本发明涉及根据权利要求1的前序部分的确定对比图像的显微术方法并且涉及根据权利要求8的前序部分的显微镜。
背景技术：
为了特别在光-光学显微镜中能够将低对比度物体成像，例如使用相位对比方法或者微分干涉对比(dic)。这些需要在光路中布置两个昂贵的沃拉斯顿(wollaston)或诺马斯基(nomarski)棱镜以及两个偏振器。此外，必须将多个光学元件引入到照明束路径和成像束路径二者中，使得这样的显微镜更难以与其他方法(例如荧光显微术)灵活地结合使用。
ep2645146b1公开了一种用光显微镜记录图像的方法，其中将照明光指引到样品上，并且将切割照明光的光圈引入到照明光的束路径中。在第一光圈设定中，一部分束路径的横截面被覆盖，在第二光圈设定中，第二部分束路径的横截面被覆盖。在每个光圈的设定的情况下，记录图像并且在计算上结合图像来创建对比图像。在这种情况下，该方法用于补偿照明光的横截面区域的限制的目的，该限制由包含样品的样品容器的壁引起。可以通过光圈电机将光圈枢转到束路径中。ep2645146b1还公开了光显微镜，该光显微镜设计为执行该方法并且具有可以枢转到束路径中的光圈。
技术实现要素：
本发明基于提出与现有技术相比得到改进的显微术方法的目的。本发明还基于提出与现有技术相比得到改进的显微镜的目的。
关于显微术方法，该目的由独立权利要求1的特征来实现。关于该显微镜，该目的由独立权利要求8的特征来实现。
有利的实施例是从属权利要求的主题。
在显微术方法的情况下，将照明辐射指引到布置在显微镜的物平面中的物体上，以通过从物平面获得的物体辐射来成像物体。在这种情况下，物体的第一图像的图像数据用显微镜的第一构造获取，且物体的第二图像的图像数据用显微镜的第二构造获取，并且确定第一图像和第二图像的图像数据之间的差值。根据所确定的差值，例如绝对差值，提供物体的对比图像的图像数据。
根据本发明的显微术方法特征在于，在第一构造中，相位掩模布置在显微镜的光瞳中，该相位掩模具有关于显微镜的光轴横向的光学梯度。由相位掩模的效应，产生或者可以产生物体辐射的相位梯度。在第二构造中，将相位掩模从光瞳移除。因此以显微镜的第一构造和第二构造执行根据本发明的显微术方法。
通过相位掩模的效应，相对于物体辐射的相位和/或其振幅可以改变或者已经改变该物体辐射，为简单起见总结为术语相位梯度。
物体辐射被理解为意味着：照明辐射的已经穿过物体且已经与物体相互作用并且通过其物体可能已经改变的部分，和照明辐射的不通过物体但是从物平面获得的部分二者。物体辐射是从物平面获得的(例如获取的和/或收集的)照明辐射。
显微术方法特别是透射光显微术方法，其中照明辐射的至少部分穿过物体并且被获取作为物体辐射。
物体是例如形式为生物制品的样品，例如组织、细胞和/或细胞器官。
如果物体自身具有光学梯度或者由其尺寸、局部相位差、折射率改变和/或由材料构成已经引入物体的光学梯度，则物体辐射可以具有相位梯度。
图像数据优选地以空间分辨形式来获取，其中它们各分配或可以分配到物平面的点和/或区域。例如，单独的图像数据可以在显示器上表示为图像的图像元素(像素、图片元素)。
在显微镜的光瞳中，存在物平面的图像的傅里叶变换。
相位掩模是光学元件，通过其效应改变或者可以改变穿过相位掩模的辐射(特别是物体辐射)的相位和/或振幅。
相位掩模的光学梯度例如由特别是关于光轴横向地具有改变的厚度和/或改变的折射率的相位掩模来形成。在这种情况下，厚度可以实际上改变，例如增大或减小。在其它实施例中，它还可以在例如增加或减少光学厚度的意义下改变。
由相位掩模的效应，特别是由相位掩模的光学梯度的效应，产生或可以产生穿过相位掩模的物体辐射的相位梯度。在光学梯度的区域中穿过相位掩模的物体辐射至少在横向于光轴的方向上具有该物体辐射相位和/或振幅的梯度(相位梯度)。
