一种高荧光收集率显微镜的制作方法

本实用新型涉及光学成像领域，具体为一种高荧光收集率显微镜。

背景技术：

在非线性光学成像显微镜，特别是多光子荧光显微镜中，近红外激光脉冲被显微物镜聚焦后在样品中激发出各向同性发射的电信号。生物组织通常表现出较强吸收和高散射的光学特性。对于落射式(epifluorescence)荧光检测，同一个显微物镜既被用于聚焦激光信号，又被用于收集电信号。被显微物镜收集的电信号的强度取决于显微物镜的数值孔径和物镜前孔径(objectivefrontaperture，ofa)。显微物镜的数值孔径和物镜前孔径越大，显微物镜能收集的电信号的强度越大。对于双光子荧光显微镜中常见的数值孔径为0.8，放大倍率为40x的显微物镜来说，高散射样品中只有不到10％的立体角内的荧光被显微物镜收集到。

因此，近年来，出现了很多收集显微物镜无法收集到的荧光光子的技术，例如，通过在显微物镜周围安排5-8根高数值孔径的光纤来收集显微物镜收集不到的荧光，可以在高数值孔径显微物镜获得2倍荧光收集效率增强，在低数值孔径显微物镜获得20倍荧光收集效率增强。例如，2016年出现的一种兼容商用双光子荧光显微镜，采用四分之一椭球反射镜的全发射检测技术，在高数值孔径显微物镜获得2.75倍荧光收集效率增强。

以上用于增强荧光收集效率的技术均采用额外光学元件收集显微物镜无法收集到的荧光光子。由于荧光光子的散射角度离散性很大，进入额外收集光路后荧光光子多次反射路径复杂，损耗大，导致额外光学元件的实际收集效率受限。此外额外光学元件的形状复杂，加工难度很高，成本也较高，使得应用上述增强荧光收集效率技术的仪器体积过大，会对成像区域造成遮挡，同时对进行的电生理实验操作造成阻碍。

因此，亟需一种高荧光收集率显微镜。

技术实现要素：

本实用新型意在提供一种高荧光收集率显微镜，以解决上述技术问题。

本实用新型提供基础方案：一种高荧光收集率显微镜，包括镜架，所述镜架上设有用于放置实验样品的载物台和用于检测实验样品的显微镜本体，所述显微镜本体上设有用于输出激光信号的激光输入光纤和用于传输荧光光子的收集光纤，所述显微镜本体上开设安装孔，所述安装孔上安装有物镜本体，所述物镜本体供激光信号穿过，所述显微镜本体上设有用于将荧光光子转化为电信号的光电检测器，所述光电检测器远离显微镜本体的一侧靠近实验样品用于收集荧光光子。

基础方案的工作原理及有益效果：镜架的设置，为载物台、显微镜本体提供支撑，载物台的设置，平稳的支撑实验样品，便于通过显微镜本体进行观察，显微镜本体的设置，对实验样品进行观察，提供检测结果，激光输入光纤的设置，向显微镜本体内输出激光信号，并从显微镜本体内照射至实验样品上，收集光纤的设置，将经实验样品背向反射和背向散射，以及滤光后的获得的荧光光子传输至外部设备，通过外部设备对荧光光子进行分析，从而获得对应的实验图像。

安装孔的设置，用于安装物镜本体；物镜本体的设置，可使激光信号通过物镜本体，并在被实验样品背向反射和背向散射后进入显微镜本体进行收集。激光信号穿过物镜本体，到达实验样品上，由于背向反射和背向散射使得激光信号的光路呈现不同角度，其中一部分激光信号经过物镜本体进入显微镜本体，经过相关元件后，显微镜本体将接收的激光信号中的荧光光子通过收集光纤传输到外部计算机转换为电信号。另一部分激光信号经过光电检测器，激光信号中的荧光光子被光电检测器收集，并转换为电信号，通过电线传输给外部计算机，外部计算机对两个电信号进行整合即得到最终的检测图像。

光电检测器远离显微镜本体的一侧靠近实验样品，直接收集经过实验样品背向反射和背向散射的激光信号，激光信号无需多次反射，从而减少收集的荧光光子的损耗。与传统的电子扫描显微镜(即具有上述将经过物镜本体的激光信号中的荧光光子转换为电信号的功能的显微镜)相比，通过光电检测器收集物镜本体接收不到的荧光光子，从而提高荧光收集效率，提高成像的信噪比，提高在高散射介质中的成像深度

进一步，所述光电检测器与物镜本体相抵。有益效果：经过实验样品背向反射和背向散射的激光信号大多集中在与物镜本体相对的位置，激光信号以物镜本体为中心向外逐渐减少，因此光电检测器与物镜本体相抵，能够收集更多的荧光光子，进一步提高荧光收集效率。

