荧光显微镜系统的对焦方法及装置与流程

本发明涉及显微镜系统对焦技术领域，特别涉及一种荧光显微镜系统的对焦方法及装置。

背景技术：

荧光显微成像在生物医学研究领域有着重要应用，尤其是在临床诊断等领域日益受到人们的广泛重视。荧光显微技术常采用平面探测器对样本成像，只有物镜焦面上的能够在探测器上清晰成像。因此需要发展调焦技术使样本的目标平面和显微镜焦面重合。

当前的自动显微对焦技术大致可分为主动对焦技术和被动对焦技术。前者主动发出红外或者超声探测目标物体的位置，机械调节物距或者像距实现对焦。后者基于探测到图像的清晰度等参数调节显微镜的物距或者像距实现轴向(如专利cn-1065341a中公开的一种光学图像系统的调焦方法及装置)和角度(如专利cn1296742c中公开的一种光学成像系统的角度自动调焦系统及方法)的自动对焦。

主动式自动对焦方法无法直接用于荧光显微：由于荧光的特性，红外或者超声探测到的表面无法保证和所需要对焦的荧光目标平面重合。现有的被动式自动对焦方法应用于荧光显微镜有三点重要缺陷：1.图像的清晰度函数依赖于探测样本的单峰性质，即目标函数仅在目标平面上达到最大值。这点在具有三维结构的荧光显微样本中往往难以满足。2.现有的探测技术大多采用步进法探测寻找图像最清晰位置。两个角度调节加上轴向位移调节总共三个自由度的步进调节不仅对焦时间较长，而且光照引起样本荧光染料光漂白等效应直接影响对焦结果3.未考虑样本角度变化对样本的状态产生的变化。荧光显微镜的观察样本往往处在复杂的固体液体环境中，姿态改变过程中会因为重力等因素的影响而改变探测光路。综上，现有的自动显微对焦技术运用于荧光显微镜中具有缺陷。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种荧光显微镜系统的对焦方法，该方法适用于宽视场荧光成像，有效提高了对焦速度和稳定性。

本发明的另一个目的在于提出一种荧光显微镜系统的对焦装置。

为达到上述目的，本发明一方面实施例提出了一种荧光显微镜系统的对焦方法，包括以下步骤：对焦区域选取步骤：在轴向扫描荧光样本过程中选取多个清晰对焦的特征区域，并记录每个特征区域的清晰图像和位置；角度-轴向位置迭代调节优化步骤：根据每对焦区域的中心坐标获取角度和轴向位置的移动量，以移动后进行图像匹配对准，并测量所述每对焦区域的中心坐标后再次迭代优化，以实现对焦。

本发明实施例的荧光显微镜系统的对焦方法，采用图像匹配相关函数进行调焦，克服了传统清晰度函数无法直接用于荧光图像的问题，采用轴向-角度交替优化算法进行调焦，加快收敛速度，采用迭代算法调焦，适用于样本在调节过程中发生变化的情况，适用于宽视场荧光成像，有效提高了对焦速度和稳定性。

另外，根据本发明上述实施例的荧光显微镜系统的对焦方法还可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，还包括：图像匹配对准步骤：利用记录的所述清晰图像对移动后采集的样本图像进行匹配，并更新各个子区域的中心坐标。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述对焦区域选取步骤包括：移动所述荧光样本至视场中心范围；轴向移动所述荧光样本到显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰，并记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)；检测清晰视场的个数；如果所述个数大于预设值，则停止选取。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述角度-轴向位置迭代调节优化步骤包括：根据各子图中心的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ得到俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z；根据所述俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z依次驱动俯仰台和轴向平移台移动。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述图像匹配对准步骤包括：轴向移动所述荧光样本，对子图in采用图像匹配算法以寻找到最新的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ；判断不同子区域的轴向位置znⁱ是否满足预设条件；如果满足，则将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述子区域的个数可以为4。

为达到上述目的，本发明另一方面实施例提出了一种荧光显微镜系统的对焦装置，包括：对焦区域选取模块，用于在轴向扫描荧光样本过程中选取多个清晰对焦的特征区域，并记录每个特征区域的清晰图像和位置；角度-轴向位置迭代调节优化模块，用于根据每对焦区域的中心坐标获取角度和轴向位置的移动量，以移动后进行图像匹配对准，并测量所述每对焦区域的中心坐标后再次迭代优化，以实现对焦。

本发明实施例的荧光显微镜系统的对焦装置，采用图像匹配相关函数进行调焦，克服了传统清晰度函数无法直接用于荧光图像的问题，采用轴向-角度交替优化算法进行调焦，加快收敛速度，采用迭代算法调焦，适用于样本在调节过程中发生变化的情况，适用于宽视场荧光成像，有效提高了对焦速度和稳定性。