在显微镜的第二构造中，将相位掩模从光瞳移除。在这种情况下，至少相对于物体辐射，实际上可以已经物理地移除相位掩模或使相位掩模的光学效应停止。用显微镜的第二构造，获取宽场图像的图像数据。这些图像数据可以与包含由相位掩模引起的相位梯度的图像数据进行比较，并且可以确定差别。在这种情况下使用宽场图像作为未受影响的图像或未受影响的图像数据的参考。
图像数据之间的差值可以确定为绝对差值。在其它实施例中，它们还可以确定为形式为关系或百分比的相对差值。以适合于根据本发明的显微术方法的应用的一些其他形式来确定差值也是可能的。
为了补偿吸收损失，在显微术方法的其他实施例中将第一和第二图像的图像数据归一化和/或缩放。在这种情况下，例如，补偿发生在相位掩模中的吸收损失。
在显微术方法的其他实施例中，根据图像数据的所确定的绝对差值来产生，特别是计算反向对比图像。在反向对比图像的情况下，示出了与对比图像的情况相反的明暗分布。
根据物体的和/或光学系统的光学性质，有利地选择相位掩模的光学梯度，由此可以实现与预期的应用对应的对比图像的质量。
在显微术方法的其他实施例中，获取多个第一和/或第二图像的图像数据是可能的。所选择的第一和第二图像可以用于确定差值。在确定差值之前校正该第一和/或第二图像也是可能的，例如抑制强度峰或丢弃图像也是可能的。
根据本发明的显微术方法可以与其他成像方法有利地结合，特别是与其他显微术方法有利地结合。在有利实施例中，通过第一构造和第二构造与多个获取过程交替来进行图像数据的获取，该多个获取过程用显微镜的第三构造执行。这种显微镜的第三构造例如是荧光获取和/或其中不获取透射光的获取过程。
在一个可能实施例中，显微术方法可以用于根据对比图像的图像数据来执行物体的状态的分析。出于该目的，将对比图像的图像数据的至少一个子集与目标数据进行比较。优选地自动执行对比过程，并且可以优选地与所获取的实际数据一起，例如通过叠加、覆盖和/或在显示器上显示目标数据来进行该比较过程。目标数据与实际数据的比较是可视的，但是也可以通过使用适当的算法以自动的方式比较和评估目标数据和实际数据的偏离来进行该比较。
这样的状态分析可以有利地与执行其他成像过程结合。例如，在通过第三构造的多个获取过程之后，可以检查物体的状态，其中通过第一构造和第二构造来获取图像数据并通过对比图像来确定图像数据，并且评估至少一个对比图像。
如果在这样的数据分析下，发现物体的不需要的或过多的提前退化，则随后将要通过第三构造执行的获取过程可以被对应地修改或者防止其他获取过程，以例如节省时间和成本。
还可以由显微镜实现该目的。显微镜包括光源、聚光器、物镜单元、成像单元和获取单元，该光源提供照明辐射，该聚光器在物平面中聚焦照明辐射，该物镜单元在显微镜的光轴的方向上将从物平面获得的物体辐射收集并且将其成像在像侧光瞳中，该成像单元将物体辐射成像在像平面中，以及该获取单元在像平面中空间上分辨地获取图像数据。
根据本发明的显微镜特征在于：相位掩模布置在光瞳中或者存在设计为将相位掩模移进或移出光瞳的给送装置，该相位掩模具有至少一个光学梯度，该光学梯度关于光轴横向地形成，并且由该光学梯度的效应来产生或可以产生物体辐射的相位梯度。
物镜单元和成像单元各由至少一个光学透镜构成。
在显微镜的其他可能实施例中，将至少两个相位掩模保持在改变装置中，可以单独地选择该至少两个相位掩模并且可以通过给送装置将其移进或移出光瞳。这样的改变装置使得灵活地选择并使用具有光学梯度的不同程度和/或(多个)不同方向的光学梯度的相位掩模是可能的。
在其他实施例中，将相位掩模分成子区域，并且子区域中的至少一个具有与其他子区域相比偏离的梯度。有利地对称地进行相位掩模的划分。这样的实施例降低了在特定方向上相位梯度的加强，正如在微分干涉对比的方法的情况下所发生的，在此还称为“剪切方向”。
