基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置和方法与流程

本发明涉及光学超分辨显微成像技术领域，具体地说，涉及一种基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置和方法。

背景技术：

光学显微镜在生物医学研究中扮演着极其重要的作用。然而，普通光学显微镜的分辨率受到光学衍射限制无法突破半波长量级。为了观察样品的亚百纳米精细结构，科学家们使用了多种方法提高了光学显微镜的分辨率，实现了超分辨成像。在这一系列的超分辨成像技术中，结构光照明显微镜因为其成像速度快和空间分辨率高的优点而被广泛应用于生物医学研究中。在结构光照明显微镜中，样品被周期条纹图样照明，从而能够将普通显微镜无法获取到的高分辨信息以莫尔条纹的形式编码到可探测到的低分辨图像中。这些高分辨信息可以随后被提取出来并平移到原来的位置，实现光学分辨率的扩展。结构光照明显微镜可以将普通光学显微镜的分辨率提高两倍，获得约100纳米的横向分辨率。进一步通过三光束干涉，可获得三维结构光照明图样，编码样品的三维高频信息，从而能够将三维分辨率均提高两倍，在纵向也获得约300纳米的分辨率。但纵向分辨率仍然比横向分辨率差三倍。

由于普通显微镜仅使用单个物镜照明样品单侧并收集荧光，使得光束的收集角度受限且不对称，从而产生了三维各向异性的分辨率。因此，通过在样品的另一侧再添加一个物镜增大光束的收集角度可以提高成像系统的纵向分辨率。这种方法类似于天文学领域的干涉成像技术，即通过多个望远镜获取多光束进行干涉来合成更大的孔径。这种技术最简单的实现方式是将入射光分为两束，分别通过两个物镜，经过物镜聚焦后在焦平面进行干涉，可以形成纵向缩小的焦点，理论上可以将纵向分辨率提高两倍。如果再引入荧光干涉，则可以将纵向分辨率提高到100纳米以下。

进一步，将双物镜照明和激发结构引入到三维结构光照明技术中，通过六束光的干涉可以将光学显微镜的分辨率扩展到三维各向同性的100纳米分辨率。在硬件上，这种技术是通过先使用透射相位光栅将一束准直后的激光照明光束衍射为多束光，并保留中间的三个衍射级次的光，然后利用光束分束器将三束衍射光分为六束，通过两个物镜进行干涉实现的。这种系统由于是使用透射光栅实现六光束干涉，以及干涉图样的相移和方向旋转，图像获取速度较慢，不适用于活细胞成像。光栅的机械移动容易带来误差，使得重构结果可能存在伪像。光栅的衍射分光也导致光束的能量利用率不高。

技术实现要素：

本发明的目的为提供一种基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，无需使用光栅分光，大大提高了能量利用效率。

本发明的另一目的为提供一种基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像方法，该方法基于上述三维结构光照明超分辨显微成像装置实现。

为了实现上述目的，本发明提供的基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置包括入射光干涉模块，用于产生六光束进行干涉形成三维结构光照明；和探测光干涉模块，用于收集样品两侧发出的荧光信号。

入射光干涉模块包括发出激光光束的激光器，还包括：

分束组件，具有沿激光器的光路依次布置并将激光光束分成六束的三个分束镜，六束激光光束分为两组照明光分别从样品台对称的两侧入射，每组照明光包括三束激光光束；

扫描振镜组，分别安装在前两个分束镜的反射光路上，其中一个反射光路上设有通过移动来改变光程差的反射镜；

探测光干涉模块包括：

显微物镜组，分别位于两组照明光的光路上，两个显微物镜分别从样品两侧将光束聚焦于同一焦平面形成干涉产生三维结构光照明，并收集样品发出的荧光信号；

分束组件中的最后一个分束镜与两个显微物镜之间的光程长度一致，便于形成干涉；

装置还包括一计算机处理器，用于控制反射镜移动以及振镜扫描进行扫描，使结构光照明图样进行多次相移和方向旋转，控制样品台进行纵向扫描，获取不同深度处不同照明方向上不同相位的二维超分辨图像，并对所有二维超分辨图像进行三维叠加，获取样品的三维超分辨图像。

