本实用新型涉及一种基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置，属于暗场数字全息显微术领域。
背景技术：
现代各种远场近场显微术，如高倍光学显微术，共聚焦扫描显微术、荧光显微术、傅里叶相位显微术、希尔伯特位相显微术、衍射位相显微术、扫描电子显微术、扫描隧道显微术及近年来发展起来的极为先进的显微术（如受激发射损耗显微术、随机光学重建显微术和荧光激发定位显微术）等，由于存在这样或那样的限制，如非无损、非实时、测量信息不全面等，不适合于活细胞高精度实时检测及动态监测。数字全息显微术（DHM）不仅没有上述无损、实时测量等方面的限制，而且成本低，操作简单，还能够同时获得样品定量的强度及相位信息。更为重要的是，利用该技术可以方便的采用数字手段进行滤波、位相畸变校正、自动聚焦，扩展焦深等操作，并可利用数字手段获得微分对比像，增强样品细节显示的能力。
暗场数字全息显微成像技术不仅可以增强显微成像的对比度，而且还可以提高成像的分辨率。因此，它可以很好地弥补明场显微成像技术的不足。Dubois 等人从实验角度验证了暗场数字全息显微成像技术可以提高成像的分辨率。Faridian等人在暗场数字全息显微成像技术中引入了变化的散斑场照明，通过多幅全息再现叠加取均值的方法克服了散斑噪声，增强了显微成像的对比度，同样也提高了成像分辨率。但以上几种暗场数字全息显微成像系统中均是通过采用制作特定尺寸的圆形掩膜板或者利用环形反射镜，将扩束后的高斯光整形成环形光作为物体的照明光，使之匹配暗场聚光镜。然而高斯光束均匀性差，而且圆形掩膜制作的环形光阑内外环环径比可调性差，上述这些方法在实现暗场显微照明上都存在操作繁琐、成像对比度及图像分辨率差等问题。
技术实现要素：
本实用新型是为了克服现有暗场数字全息显微术照明光中存在的环形照明光内、外半径大小可调性差、照明光不均匀、分辨率低，成像对比度弱等问题，提出的一种基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置，将计算机算好的环形光计算全息图输送给空间光调制器，空间光调制器经扩束准直好的平行光照射后实时再现适合暗场聚光镜照明的环形光，环形光进入到暗场聚光镜后形成环形光锥照明实验样品获得实验样品的衍射光，数字全息术将样品的衍射光和参考光的干涉条纹通过光电耦合装置传输给计算机，再利用重构技术，再现物体三维图像；该装置可有效提高系统分辨率、增强再现像对比度，针对不同数值孔径显微物镜及实验样品尺寸大小灵活的再现合适的环形照明光。
本实用新型为解决其技术问题而采用的技术方案是：
一种基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置，包括激光器1、光学分束镜I2、光学分束镜II11、扩束镜I3、扩束镜II13、针孔滤波器I4、针孔滤波器II14、准直透镜I5、准直透镜II15、光学反射镜I6、光学反射镜II16、空间光调制器7、暗场聚光镜8、实验样品9、显微物镜10、光电耦合装置12；
激光器1出射的激光照射在光学分束镜I2上；光学分束镜I2、光学分束镜II11、光学反射镜I6和光学反射镜II16在光学平台上构成一个马赫-增德光路系统，其中光学分束镜I2与光学反射镜I6在同一条垂直线上，光学分束镜I2与光学反射镜II16在同一条水平线上，光学反射镜II16与光学分束镜II11在同一条垂直线上，光学分束镜II11与光学反射镜I6在同一条水平线上；
光学分束镜I2与光学反射镜I6之间依次设有扩束镜I3、针孔滤波器I4、准直透镜I5，针孔滤波器I4与准直透镜I5紧挨着，准直透镜I5的前焦面位于扩束镜I3的出瞳位置；
光学分束镜I2与光学反射镜II16之间依次设有扩束镜II13、针孔滤波器II14、准直透镜II15，针孔滤波器II14与准直透镜II15紧挨着，准直透镜II15的前焦面位于扩束镜II13的出瞳位置；