相位掩模可以关于平行于光轴延的伸旋转轴线是可旋转的。由此同样地降低或者甚至避免相位梯度的前述方向性的加强。然后位于光瞳中的相位掩模的安装针对相位掩模的旋转，优选地控制的旋转来设计。
相位掩模例如形成为对于物体辐射透明的元件，诸如楔形物、双楔形物或不同形状的元件。
在显微镜的其他可能实施例中，相位掩模由至少两个反射镜的倾斜反射镜表面和/或由可形变反射镜来形成。还可以形成为液晶元件或空间光调制器。可形变反射镜、液晶元件或空间光调制器是有利地可调整的，以引起不同光学梯度以及以可以设定或调整期望的光学梯度。
在其它实施例中，显微镜具有评估由获取单元获取的图像数据的评估单元，该评估单元设计为，特别是配置为确定相位掩模布置在光瞳中的情况下获取的至少一个数据集合和没有布置在光瞳中的相位掩模的情况下获取的参考数据集合之间的辐射数值的差值。
根据本发明的显微术方法可以毫不费力地执行。此外，在装备侧，仅需将显微镜稍微修改，因为已经或是将要将仅有一个光学元件(也就是相位掩模)引入到束路径中。
该方法是边缘选择的，并且使得与现有技术比较的对比图像的改进分辨率是可能的。此外，相对于可实现的分辨率来改进光学切割(分割)。
关于光瞳的相位掩模的具体定位可以由公差来实现，而不会相当大地影响显微镜的功能和方法的可行性。
因为相位掩模布置在光瞳中，所以不发生信号损失，如不利的在根据现有技术的解决方案中的情况。因此，在ep2645146b1中所述的半光瞳方法的情况下，抑制了透射光的部分，也就是说物体辐射的部分。
在根据本发明的显微术方法的实施例的情况下，整个数值孔径用于产生每个图像的图像数据，然而在根据现有技术的半光瞳方法的情况下仅使用一半的数值孔径。因为使用了整个数值孔径，分辨率和对比率比使用半个光瞳的方法更好。
例如除了通过荧光方法成像，根据本发明的显微术方法使得在显微术中低对比度物体的简单可视化是可能的。例如，在透射光中，将例如细胞或组织切片的物体以其整体成像，并且还分析其状态，因为，由于例如某一蛋白或蛋白复合物的可染色性的特异性，而实际荧光显微镜不对此提供任何信息。
与经典dic相比，提出的对比方法不是基于干涉的。这导致对光学切割的更高潜力，也就是说仅仅从物镜的景深区域来表示对比度。在经典dic情况下，在照明辐射的总体通道穿过物体期间在偏振上分离的部分束路径的相位差累积，由此不期望的暗或明区域可以发生在对比图像中。
在根据本发明的显微术方法的情况下，所产生的图像信息实质上源自所使用物镜的景深区域，因为包含在第一图像和第二图像中的图像数据在非常离焦的情况下实际上是相同的。
根据本发明的显微术方法(其还可以称为相位掩模对比方法)特别地适合于将(例如边缘、轮廓和/或细丝的)短线性尺度上高频相位改变进行成像。在物平面中(例如物体中或中间图像中)的短线性尺度因为傅里叶变换而在光瞳中变成高空间频率。夸大其上所示出的相位改变的线性尺度取决于所给定的光学系统的情况，例如放大率和数值孔径，主要取决于物镜光瞳的光学梯度，并且因此还可以适应于不同的情况。
附图说明
下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明。附图中：
图1示出了根据现有技术的适合于产生对比图像的显微镜的示意图，
图2示出了根据本发明的显微镜的第一示例性实施例的示意图，
图3a示出了第一构造中的根据本发明的显微镜的第二示例性实施例的示意图，
图3b示出了第二构造中的根据本发明的显微镜的第二示例性实施例的示意图，
图4示出了根据本发明的显微镜的第三示例性实施例的示意图，
图5示出了根据本发明的显微镜的第四示例性实施例的示意图，
图6示出了根据本发明的显微镜的第五示例性实施例的示意图，
图7a示出了相位掩模的第一示例性实施例的俯视图的示意图，
图7b示出了相位掩模的第二示例性实施例的俯视图的示意图，
图7c示出了相位掩模的第三示例性实施例的俯视图的示意图，