另外，根据本发明上述实施例的荧光显微镜系统的对焦装置还可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，还包括：图像匹配对准模块，用于利用记录的所述清晰图像对移动后采集的样本图像进行匹配，并更新各个子区域的中心坐标。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述对焦区域选取模块进一步用于移动所述荧光样本至视场中心范围，轴向移动所述荧光样本到显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰，并记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)，检测清晰视场的个数，并在所述个数大于预设值时，停止选取。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述角度-轴向位置迭代调节优化模块进一步用于根据各子图中心的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ得到俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z，并根据所述俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z依次驱动俯仰台和轴向平移台移动。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述图像匹配对准模块进一步用于轴向移动所述荧光样本，对子图in采用图像匹配算法以寻找到最新的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ，并判断不同子区域的轴向位置znⁱ是否满足预设条件，在满足时，将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述子区域的个数可以为4。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明一个实施例的荧光显微镜系统的对焦方法的流程图；

图2为根据本发明一个具体实施例的荧光显微镜系统的对焦方法的流程图；

图3为根据本发明一个实施例的荧光显微镜系统对焦系统的结构示意图；

图4为根据本发明一个实施例的荧光显微镜系统的对焦方法功能示意图；

图5为根据本发明一个实施例的荧光显微镜系统的对焦装置的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参照附图描述根据本发明实施例提出的荧光显微镜系统的对焦方法及装置，首先将参照附图描述根据本发明实施例提出的荧光显微镜系统的对焦方法。

图1是本发明一个实施例的荧光显微镜系统的对焦方法的流程图。

如图1所示，该荧光显微镜系统的对焦方法包括以下步骤：

在步骤s101中，对焦区域选取步骤：在轴向扫描荧光样本过程中选取多个清晰对焦的特征区域，并记录每个特征区域的清晰图像和位置，以选取焦区域。

可以理解的是，对焦子区域选取：轴向扫描荧光样本中由用户选取若干个清晰对焦的特征区域，记录特征区域的清晰图像和位置。其中，本发明实施例边扫描边采集，并在轴向扫描荧光样本过程中手动选择已经对上焦的区域。

进一步地，在本发明的一个实施例中，对焦区域选取步骤包括：移动荧光样本至视场中心范围；轴向移动荧光样本到显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰，并记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)；检测清晰视场的个数；如果个数大于预设值，则停止选取。

具体而言，如图2所示，包括：

(1)移动样本到视场中心附近；

(2)轴向移动样本到显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰，记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)；

(3)判断已有的清晰视场的个数n，如果n大于预设值则继续下一步并令i＝0，否则回到第二步。

在步骤s102中，角度-轴向位置迭代调节优化步骤：根据每对焦区域的中心坐标获取角度和轴向位置的移动量，以移动后进行图像匹配对准，并测量每对焦区域的中心坐标后再次迭代优化，以实现对焦。

可以理解的是，角度-轴向位置迭代调节优化：根据各对焦区域中心坐标计算获得角度和轴向位置的移动量，移动后进行图像匹配对准即移动后进行图像匹配配准、测量各对焦区域的中心坐标后再次迭代优化。

进一步地，在本发明的一个实施例中，角度-轴向位置迭代调节优化步骤包括：根据各子图中心的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ得到俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z；根据俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z依次驱动俯仰台和轴向平移台移动。

具体而言，如图2所示，包括：

(4)角度-轴向位置迭代调节优化：根据各对焦区域中心坐标计算获得角度和轴向位置的移动量，移动后进行图像匹配对准、测量各对焦区域的中心坐标后再次迭代优化。

(5)根据计算结果θ，和z依次驱动俯仰台和轴向平移台移动；

进一步地，在本发明的一个实施例中，本发明实施例的方法还包括：图像匹配对准步骤：利用记录的清晰图像对移动后采集的样本图像进行匹配，并更新各个子区域的中心坐标。

在本发明的一个实施例中，子区域的个数为4。

可以理解的是，图像匹配对准：利用记录的子区域清晰图像对移动后采集的样本图像进行匹配，更新各个子区域的中心坐标。其中，图像匹配对准步骤是图像匹配对准的进一步解释。

进一步地，在本发明的一个实施例中，图像匹配对准步骤包括：轴向移动荧光样本，对子图in采用图像匹配算法以寻找到最新的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ；判断不同子区域的轴向位置znⁱ是否满足预设条件；如果满足，则将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成。

具体而言，如图2所示，具体包括：

(6)轴向移动样本，对之前选取的子图in采用图像匹配算法寻找到最新的空间坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ；

(7)判断不同子区域的轴向会聚位置znⁱ是否足够接近，如果不足够接近则重复上述的步骤4-6，如果足够接近，就将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成。

在本发明的一个具体实施例中，如图3所示，荧光显微镜系统包括轴向位移-二维俯仰调节台、荧光样本、荧光显微成像系统、成像探测器、图像分析处理系统以及驱动控制装置，样品放置在位移-二维俯仰调节台上并且固定；其中，轴向位移-二维俯仰位移台可以由轴向位移台和两个角度俯仰台组合构成，作用是改变荧光样本的两个倾斜角θ，和轴向距离z。如图4所示，荧光显微成像系统将显微镜物镜焦面上的光强分布成像到成像探测器上；图像分析处理软件显示并处理图像，可实现对焦区域的选取和驱动控制装置的控制，进而驱动轴向位移-二维俯仰位移台。