上述技术方案中，双振镜用于控制三维结构光照明图样的周期和方向，双物镜用于从样品两侧进行照明并收集荧光，无需使用光栅分光，大大提高了能量利用效率；通过振镜扫描实现图样周期变化及方向旋转，灵活度高，成像速度快，特别适用于对荧光标记的生物样品进行活细胞三维亚一百纳米超分辨成像。

作为优选，位于激光器的光路上的最后一个分束镜将由前两个分束镜分成的一路透射光和两路反射光再分成六束光，最后一个分束镜兼做合束器，对由两个显微物镜收集到的荧光信号进行合束，合束后的荧光由相机收集。

作为优选，沿着主光轴的一路透射光无需振镜系统控制，可直接经过4f透镜组进行光束的缩束，使其与其他两路反射光通过振镜扫描后保持相同直径。

作为优选，最后一个分束镜与相机之间设有二向色镜，用于滤除入射激光信号的干扰。最后一个分束镜与两个显微物镜之间依次放置有两个平面反射镜，用于改变光束的传播方向；和一个场镜，用于将三束光聚焦到物镜后瞳面。

作为优选，反射镜有压电陶瓷驱动进行移动，该压电陶瓷根据所述的计算机处理器发出的信号，改变入射光路的光程差使结构光照明图像产生相移。通过压电陶瓷进行精确相移，实验误差小。

作为优选，计算机处理器控制反射镜至少移动五次，得到至少五幅相移后的荧光强度图像，因为六光束干涉下获取的原始图像频域横向方向包含五个高频分量，为了求解这五个分量实现光学传递函数的扩展，需要至少获取五张不同相位下的原始图像。计算机处理器控制扫描振镜对样品进行扫描，使得投射到样品上的结构光图样至少具有三个不同角度的方向旋转，得到不同角度下的荧光强度图像，因为在同一方向下获取的五幅原始图像只能实现单个方向的截止频率扩展，为了获得各向同性的分辨率提升，需要至少分别在三个方向下进行超分辨原始图像获取和重构。计算机处理器控制样品台的纵向扫描步距在50纳米以下，由尼奎斯特采样定律决定，扫描次数视具体样品情况确定，一般为10次。

作为优选，激光器与分束组件间依次放置有对激光光束进行滤波的单模光纤以及对激光光束进行准直、缩束和扩束的光束准直器。激光器发出的光先耦合到单模光纤中，从单模光纤出来的光通过准直器进行准直、缩束和扩束操作，准直光经过两个光束分束器后变为三束频率相等和偏振相同的入射光。

作为优选，扫描振镜采用反射式、透射式、共振式、单镜式或双镜式结构。

作为优选，显微物镜采用数值孔径较大的物镜，便于产生周期更小的结构光照明图样。

为了实现上述另一目的，本发明提供的基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像方法包括以下步骤：

1)将激光光束分为六束沿不同方向传播的入射光，六束光分为两组，经过两个光程长度一致的光路分别从样品两侧入射，并通过设置在两光路上的显微物镜使两组入射光在同一焦平面处发生干涉，形成三维结构光照明图样；

2)三维结构光照明图样激发样品产生的荧光信号被两侧的显微物镜收集，汇聚到相机上发生荧光自干涉；

3)获取同一照明方向下的多幅不同相位的荧光强度图像；

4)旋转照明图样的方向，同时在每个方向下重复步骤3)，获取不同照明方向下不同相位的荧光强度图像；

5)控制样品台进行纵向扫描，获取样品的三维深度信息，同时在每个深度处重复步骤3)和4)；

6)对每个深度处获取的荧光强度图像进行后期算法重构，获取相应深度处的二维超分辨图像；

7)对所有二维超分辨图像进行三维叠加，最终获取样品的三维超分辨图像。

步骤3)中至少获取五幅相移后的荧光强度图像；步骤4)中照明图样的方向至少旋转三次；步骤5)中样品台的纵向扫描步距在50纳米以下，扫描次数视具体样品情况确定，一般为10次。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)无需使用光栅进行分光，大大提高了照明光的能量利用效率；