图7d示出了相位掩模的第四示例性实施例的俯视图的示意图，
图8a示出了通过根据本发明的显微术方法获得的马铃薯细胞的淀粉颗粒的对比图像，以及
图8b示出了通过根据现有技术的显微术方法获得的淀粉颗粒的对比图像。
具体实施方式
在附图中，相同的元件设置有相同的附图标记。
在图1中表示根据现有技术设计为产生对比图像的显微镜1，并且该显微镜1具有光源2、聚光器4、物镜单元6、成像单元9和获取单元11，该光源2提供照明辐射3、该聚光器4在物平面5中聚焦照明辐射3、该物镜单元6在显微镜1的光轴7的方向中将从物平面5获得的物体辐射30收集并且将其成像在像侧光瞳8中、该成像单元9将物体辐射30成像在像平面10中以及该获取单元11在像平面10中空间上分辨地获取图像数据。因为照明辐射3穿过物体12，该物体12可选地存在在物平面5中，并且还因为该照明辐射3穿过在像平面10中的显微镜1的束路径，所以图像数据由物体辐射30引起。
图2中所示出的根据本发明的显微镜1的第一示例性实施例具有关于图1所指定的技术元件。此外，相位掩模13布置在光瞳8中。
相位掩模13由对照明辐射3是透明的材料(例如玻璃)来形成为楔形物，并且具有光学梯度og(用箭头表示)，其关于光轴7横向延伸且由相位掩模13的厚度的改变引起。根据相位掩模13上的入射点，照明辐射3必须沿着通过相位掩模13的不同长度的路径来传送。通过光学梯度og的效应，产生或可以产生已经穿过相位掩模13(物体辐射30)的照明辐射3的相位梯度pg(同样地用箭头表示)。
具有光瞳8中的相位掩模13的显微镜1表示显微镜1的第一构造。
可以从束路径移除相位掩模13，使得在移除相位掩模的情况下，存在显微镜1的第二构造ii(未示出)。
如图3a和3b所示，为了在光瞳8中将相位掩模13引入到显微镜1的束路径中，或者将其从束路径移除，在显微镜1的第二示例性实施例中，存在给送装置14。
还存在改变装置19，其中保持或可以保持未更具体地示出的多个相位掩模13。相位掩模13是可单独选择的，并且通过给送装置14可以将相应选择的相位掩模13移进和移出光瞳8。
给送装置14和改变装置19与评估单元15连接并且可以受其控制。
评估单元15还与获取单元11连接，以接收由获取单元11获取的分配到获取时间和/或获取时间周期的图像数据。
评估单元15构造为使得由其可以确定不同图像的图像数据之间的差值δip，iwf，例如绝对差值。在这种情况下，图像数据是已经用显微镜1的第一构造i(图3a)来获取的第一图像ip的图像数据以及已经用显微镜1的第二构造ii(图3b)获取的第二图像iwf的图像数据。
第一图像ip的图像数据表示图像数据的获取数据集合，然而第二图像iwf的图像数据可以用作参考数据集合。
评估单元15还与显示器16连接，通过显示器16显示或者可以显示第一图像ip的图像数据、第二图像iwf的图像数据和/或依赖于确定的差值δip，iwf所提供的物体12的对比图像iprk的图像数据。
在图3b中所示出的第二构造ii中，已经将相位掩模13从束路径移除并且移动到改变装置19。
图4示出根据本发明的显微镜1的第三示例性实施例。相位掩模13布置在光瞳8中和束路径中，并且在显微镜1的第一和第二构造i和ii中保持在那里。
相位掩模13由液晶元件17或由空间光调制器18实现，该液晶元件17或空间光调制器18可以分别至少在一个操作状态下操作，在该状态下它们关于光轴7横向地引起光学梯度og。液晶元件17或空间光调制器18还可以在不会引起光学梯度og的操作状态下操作，并且几乎完全停止或完全停止作为相位掩模13的效应。相位掩模13可以由评估单元15激活。
在显微镜1的其他实施例中，相位掩模13由至少两个反射镜20相对于彼此倾斜的反射镜表面20.1形成。在显微镜1的束路径中，存在其他物镜23，其各由至少一个光学透镜构成。