光学反射镜I6与光学分束镜II11之间依此设有空间光调制器7、暗场聚光镜8、实验样品9、显微物镜10，实验样品9位于暗场聚光镜8的后焦面上，显微物镜10的前焦面和实验样品9平面重合，光电耦合装置12设置在光学分束镜II11的后方，并与实验样品9为物像共轭关系；
进一步地，所述激光器1与光学分束镜I2的距离为0.1~0.2m；光学分束镜I2与光学反射镜I6的距离为1.00~1.10m，光学分束镜I2与光学反射镜II16的距离为1.50~1.70m，光学反射镜II16与光学分束镜II11的距离为1.00~1.10m，光学分束镜II11与光学反射镜I6的距离为1.50~1.70m；扩束镜I3与光学分束镜I2之间距离为0.15~0.20m，扩束镜II13与光学分束镜I2之间距离为0.15~0.20m，暗场聚光镜8与光学分束镜II11之间的距离为0.25~0.3m；光电耦合装置12与光学分束镜II11之间的距离为0.1~0.2m；
进一步地，所述光电耦合装置12为CCD或CMOS；
进一步地，空间光调制器7为振幅型或相位型；
所述空间光调制器与计算机连接；
所述环形光计算全息图由计算机算好，输送给空间光调制器，再由扩束准直后的平行光照射空间光调制器实时再现环形光；
所述全息再现法实现环形光照明的环形光斑内、外半径大小可通过计算机根据实际观察对象准确的进行调节；
本实用新型利用全息再现法实现环形光照明，马赫增德尔光路系统进行显微干涉图像记录。利用平行光照射空间光调制器实时再现计算机算好的环形光计算全息图，生成匹配暗场聚光镜所需要环形照明光；环形光进入到暗场聚光镜后汇聚成环形光锥照明实验样品，离开实验样品后的衍射光被显微物镜接收作为物光与参考光干涉成像在光电耦合装置（CCD或CMOS）光敏面上，形成全息图，再由光电耦合装置记录并输送给计算机，通过计算机数值再现，获取被观测物体的三维全息再现像；
使用时在暗场显微聚光镜和标本片之间要加一滴香柏油，暗场聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满,否则照明光线于聚光镜上面进行全面反射,达不到被检物体,从而不能得到暗视野照明。另外防止直射光线进入显微物镜。
按照上述过程，在不同时间里记录下多幅全息图，再对全息图进行重构，就可以得到样品实时动态图像，实现对实验样品的动态监测。
本实用新型的有益效果：
（1）本实用新型的基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置可通过计算机对环形照明光内、外半径大小进行精确调节，根据实际要求整形出大小合适的环形光源，具有精确的内、外环半径，操作简单、快速准确；
（2）本实用新型的基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置可获得均匀的环形照明光，避免了利用高斯光束经环形光阑遮光整形后的环形照明光均匀性差、环形光阑可调节性差等问题；
（3）本实用新型的基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置利用振幅型空间光调制器就可再现出适合的环形光，价格更便宜，推广性强；
（4）本实用新型的基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置可在不同时间里记录下多幅全息图，对全息图再现后进行对比可得到观察对象的动态三维图像，实现对观察对象的动态监测；
（5）本实用新型的基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置无需对观察对象进行染色，可实现对活体细胞显微观察及动态监测；
（6）本实用新型的基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置可以在光电耦合装置记录下的全息图上方便地采用数字手段进行滤波、位相畸变校正，再现出分辨率高的显微图像；