2)使用扫描振镜实现图样周期变化及方向旋转，灵活度高，成像速度快，特别适用于对荧光标记的生物样品进行活细胞三维亚一百纳米超分辨成像。

附图说明

图1为本发明实施例基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置示意图；

图2为本发明实施例基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置操作流程示意图；

图3为三种成像技术形成的照明图样频域信息分布对比图，其中，(a)为普通宽场显微镜形成的照明图样频域信息分布示意图，(b)为单物镜三维结构光照明显微成像技术形成的照明图样频域信息分布示意图，(c)为本发明实施例双物镜三维结构光照明显微成像技术形成的照明图样频域信息分布示意图；

图4为三种成像技术形成的光学传递函数对比图，其中，(a)为普通宽场显微镜形成的光学传递函数示意图，(b)为双物镜双光束干涉显微成像技术形成的光学传递函数示意图，(c)为本发明实施例的双物镜三维结构光照明显微成像技术形成的光学传递函数示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。

实施例

参见图1，本实施例的基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，包括：激光器1、单模光纤2、光束准直器3、第一分束镜4、第二分束镜5、第一凸透镜6、第二凸透镜7、第一扫描振镜8、第一平面反射镜9、第二扫描振镜10、第二平面反射镜11、压电陶瓷12、第三分束镜13、第三平面反射镜14、第四平面反射镜15、第一场镜16、第一显微物镜17、样品及样品台、第五平面反射镜19、第六平面反射镜20、第二场镜21、第二显微物镜22、二向色镜23和工业相机24。

激光器1发出的激光光束依次经过放置在光路主光轴的单模光纤2，用于对入射光进行滤波；和光束准直器3，用于对入射光进行准直、缩束和扩束操作。准直后的光束依次经过第一分束镜4和第二分束镜5被分为三束频率相等、振动方向相同的入射光。其中沿着主光轴传播的入射光直接经过第一凸透镜6和第二凸透镜7组成的4f透镜组进行光束的缩束，使其与其他两路通过振镜的入射光保持相同直径。第一凸透镜6和第二凸透镜7的焦面保持重合。另外两束入射光分别各经过第一扫描振镜8和第一平面反射镜9，以及第二扫描振镜10和第二平面反射镜11。第一扫描振镜8和第二扫描振镜10分别用于控制对应光束的入射角度和方位角，实现在样品面结构光照明图样的周期变化和方位旋转。扫描振镜采用反射式、透射式、共振式、单镜式或双镜式结构等均可。第一平面反射镜9和第二平面反射镜11分别用于控制对应光束的传播方向，使其可汇聚在显微物镜后瞳面主光轴两侧对应位置。其中第二平面反射镜11与压电陶瓷12连接，在成像过程中通过压电陶瓷12的驱动实现结构光照明图样的相位移动。

经过第一扫描振镜8和第二扫描振镜10的两束光以及主光轴的光束经过第三分束镜13分为六束光，分别经过第三平面反射镜14和第四平面反射镜15，以及第五平面反射镜19和第六平面反射镜20构成的两套光束传播方向中转系统，进入样品两侧的照明光路。两组入射光又分别经过对称放置在样品18两侧的第一场镜16和第二场镜21汇聚在第一显微物镜17和第二显微物镜22的后瞳面。汇聚在第一显微物镜17和第二显微物镜22后瞳面的两组光经过显微物镜的成像又汇聚到样品18内部同一焦平面位置处。六束光发生干涉形成三维结构光照明图样调制样品的三维信息。其中第三分束镜13和第一显微物镜17和第二显微物镜22之间光程长度须保持一致，便于形成干涉。第一显微物镜17和第二显微物镜22最好采用数值孔径较大的物镜，便于产生周期更小的结构光照明图样。

样品18被激发的荧光信号又被两侧的第一显微物镜17和第二显微物镜22收集，反向分别通过第一场镜16、第四平面反射镜15和第三平面反射镜14，以及第二场镜21、第六平面反射镜20和第五平面反射镜19被第三分束镜13合束。