图5中，示出这样的布置作为显微镜1的第四示例性实施例。在第一构造i中，物体辐射30到达已经相对于彼此倾斜的反射镜20的反射镜表面20.1。因为不同的倾斜的反射镜表面20.1，将物体辐射30沿着相对于彼此偏移的两个束路径反射到成像单元9，并且由该成像单元9成像作为相对于彼此偏移的第二部分图像在像平面10中且在获取单元11上。可以由获取单元11获取第一图像ip(参见图3a和3b)。
为了能够通过第二构造ii获取第二图像iwf(参见图3a和3b)，具有倾斜的反射镜表面20.1的反射镜20可以交换为特别是平面反射镜20的反射镜20(由双向箭头表明)。物体辐射30仅由平面反射镜20在一个束路径中反射到成像单元9。
在替代的实施例中，反射镜表面20.1可以通过可激活的致动系统相对于彼此倾斜。为了获取第二图像，反射镜表面20.1可以彼此之间对准，使得它们例如在公共平面中对准。
图6示出显微镜1的第五个示例性实施例，其在光瞳8中具有可形变反射镜21作为相位掩模13。通过反射镜20和其他物镜23将物体辐射30反射到可形变反射镜21上。根据可形变反射镜21的激活的状态，将在该可形变反射镜21和获取单元11之间的束路径转向，使得显微镜1的第一构造i、第二构造ii或其他构造可以通过可形变反射镜21的激活引起。
在可能的实施例中，将相位掩模13分成子区域13.1，子区域13.1中的至少一个具有与其他子区域13.1相比偏离的光学梯度og。
在图7a至7d中，以俯视图示出对称分开的相位掩模13。
相应子区域13.1的光学梯度og的轮廓由箭头表示。
在相位掩模13的一个实施例中，两个子区域13.1的一个具有光学梯度og(图7a)。将相位掩模13以将光瞳8中的束路径覆盖一半的方式引入到光瞳8中的束路径中。
在未示出的可能实施例中，相位掩模13的中间存在孔，该孔由具有光学梯度og的子区域13.1围绕。
图7b示出了具有相对和对称行进光学梯度og的相位掩模13。在这种情况下，保留第一图像中关于第二图像的光学梯度og的质心。
图7c示出将相位掩模13分成四个子区域13.1。子区域13.1的光学梯度og分别相对于彼此对角布置为彼此相对地行进。光学梯度og的每一个还在不同方向上行进。由相位掩模13的该实施例，可以引起在彼此正交的两个方向上相位梯度pg的形成，由此避免形成“剪切方向”。对于半光瞳对比方法或者对于dic而言，这是不可能的。ep2645146b1因此示出许多成对半光瞳光圈的示例解决方案，该多个成对半光瞳光圈布置在轮子上并且顺序地将其引入，但是将要记录的图像的数目增加。
图7d示意性示出子区域13.1由外圆形环和内圆形环构成的相位掩模13，该外圆形环和内圆形环的光学梯度og彼此相对地形成。
在相位掩模13的其它可能实施例中，子区域13.1可以形成为圆的扇形或圆形环的扇形。
子区域13.1实现为扇形的组合、一个或多个圆和/或一个或多个圆形环也是可能的。
相位掩模13的所有实施例可以绕平行于光轴7行进的旋转轴线22，并且因此同样绕光轴7自身是可旋转的。在图7d中，旋转轴线22由为了更好理解所示的水平线和表示光学梯度og的中间箭头的交叉点来标识。
图8a中示出了通过根据现有技术的显微术方法获得的马铃薯细胞的淀粉颗粒的对比图像iprk。图8b示出了通过根据本发明的显微术方法获得的马铃薯细胞的淀粉颗粒的对比图像iprk的细节。
图8a和8b示出了通过本发明使更好的切片法成为可能。以相位对比示出由根据本发明(图8a)和现有技术(图8b)的显微术方法拍摄马铃薯块茎的切片的z堆叠的两个平面。在图8a中示出的常规相位对比的情况下部分地以一个在另一个之上布置的淀粉颗粒在图8b的所有平面中是可见的，然而通过本发明的显微术方法产生的图8a的对比图像iprk中，仅对位于景深区域的淀粉颗粒的边缘进行对比。