本发明实施例选取了4个子区域i1-i4，通过调节轴向位移-二维俯仰台的轴向位置和角度实现自动角度对焦，具体步骤如下：

(1)移动样本到视场中心附近。

(2)轴向移动样本4次，使得每次显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰。记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)；其中，i1和i3关于视场的中心对称且中心连线沿x方向，i2和i4关于视场的中心对称且中心连线沿着y方向。令i＝0。

(3)根据子图i1中心的水平坐标(x1ⁱ,y1ⁱ)以及轴向位置z1ⁱ和子图i3中心的水平坐标(x3ⁱ,y3ⁱ)以及轴向位置z3ⁱ计算俯仰台旋转角θ＝(z1ⁱ-z3ⁱ)/(x1ⁱ–x3ⁱ,)；

(4)根据子图i2中心的水平坐标(x2ⁱ,y2ⁱ)以及轴向位置z2ⁱ和子图i4中心的水平坐标(x4ⁱ,y4ⁱ)以及轴向位置z4ⁱ计算俯仰台旋转角z＝(z1ⁱ+z2ⁱ+z3ⁱ+z4ⁱ)/4。

(5)根据计算结果依次驱动俯仰台和轴向平移台移动。

(6)在新的坐标系中轴向扫描样本并采集图像实时分析。对之前选取的子图i1-i4采用图像匹配算法寻找到最新的平面坐标(xnⁱ,ynⁱ),寻找每个子图的最清晰位置znⁱ。具体地，首先，对于同一轴向扫描位置获得的图像，利用图像互相关函数等方法匹配各个子图在视场中的中心位置；对于每个子区域ii，比较不同轴向扫描位置的图像互相关函数，记录函数值最大位置的平面坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ。

(7)判断不同子区域ii的轴向会聚位置znⁱ是否足够接近，即判断条件是否符合,式中α为事先选定的常数，例如取α＝1微米。如果不足够接近则重复步骤3-6，如果足够接近，就将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成。

综上，本发明实施例通过图像匹配方法和轴向位置-角度交替优化迭代调焦方法，可实现快速高稳定性的宽视场荧光显微角度对焦调节，可保证荧光显微成像系统中的准确对焦，具有高速、稳定等优点。

根据本发明实施例提出的荧光显微镜系统的对焦方法，采用图像匹配相关函数进行调焦，克服了传统清晰度函数无法直接用于荧光图像的问题，采用轴向-角度交替优化算法进行调焦，加快收敛速度，采用迭代算法调焦，适用于样本在调节过程中发生变化的情况，适用于宽视场荧光成像，有效提高了对焦速度和稳定性。

其次参照附图描述根据本发明实施例提出的荧光显微镜系统的对焦装置。

图5是本发明一个实施例的荧光显微镜系统的对焦装置的结构示意图。

如图5所示，该荧光显微镜系统的对焦装置10包括：对焦区域选取模块100和角度-轴向位置迭代调节优化模块200。

其中，对焦区域选取模块100用于在轴向扫描荧光样本过程中选取多个清晰对焦的特征区域，并记录每个特征区域的清晰图像和位置，以选取焦区域。角度-轴向位置迭代调节优化模块200用于根据每对焦区域的中心坐标获取角度和轴向位置的移动量，以移动后进行图像匹配对准，并测量每对焦区域的中心坐标后再次迭代优化，以实现对焦。本发明实施例的装置10适用于样本在调节过程中发生变化的情况，适用于宽视场荧光成像，有效提高了对焦速度和稳定性。

进一步地，在本发明的一个实施例中，本发明实施例的装置10还包括：图像匹配对准模块。其中，图像匹配对准模块用于利用记录的清晰图像对移动后采集的样本图像进行匹配，并更新各个子区域的中心坐标。

进一步地，在本发明的一个实施例中，对焦区域选取模块100进一步用于移动荧光样本至视场中心范围，轴向移动荧光样本到显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰，并记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)，检测清晰视场的个数，并在个数大于预设值时，停止选取。

进一步地，在本发明的一个实施例中，角度-轴向位置迭代调节优化模块200进一步用于根据各子图中心的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ得到俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z，并根据俯仰台旋转角θ，和轴向位移台移动距离z依次驱动俯仰台和轴向平移台移动。

进一步地，在本发明的一个实施例中，图像匹配对准模块进一步用于轴向移动荧光样本，对子图in采用图像匹配算法以寻找到最新的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ，并判断不同子区域的轴向位置znⁱ是否满足预设条件，在满足时，将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成。

进一步地，在本发明的一个实施例中，子区域的个数为4。

需要说明的是，前述对荧光显微镜系统的对焦方法实施例的解释说明也适用于该实施例的荧光显微镜系统的对焦装置，此处不再赘述。

根据本发明实施例提出的荧光显微镜系统的对焦装置，采用图像匹配相关函数进行调焦，克服了传统清晰度函数无法直接用于荧光图像的问题，采用轴向-角度交替优化算法进行调焦，加快收敛速度，采用迭代算法调焦，适用于样本在调节过程中发生变化的情况，适用于宽视场荧光成像，有效提高了对焦速度和稳定性。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。