经过第三分束镜13合束的两路荧光信号又经过二向色镜23的反射进入工业相机24并发生荧光自干涉。二向色镜可以滤除入射激光信号的干扰。

其中，激光器1的开关和强度调节，第一扫描振镜8和第二扫描振镜10的电压变化，压电陶瓷12的移动，样品台18的纵向移动以及相机24的调节都是通过计算机控制，同时对原始图像的后期处理和超分辨结果重构也由计算机完成。

参见图2，基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像方法包括以下步骤：

1)将激光光束分为六束沿不同方向传播的入射光，六束光分为两组，经过两个光程长度一致的光路分别从样品两侧入射，并通过设置在两光路上的显微物镜使两组入射光在同一焦平面处发生干涉，形成三维结构光照明图样；

2)三维结构光照明图样激发样品产生的荧光信号被两侧的显微物镜收集，汇聚到相机上发生荧光自干涉；

3)获取同一照明方向下的多幅不同相位的荧光强度图像；

4)旋转照明图样的方向，同时在每个方向下重复步骤3)，获取不同照明方向下不同相位的荧光强度图像；

5)控制样品台进行纵向扫描，获取样品的三维深度信息，同时在每个深度处重复步骤3)和4)；

6)对每个深度处获取的荧光强度图像进行后期算法重构，获取相应深度处的二维超分辨图像；

7)对所有二维超分辨图像进行三维叠加，最终获取样品的三维超分辨图像。

步骤3)中至少获取五幅相移后的荧光强度图像；步骤4)中照明图样的方向至少旋转三次；步骤5)中样品台的纵向扫描步距在50纳米以下，扫描次数为视具体样品情况确定，一般为10次。

系统初始化后，激光器1发出的入射光依次经过第一光束分束镜4、第二光束分束镜5和第三分束镜13分为六束沿不同方向传播的入射光。六束光分为两组，经过两个对称的照明光路、第一显微物镜17和第二显微物镜22分别从样品18两侧入射，在同一焦平面处发生干涉，形成三维结构光照明图样。照明图样激发样品18产生的荧光信号又被第一显微物镜17和第二显微物镜22收集，汇聚到工业相机24上发生荧光自干涉。

单个方向的六光束三维结构光照明超分辨重构需要控制压电陶瓷12移相至少5次，获取同一照明方向下的多幅不同相位原始图像，这是因为六光束干涉下获取的原始图像频域横向方向包含五个高频分量。图像频域信息分布情况参见图3，其中，(a)为普通宽场显微镜形成的照明图样频域信息分布示意图，(b)为单物镜三维结构光照明显微成像技术形成的照明图样频域信息分布示意图，(c)为本实施例双物镜三维结构光照明显微成像技术形成的照明图样频域信息分布示意图。为了求解五个频率分量实现光学传递函数的扩展，需要至少获取五张不同相位下的原始图像，光学传递函数图参见图4，其中，(a)为普通宽场显微镜形成的光学传递函数示意图，(b)为双物镜双光束干涉显微成像技术形成的光学传递函数示意图，(c)为本实施例的双物镜三维结构光照明显微成像技术形成的光学传递函数示意图。

然后控制第一扫描振镜8和第二扫描振镜10旋转三维结构光照明图样方位至少三次，获取不同照明方向不同相位的原始图像。因为在同一方向下获取的五幅原始图像只能实现单个方向的截止频率扩展，为了获得各向同性的分辨率提升，需要至少分别在三个方向下进行超分辨原始图像获取和重构。

为了获取样品18的三维深度信息，需要控制样品台进行纵向扫描，同时在每个深度处控制三维结构光照明图样移相和方位旋转。样品台的纵向扫描步距设置在50纳米以下，由尼奎斯特采样定律决定。扫描次数视具体样品情况确定，一般为10次。

对每个深度处获取的原始图像进行后期算法重构，获取相应深度处的二维超分辨图像，最后对一系列二维超分辨图像进行三维叠加，即可获取样品的三维超分辨图像。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。