基于图3a和3b解释根据本发明的显微术方法的实施例。
通过在第一构造i中的显微镜1，获取布置在物平面5中的物体12的第一图像ip的图像数据。出于该目的，照明辐射3由光源2提供并且聚焦在物平面5中。由于物体12的光学梯度ogobj，照明辐射3的通过物体12的这些部分(物体辐射30)关于照明辐射3的相位移位，使得对于物体辐射30形成相位梯度pgobj。
布置在光瞳8中的相位掩模13引起物体辐射30的相位梯度pg，其特殊形状依赖于相位掩模13的设计、光学梯度ogobj和相位梯度pgobj以及相位掩模13的至少一个光学梯度og。
通过成像单元9将物体辐射30成像在像平面10中，并且由获取单元11以空间分辨形式获取为第一图像ip的图像数据。
由物体12的光学梯度ogobj引起的相位梯度pgobj导致在与相位梯度pgobj成比例的傅里叶平面中物体12的衍射级数的移位。如果在傅里叶平面中、特别在可以特别是物镜光瞳的光瞳8中例如通过半光瞳8中的相位掩模13而引起相位梯度pg，则衍射图案的与相位梯度pgobj成比例的部分附加地曝光于相位梯度pg，并且光瞳8的另一半的衍射图案的同样地与相位梯度pgobj成比例的部分不被曝光。相位梯度pg具有以下效应：将穿过相位梯度pg的图像信息以相对于相位梯度pg垂直地偏移来成像在获取单元11上。因此在例如形成为图像传感器的获取单元11上获得由相对于彼此稍微偏移的两个部分图像构成的图像ip。
确定未受影响的图像iwf和图像ip之间的差值δip，iwf，因此导致由对比图像iprk的图像数据所表示的图像对比度，该对比图像iprk与在光瞳8中移位的衍射级数的部分成比例，并且因此在物平面5中与局部相位梯度pgobj成比例。
随后，实现显微镜1的第二构造ii，其中通过评估单元15和相位掩模13激活给送装置14，并且将相位掩模13从光瞳8移除，特别是从其移出，使得束路径不再受相位掩模13影响。
在第二构造ii中，通过评估单元15，将物体12的宽场图像记录并且储存为第二图像iwf的图像数据，特别是作为参考数据集合。
在显微术方法的其他实施例中，首先第二图像iwf的图像数据通过第二构造ii来获取并且随后第一图像ip的图像数据通过第一构造i来获取。
为了产生对比图像iprk，确定第一图像ip的图像数据和第二图像iwf的图像数据之间的差值δip，iwf。依赖于已确定的差值δip，iwf或是已确定的差异δip，iwf，确定对比图像iprk的图像数据。
特别是，可以将第一图像ip从第二图像iwf减去并且可能被归一化。因此得到的对比图像iprk对相位梯度pg敏感。
因此，差值δip，iwf可以直接用作对比图像iprk的图像数据。
差值δip，iwf还可以用加权因子和/或例如点扩散函数的函数值来计算。
对比图像iprk特别地对与部分图像的间隔成比例的线性比例敏感。
不需要如在半光瞳对比情况下必要的归一化，因为未受干扰的传输光图像(第二图像iwf)已经是可用的并且不必从两个半光瞳图像合成。这预先设想光瞳8中的相位掩模13仅影响相位位置。
如果传输还受相位掩模13影响，则可以将图像强度适当地归一化，并且例如使其如下与第二图像iwf的平均强度相关：
附图标记
1显微镜
2光源
3照明辐射
4聚光器
5物平面
6物镜单元
7光轴
8物镜光瞳
9成像单元
10像平面
11获取单元
12物体
13相位掩模
13.1(相位掩模13的)部分区域
14给送装置
15评估单元
16显示器
17液晶元件
18空间光调制器
19改变装置
20反射镜
20.1反射镜表面
21可变形反射镜
22旋转轴线
23其他物镜
30物体辐射
i第一构造
ii第二构造
og光学梯度
ogobj(物体12的)光学梯度
pg相位梯度
pgobj(物体12的)相位梯度
δiwf，ip绝对差值
ip第一图像
iwf第二图像
iprk对比图像