（7）本实用新型的基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置具有广泛的适用性，不仅适用于生物医学领域，还可以对临床医学在早期发现细胞形态异常上提供实时、动态测量。并对胶体化学领域中观察溶质粒子的布朗运动等领域提供动态监测。
附图说明
图1为本实用新型实施例的实验装置示意图；
图中：1-激光器；2-光学分束镜I；3-扩束镜I；4-针孔滤波器I；5-准直透镜I；6-光学反射镜I；7-空间光调制器；8-暗场聚光镜；9-实验样品；10-显微物镜；11-光学分束镜Ⅱ；12-光电耦合装置；13-扩束镜Ⅱ；14-针孔滤波器Ⅱ；15-准直透镜Ⅱ；16-光学反射镜Ⅱ；17-计算机。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本实用新型作进一步说明。
实施例1：如图1所示，一种基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置，包括激光器1、光学分束镜I2、光学分束镜II11、扩束镜I3、扩束镜II13、针孔滤波器I4、针孔滤波器II14、准直透镜I5、准直透镜II15、光学反射镜I6、光学反射镜II16、空间光调制器7、暗场聚光镜8、实验样品9、显微物镜10、光电耦合装置12、计算机17；
激光器1出射的激光照射在光学分束镜I2上；光学分束镜I2、光学分束镜II11、光学反射镜I6和光学反射镜II16在光学平台上构成一个马赫-增德光路系统，其中光学分束镜I2与光学反射镜I6在同一条垂直线上，光学分束镜I2与光学反射镜II16在同一条水平线上，光学反射镜II16与光学分束镜II11在同一条垂直线上，光学分束镜II11与光学反射镜I6在同一条水平线上；
光学分束镜I2与光学反射镜I6之间依次设有扩束镜I3、针孔滤波器I4、准直透镜I5，针孔滤波器I4与准直透镜I5紧挨着，准直透镜I5的前焦面位于扩束镜I3的出瞳位置；
光学分束镜I2与光学反射镜II16之间依次设有扩束镜II13、针孔滤波器II14、准直透镜II15，针孔滤波器II14与准直透镜II15紧挨着，准直透镜II15的前焦面位于扩束镜II13的出瞳位置；
光学反射镜I6与光学分束镜II11之间依此设有空间光调制器7、暗场聚光镜8、实验样品9、显微物镜10，实验样品9位于暗场聚光镜8的后焦面上，显微物镜10的前焦面和实验样品9平面重合，光电耦合装置12设置在光学分束镜II11的后方，并与实验样品9为物像共轭关系。
激光器1与光学分束镜I2的距离为0.1m；光学分束镜I2与光学反射镜I6的距离为1.00m，光学分束镜I2与光学反射镜II16的距离为1.50m，光学反射镜II16与光学分束镜II11的距离为1.00m，光学分束镜II11与光学反射镜I6的距离为1.50m；扩束镜I3与光学分束镜I2之间距离为0.15m，扩束镜II13与光学分束镜I2之间距离为0.15m，暗场聚光镜8与光学分束镜II11之间的距离为0.25m；光电耦合装置装置12与光学分束镜II11之间的距离为0.1m。
光电耦合装置12为CCD。
空间光调制器7为振幅型或相位型。
空间光调制器与计算机连接；环形光计算全息图由计算机算好，输送给空间光调制器，再由扩束准直后的平行光照射空间光调制器实时再现环形光。
全息再现法实现环形光照明的环形光斑内、外半径大小可通过计算机根据实际观察对象准确的进行调节；
激光器的波长为410nm；扩束镜为5X放大率的显微物镜，针孔尺寸为15μm；显微物镜为奥林巴斯平场消色差物镜，放大倍率为40X，暗场聚光镜为奥林巴斯暗场干式聚光镜，准直透镜为400mm焦距的傅里叶透镜，光学分束镜为分光棱镜，分光比为1:1；
本实施例采用癌细胞作为实验样品，采用本装置进行癌细胞的显微观察；
利用全息再现法实现环形光照明，马赫增德尔光路系统进行显微干涉图像记录。利用平行光照射空间光调制器实时再现计算机算好的环形光计算全息图，生成匹配暗场聚光镜和显微物镜所需要的环形照明光；环形光进入到暗场聚光镜后汇聚成环形光锥照明实验样品，离开实验样品后的衍射光被显微物镜接收作为物光与参考光干涉成像在光电耦合装置（CCD或CMOS）光敏面上，形成全息图，由光电耦合装置记录并输送给计算机，通过计算机数值再现，获取被观测物体的三维全息再现像；
