理/几何厚度乘以折射率。吸收被定义为通过红细胞由于波传播转换到其他类型能量的电磁辐射能。
[0033]在根据本发明的方法的一个实施例中，已穿过包含在观察容器中和/或上的至少一个红细胞的至少一个物体光束与至少一个基准光束的叠加，是通过将两个光束合并在一起(例如通过另一个分束器)来实现的。至少一个红细胞和电磁辐射的相互作用和叠加产生干涉图样，该干涉图样中包含关于表示至少一个红细胞的物体波前的信息。
[0034]在根据本发明的方法的一个实施例中，干涉图样通过数字传感器(例如电荷耦合器件(CXD)或互补金属氧化物半导体(CMOS))进行检测。所检测的干涉图样也称为全息图。
[0035]例如可以使用夫浪和费(Fraunhofer)或傅立叶(Fourier)或菲涅耳(Fresnel)装置，来叠加已穿过至少一个红细胞的至少一个物体光束和至少一个基准光束，从而生成干涉图样，并检测该干涉图样。优选使用菲涅耳装置。所述三种装置之间的差别在于光学配置满足允许表示所述至少一个红细胞的波前的重构近似值的某些条件。在菲涅耳装置中需满足的允许重构波前的近似值的条件是传感器与至少一个红细胞之间的距离与至少一个红细胞的尺寸和传感器的尺寸相比较大。这可通过使用显微镜物镜来实现，该显微镜物镜收集来自所述至少一个红细胞的散射光并将其以几乎平行的光束引导至所述数字传感器，从而形成一个光学结构，其中至少一个红细胞和数字传感器之间的距离与至少一个红细胞的尺寸和传感器的尺寸相比较大。
[0036]根据所检测的干涉图样，对物体波前的振幅信息和相位信息进行重构。重构通过任何常见的数值重构过程来实现，例如傅立叶变换重构和/或菲涅耳变换重构和/或角频谱重构和/或卷积重构和/或小波重构。表示所述至少一个红细胞的重构的振幅信息和相位信息可以在例如每个域、振幅或相位中进行表示，在至少一个红细胞信息的二维空间内表示为图像和/或图谱，和/或在三维空间内表示为3D表象。重构的信息优选表示为图像。
[0037]重构的信息还用于由计算机执行的图像处理，来测定有关至少一个红细胞的参数，例如平均红细胞体积、红细胞分布宽度、平均红细胞血红蛋白、氧饱和度和平均红细胞血红蛋白浓度。若干获得的图像也可以进一步用于图像处理以测定有关所研究的至少一个红细胞的其他有用信息。所述若干图像可以在不同的时间点获得并存储，以进行之后的图像处理和重构，这意味着根据本发明的方法与时间无关。这样的图像处理可能涉及到其中至少一个红细胞被定位的分割算法。这些被定位的至少一个红细胞可以进行进一步的形态分析，例如关于它们的宽度、形状等。可以使用的分割算法是分水岭分割和/或梯度分析，但可以使用用于检测和/或在图像中描绘至少一个红细胞的轮廓的任何类型的算法。优选使用分水岭分割。
[0038]或者，为了生成一个基准光束和一个物体光束，可以使用其他类型的数字全息术装置来产生干涉图样，例如在同轴数字全息术中利用了生成和使用一个光束。在研究本说明书时，如何修改本发明的方法以便将其用于例如同轴数字全息术中，对本领域技术人员来说是明显的。
[0039]当测定红细胞的参数(例如平均红细胞体积和/或红细胞分布宽度和/或和/或平均红细胞血红蛋白和/或氧饱和度和/或平均红细胞血红蛋白浓度)时，红细胞根据光学视图通常被模拟为，主要包含血红蛋白、盐和包含在厚度可忽略的透明细胞膜中的其他有机化合物的均匀的水溶液。水和血红蛋白分子占据了大于95%的红细胞体积。因此，对于使用前向光散射的技术(例如流式细胞仪、相差显微镜和数字全息术)，红细胞的特征可表示为体积V和复合折射率n。= Iir-1iiο由于红细胞的内部几乎完全由水和血红蛋白占据，红细胞之间的折射率η。的变化可以只归因于血红蛋白浓度的变化。
[0040]通过应用上述模型，米式散射理论是适用的，并且包含在由电磁辐射和至少一个红细胞之间的相互作用产生的干涉图样中的物体波前可以通过数字传感器进行检测。这使得在重构表示至少一个红细胞的所述物体波前时，可以测定与红细胞相关的所述参数。此种常用的红细胞模型和米式散射理论使用中的问题在于，重构的波前取决于两个未知参数，体积V和复合折射率η。和其他已知参数。这意味着这个或一个重构的波前包含以非明显的方式混合的两个未知参数。
[0041]图3中示出了根据本发明的方法的概念性示意图。为了简单起见，下文将关于一个红细胞进行描述，但根据本发明的方法并不限于一个红细胞，而是优选至少一个红细胞。波前40在其穿过至少一个红细胞45之前是已知的，亦如图2 (51，55)所示。在已知波前41 (物体波前)的至少一部分之后已穿过所述至少一个红细胞45后，物体波前由于光程差Cnery.1，与未穿过所述至少一个红细胞45的波前40的至少一部分的光程，nm.I相比)将发生相移，物体波前41与已知的波前40相比，也会受到来自至少一个红细胞的吸收1的影响。
[0042]下面，将描述一种用于测定本发明所关注的参数的可行方法。
[0043]在根据本发明的方法的一个实施例中，红细胞的折射率被建模为:
[0044]nery = nQ+ach (I)[0045]其中，Iitl是红细胞在缺乏血红蛋白时的折射率，α是在特定波长处血红蛋白的折射率增量，Ch是血红蛋白浓度。此外，比尔一朗伯定律表明，吸收液体和非吸收液体的混合物的电磁辐射传输(Α)，与吸收液体的浓度(C)和所述电磁辐射穿过所述吸收液体的距离
(I)成正比:
【权利要求】
1.一种基于数字全息术来测定至少一个红细胞的参数的方法，所述方法包括以下步骤: ?构建包含表示所述至少一个红细胞的波前的干涉图样，所述干涉图样由所述至少一个红细胞和电磁辐射的相互作用产生； ?根据所述干涉图样对表示所述至少一个红细胞波前的振幅信息和相位信息进行重构；以及 ?通过对表示所述至少一个红细胞的相位信息和振幅信息进行组合来测定至少一个红细胞的平均红细胞体积和/或平均红细胞血红蛋白浓度和/或氧饱和度和/或平均红细胞血红蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对表示所述至少一个红细胞的相位信息和振幅信息进行组合涉及测定包含所述至少一个红细胞的样品的折射率。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法通过仅创建一个图像来实施，所述一个图像用于通过对表示所述至少一个红细胞的相位信息和振幅信息进行组合来测定至少一个红细胞的平均红细胞体积和/或平均红细胞血红蛋白浓度和/或氧饱和度和/或平均红细胞血红蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述平均红细胞体积通过以下等式来确定:
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述平均红细胞血红蛋白浓度通过以下等式来确定:
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述平均红细胞血红蛋白通过以下等式来确定:
MCH = MCV.MCHC。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中氧饱和度通过以下等式来确定:
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中来自至少两个波长的表示至少一个红细胞的重构的振幅信息和/或相位信息用于测定氧饱和度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中氧饱和度(S)通过以下等式来确定:
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射具有在可见光谱范围内的波长。
11.一种用于通过数字全息术分析包含至少一个红细胞的样品的装置，所述装置包括: 至少一个光源，所述至少一个光源被布置为产生至少一个物体光束和至少一个基准光束，其中所述至少一个物体光束和所述至少一个基准光束是相互相干的； ?用于将所述样品暴露于所述至少一个物体光束的工具； ?用于对通过了所述样品的所述至少一个物体光束和所述至少一个基准光束进行叠加从而产生干涉图样的工具； ?被布置为检测所述干涉图样的传感器；及 ?处理单元，所述处理单元被布置为根据所述干涉图样对表示所述至少一个红细胞的物体波前的相位信息和/或振幅信息进行重构，以及根据所述相位信息和/或振幅信息对平均红细胞体积和/或平均红细胞血红蛋白和/或氧饱和度和/或平均红细胞血红蛋白浓度进行测定。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述处理单元包括对红细胞分布的测定。
13.根据权利要求11或12所述的装置，其中所述处理单元包括通过使用至少两个波长的、表示至少一个红细胞的重构的相位信息和/或振幅信息对氧饱和度的测定。
14.根据权利要 求13所述的装置，其中使用了至少两个波长。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的装置，还包括环境舱，其中所述至少一个光源、所述用于暴露的工具、所述用于叠加的工具以及所述传感器位于所述培养箱内部。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的装置，其中所述处理单元位于所述环境舱外部，并且所述装置还包括被布置为将所述干涉图样从所述传感器传送到所述处理单元的发送器。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的装置，还包括控制器，所述控制器用于控制所述环境舱内部的湿度、温度和二氧化碳百分比中的至少一项。
【文档编号】G03H1/08GK103620509SQ201280007685
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年2月15日 优先权日:2011年2月16日
【发明者】彼得·埃格尔伯格, M·西贝斯塔, 安德斯·伊萨克森 申请人:相位全息成像Phi有限公司