进一步，所述光电检测器远离显微镜本体的一侧与物镜本体的焦平面的平行。有益效果：光电检测器远离显微镜本体的一侧与物镜本体的焦平面的平行，即代表光电检测器与显微镜本体的外表面齐平，光电检测器内嵌于显微镜本体内，从而避免由于光电检测器突出所造成的损伤。

进一步，所述光电检测器与物镜本体相抵的一端至物镜本体的焦平面的距离大于光电检测器远离物镜本体的一端至物镜本体的焦平面的距离。有益效果：光电检测器具有一定角度，与光电检测器水平相比，光电检测器所能收集的荧光光子的角度更大，即收集荧光光子的范围更大。

进一步，所述光电检测器包括滤光层，所述滤光层用于滤出背向反射和背向散射的激光信号，并透过荧光光子。有益效果：滤光层的设置，过滤掉长波长的激光信号，使得短波长的荧光光子透过滤光层，从而便于后续对荧光光子进行收集。

进一步，所述光电检测器还包括感光层，所述感光层用于将穿过滤光层的荧光光子转化为电信号。有益效果：感光层的设置，将透过滤光层的荧光光子转换为电信号，便于后续进行数据传输。

进一步，所述光电检测器还包括用于透光的保护层，所述保护层包裹滤光层和感光层。有益效果：保护层的设置，隔离实验样品，避免实验样品与滤光片接触，同时隔离感光层与实验样品、显微镜本体、物镜本体，避免当感光层为雪崩光电二极管等带有内部增益的元件时所需的高电压对实验样品、显微镜本体、物镜本体、操作人员等造成伤害

进一步，所述感光层连接有用于传输电信号的线缆。有益效果：通过线缆将感光层转换后的电信号传输给外部计算机进行处理，以获得对应的图像。

进一步，所述感光层包括若干感光元件，所述感光元件以物镜本体为中心周向分布。有益效果：通过设置若干周向分布的感光元件对荧光光子进行收集，从而收集物镜本体接收不到的荧光光子，提高荧光收集效率。

进一步，所述感光层包括若干感光元件，所述保护层远离显微镜本体的一侧为微透镜阵列，所述感光元件与微透镜阵列的微透镜位置一一对应。有益效果：通过将设置为微透镜阵列，将激光信号聚焦到微透镜阵列中的每个微透镜处，提高感光效率，从而使每个感光元件收集更多荧光光子，提高荧光收集效率。

附图说明

图1为本实用新型一种高荧光收集率显微镜实施例一的正视剖视图；

图2为本实用新型一种高荧光收集率显微镜的光电检测器的剖视图；

图3为本实用新型一种高荧光收集率显微镜实施例一的光电检测器的俯视剖视图；

图4为本实用新型一种高荧光收集率显微镜实施例二的正视剖视图；

图5为本实用新型一种高荧光收集率显微镜实施例二的光电检测器的俯视剖视图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

说明书附图中的附图标记包括：显微镜本体1、激光输入光纤101、收集光纤102、物镜本体103、光电检测器2、保护层201、滤光层202、感光层203、驱动电路204。

实施例一

一种高荧光收集率显微镜，包括镜架，镜架的底部通过螺钉固定连接有底座，底座上粘接有支撑杆，支撑杆远离底座的一端通过螺钉固定连接有载物台，载物台的顶面用于放置实验样品，镜架的顶部通过螺钉固定连接有显微镜本体1，显微镜本体1与载物台位于镜架的同一侧。镜架、载物台、显微镜本体1三者的形状、位置关系不局限于本申请所记载的内容，还可以采用现有技术中任一显微镜的相关结构。

显微镜本体1的侧壁开设有供激光输入光纤101穿过的第一通孔，激光输入光纤101的一端与外部激光设备连接，另一端位于显微镜本体1内，用于输出激光信号。显微镜本体1的顶部开设有供收集光纤102穿过的第二通孔，收集光纤102的一端位于显微镜本体1内，用于收集荧光光子，另一端与外部光电成像设备连接。

如附图1所示，显微镜本体1内还设有准直透镜、反射镜、二向色镜扫描器、物镜本体103以及聚焦透镜，物镜本体103为非球面透镜，准直透镜用于准直来自激光输入光纤101输出的激光信号以及减少不同频率激光信号之间的色差并输出激光信号至反射镜。非球面透镜的物镜本体103，曲率半径随着中心轴而变化，用以改进光学品质，减少光学元件，降低设计成本。