环形光计算全息图由计算机计算输送给空间光调制器，实时生成，实时在现；照明的环形光斑内外半径可通过计算机根据实际观察对象准确的进行调节；
使用前在暗场显微聚光镜和标本片之间要加一滴香柏油，暗场聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，另外防止直射光线进入显微物镜；
记录前先根据癌细胞尺寸对环形光斑内外半径大小进行调节，直到得到最清晰的细胞显微图时，保持环形光尺寸不变，按照上述程序，在不同时间间隔内进行图像记录，记录下多幅全息图像，对全息图进行重构，再现细胞三维图像，就可细致的观察细胞形态特征、结构变化，实现对细胞的动态监测。
实施例2：本实施例基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置的结构与实施例1基本相同，唯一不同的是，激光器1与光学分束镜I2的距离为0.2m；光学分束镜I2与光学反射镜I6的距离为1.10m，光学分束镜I2与光学反射镜II16的距离为1.70m，光学反射镜II16与光学分束镜II11的距离为1.10m，光学分束镜II11与光学反射镜I6的距离为1.70m；扩束镜I3与光学分束镜I2之间距离为0.20m，扩束镜II13与光学分束镜I2之间距离为0.20m，暗场聚光镜8与光学分束镜II11之间的距离为0.3m；光电耦合装置装置12与光学分束镜II11之间的距离为0.2m；
本实施例采用本装置进行人工受精过程的显微观察；
利用全息再现法实现环形光照明，马赫增德尔光路系统进行显微干涉图像记录。利用平行光照射空间光调制器实时再现计算机算好的环形光计算全息图，生成匹配暗场聚光镜和显微物镜所需要环形照明光；环形光进入到暗场聚光镜后汇聚成环形光锥照明实验样品，离开实验样品后的衍射光被显微物镜接收作为物光与参考光干涉成像在光电耦合装置（CCD或CMOS）光敏面上，形成全息图，由光电耦合装置记录并输送给计算机，通过计算机数值再现，获取被观测物体的三维全息再现像；
环形光计算全息图由计算机计算输送给空间光调制器，实时生成，实时在现；照明的环形光斑内外半径可通过计算机根据实际观察对象准确的进行调节；
使用前在暗场显微聚光镜和标本片之间要加一滴香柏油，暗场聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，另外防止直射光线进入显微物镜；
在对卵细胞和精子进行筛选时，先把实验用的卵细胞和精子分别放在实验培养皿中，根据人体卵细胞及精子大小，分别调节环形光尺寸，达到最佳清晰成像时，在不同时间间隔里进行图像记录，图像再现后进行对比，立体的再现细胞动态变化，及精子活动情况，找到最佳的精子和卵细胞进行授精实验；
进行人工授精实验时，根据精子和卵细胞的尺寸大小调节好环形光尺寸大小，达到最佳清晰成像时，在不同时间间隔里进行图像记录，图像再现后，结合过程就会被记录到图像中，把图像再现后组合就形成人工授精动态显微过程图，并且方便重复观察及时筛选。
实施例3，本实施例基于全息再现法实现照明的暗场数字显微装置的结构与实施例1基本相同，唯一不同的是，激光器1与光学分束镜I2的距离为0.15m；光学分束镜I2与光学反射镜I6的距离为1.05m，光学分束镜I2与光学反射镜II16的距离为1.60m，光学反射镜II16与光学分束镜II11的距离为1.05m，光学分束镜II11与光学反射镜I6的距离为1.60m；扩束镜I3与光学分束镜I2之间距离为0.17m，扩束镜II13与光学分束镜I2之间距离为0.17m，暗场聚光镜8与光学分束镜II11之间的距离为0.3m；光电耦合装置12与光学分束镜II11之间的距离为0.15m。
上面结合附图对本实用新型的具体实施例作了详细说明，但是本实用新型并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本实用新型宗旨的前提下作出各种变化。