二向色镜扫描器用于将激光信号和非线性光学信号(即荧光光子)分开以及输出所述非线性光学信号，还用于改变激光信号的入射角角度让激光信号对实验样品内部组织的平面进行二维扫描，即二向色扫描镜将激光信号输出至物镜本体103，物镜本体103用于将来自二向色镜扫描器的激光信号汇聚到实验样品上，以激发实验样品产生非线性光学信号，然后物镜本体103接收并输入非线性光学信号至二向色扫描器，非线性光学信号从二向色扫描器透射至聚焦透镜，聚焦透镜用于有效收集非线性光学信号。聚焦透镜将非线性光学信号反馈至外部光电成像设备中，外部光电成像设备由多个光电倍增管检测器、多片二向色镜、多片滤光片和多片聚焦透镜组成，用于接受收集光纤102所传输的非线性光学信号并完成光电转换供计算机处理。关于显微镜本体1内的设置，如何由激光输入光纤101输出的激光信号，以及如何由非线性光学信号转换为电信号等在公开号为cn108261179a的微型光学探头中有详细记载，因此不再赘述。

显微镜本体1的底部开设有安装孔，物镜本体103安装在安装孔内，物镜本体103供激光信号穿过。显微镜本体1的底部内嵌有将荧光光子转换为电信号的光电检测器2，光电检测器2的顶面与显微镜本体1相抵，光电检测器2的一端与物镜本体103相抵，光电检测器2与物镜本体103相抵的一端至物镜本体103的焦平面的距离大于光电检测器2远离物镜本体103的一端至物镜本体103的焦平面的距离(即光电检测器2与物镜本体103相抵的一端高于光电检测器2远离物镜本体103的一端)，光电检测器2的底面用于靠近实验样品收集荧光光子(即当光电检测器2为圆环状时，其形似喇叭，孔径由上至下逐渐增大)。

光电检测器2的中心设有供物镜本体103穿过的贯穿孔，贯穿孔的孔壁与物镜本体103的边缘相抵，经实验样品背向反射和背向散射的激光信号经过物镜本体103进入显微镜本体1内。当然光电检测器2的中心也可不设置贯穿孔，而是采用能够透过激光信号的透明材料，使得经实验样品背向反射和背向散射的激光信号依次经过透明材料、物镜本体103进入显微镜本体1内。在本实施例中，优选中心设有供物镜本体103穿过的贯穿孔的光电检测器2，即光电检测器2为圆形的环状结构。

如附图2所示，光电检测器2包括由下至上依次设置的滤光层202、感光层203和驱动电路204，其中滤光层202为可透射可见光波长的绝缘材料制作的滤光片，滤光片用于过滤长波长的激光信号，并透过短波长的荧光光子。

感光层203可采用一个感光元件，感光元件优选为单一的大面积雪崩二极管，大面积雪崩二极管的形状为圆形的环状结构，可经过机械钻孔或腐蚀加工获得。如附图3所示，感光层203也可采用若干感光元件，感光元件优选为若干常规尺寸的雪崩二极管，雪崩二极管以物镜本体103为中心周向分布。在本实施例中，感光层203优选为采用若干感光元件，即采用若干雪崩二极管，感光层203用于收集物镜本体103接收不到的荧光光子。

由于感光层203为雪崩光电二极管，其带有内部增益的元件，驱动电压高达数百至2000伏特，因此驱动电路204用于为感光层203提供高电压。光电检测器2上还设有线缆接口，驱动电路204、感光层203均与线缆接口电连接，线缆接口连接有线缆，线缆用于传输电信号，线缆远离感光层203的一端与外部计算机连接，用于将电信号传输给外部计算机供计算机进行处理。通过雪崩二极管将荧光光子转换为电信号，以及将电信号通过线缆传输到外部计算机进行处理为现有技术，因此不再赘述。

滤光层202、感光层203和驱动电路204外包覆有保护层201，保护层201的材质为可透射可见光波长的绝缘材料，在本实施例中绝缘材料优选为光学玻璃。保护层201的顶面与显微镜本体1相抵，保护层201的底面与实验样品靠近或接触，保护层201的地面镀有防反射光学镀膜，用于提高荧光光子的透射率。

实施例二

本实施例与实施例一的不同之处在于：光电检测器2的形状，感光层203的设置，以及保护层201的底面设置。如附图4、5所示，在本实施例中，光电检测器2的形状为方形的环状结构，且光电检测器2的底面(即光电检测器2远离显微镜本体1的一侧)与显微镜本体1的外表面齐平(即光电检测器2远离显微镜本体1的一侧与物镜本体103的焦平面的平行)，保护层201的底面为微透镜阵列，微透镜阵列有若干个矩形阵列的微透镜。

感光层203可选用二维像素光电传感器，例如ccd(光电耦合器件)器件，cmos(金属半导体氧化物)器件，fpa(焦平面阵列)器件，pmt(光电倍增管)器件，单光子计数器件或基于任何以上多种光电转换原理的混合器件，在本实施例中，感光层203优选为若干滨松公司的混合光电探测器(hpd)，每个混合光电探测器与微透镜所在位置一一对应。

以上所述的仅是本实用新型的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前实用新型所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本实用新型结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本实用新型的保护范围，这些都不会影响本实用新型实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。