基于梯度变折射率透镜的多平面显微成像系统及方法

1.本发明涉及光学显微成像领域，尤其涉及一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统及方法。


背景技术：

2.光学显微成像技术是通过光学方法获取围观物体的高分辨率图像的技术，目前广泛应用于对细胞、细菌、病毒等微生物的结构成像和功能信号探测，已成为目前生物学研究的常用方法。其中，在脑科学的研究中，结合化学指示剂，光学显微镜可以利用钙浓度变化、化学递质浓度变化和电压变化等带来的荧光强度变化探测神经元活动的变化。可以理解的是，大脑是具有分层的三维结构，不同层具有不同的结构和功能，而不同层之间也有相互的功能连接。例如，小鼠大脑的海马区通常位于大脑表面约1mm以下，同时和大脑皮层的信息交流、记忆的形成以及疾病发作都有着直接相关，因此为了研究以上问题，我们需要同时对大脑的海马区和皮层进行同时观测。但是传统的光学显微技术单次拍摄只能对其焦面处的组织结构进行清晰成像，无法对焦面以外的目标进行成像。此外传统的光学显微技术受到脑组织散射的影响，无法对300μm以下的组织进行成像。以上两个缺点极大地限制了光学显微技术在大脑成像中的应用。
3.相关技术中，为了实现多平面样本的观测，通常采用以下三种方案：第一种采用机械装置移动物镜实现不同深度的位置，但是机械惯性限制了成像的速度；第二种采用电调变焦透镜改变物镜焦距，此方法相对第一种方法提升了成像速度，但是受限于电调透镜的原理，视场范围受限；第三种是光场显微成像方法，通过牺牲成像系统的横向分辨率来实现对三维光场的获取和重建，不但无法获得脑组织细微结构的信息，还需要大量的数据算法以及时间才可以实现三维重建，无法做到实时观测大脑组织情况。此外为了实现深层成像，共聚焦显微镜和多光子扫描显微镜是目前最为常用的方法，但是采用扫描方式获取图像极大地降低了系统的时间分辨率，此问题在大视场成像中更为严重。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题。
5.为此，本发明的第一个目的在于提出一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统，该系统通过在传统光学显微镜的物镜和样本面之间加入梯度变折射率透镜，以实现视野中不同深度区域的同时成像，并且，还在梯度变折射率透镜以外区域加入高折射率物质作为像面校正模块，以调整像面的位置，使得梯度变折射率透镜的观测区域内外的像面在同一高度，实现了对于任意深度的成像，提高了成像速度，扩大了视场范围。
6.本发明的第二个目的在于提出一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微方成像法。
7.本发明的第三个目的在于提出一种非临时性计算机可读存储介质。
8.为达到上述目的，本发明第一方面实施例提出了一种基于梯度变折射率透镜的任
意深度多平面显微成像系统，包括：梯度变折射率透镜，用于在显微镜焦面上生成所述梯度变折射率透镜的观测区域内的待成像样本的虚像；物镜视窗，用于固定所述梯度变折射率透镜，并维持成像系统的观测视野的平整；像面校正模块，用于生成所述梯度变折射率透镜的观测区域之外的待成像样本的虚像，并调整所述梯度变折射率透镜观测区域之外的像面位置，以使所述梯度变折射率透镜的观测区域内外的像面在同一高度；显微光学放大模块，用于收集所述显微镜焦面上发出的光学信号并进行光学放大；信息采集模块，用于接收所述显微光学放大模块输出的光学信号并进行成像。
9.本发明实施例的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统，通过在物镜和样本之间加入梯度变折射率透镜，同时利用高折射率介质调整梯度变折射率透镜的观测区域内外的像面高度，使得梯度变折射率透镜内外区域的像面在同一高度，可在显微镜视野中获得不同深度区域同时形成的图像，实现了有效、快速的多平面任意深度的显微成像，具有对样本内大范围不同深度同时成像的能力。
10.另外，根据本发明上述实施例的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统还可以具有以下附加的技术特征：可选的，在本发明的一个实施例中，在所述梯度变折射率透镜的长度大于等于所述待成像样本的组织深度时，所述梯度变折射率透镜和所述像面校正模块将所述梯度变折射率透镜观测区域内外的待成像样本映射到同一虚像面；在所述梯度变折射率透镜的长度小于所述待成像样本的组织深度时，所述梯度变折射率透镜将观测区域内的待成像样本映射到第一虚像面，所述像面校正模块将第一虚像面上的虚像和所述观测区域之外的待成像样本映射到第二虚像面。
11.可选的，在本发明的一个实施例中，所述像面校正模块为高折射率物质，所述像面校正模块包括：bk7玻璃。
12.可选的，在本发明的一个实施例中，所述显微光学放大模块具体用于通过光信号在介质中的折射实现焦面信息的尺寸放大，并将放大后的光信号耦合到所述信息采集模块上。
13.可选的，在本发明的一个实施例中，所述信息采集模块是面阵光强探测器，所述信息采集模块还用于将二维光信号转化为电信号。
14.为达上述目的，本发明第二方面实施例提出一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：在待成像样本的表面安装大视场视窗；将梯度变折射率透镜模块植入所述待成像样本内的预设深度处；将像面校正模块放置到所述大视场视窗上面；调节所述梯度变折射率透镜的轴向位置并进行像面校正，以对所述待成像样本进行成像和观测，包括：通过所述梯度变折射率透镜在显微镜焦面上生成所述梯度变折射率透镜的观测区域内的待成像样本的虚像；通过像面校正模块生成所述梯度变折射率透镜的观测区域之外的待成像样本的虚像，并调整所述梯度变折射率透镜观测区域之外的像面位
置；将显微镜焦面上发出的光学信号耦合到显微镜的信息采集模块上进行成像。
15.可选的，在本发明的一个实施例中，该方法还包括：在所述梯度变折射率透镜的长度大于等于所述预设深度时，控制所述梯度变折射率透镜和所述像面校正模块将所述梯度变折射率透镜观测区域内外的待成像样本映射到同一虚像面；在所述梯度变折射率透镜的长度小于所述待成像样本的组织深度时，控制所述梯度变折射率透镜将观测区域内的待成像样本映射到第一虚像面，并控制所述像面校正模块将第一虚像面上的虚像和所述观测区域之外的待成像样本映射到第二虚像面。
16.可选的，在本发明的一个实施例中，所述像面校正模块为高折射率物质，所述像面校正模块包括：bk7玻璃。
17.可选的，在本发明的一个实施例中，所述信息采集模块是面阵光强探测器，所述将显微镜焦面上发出的光学信号耦合到显微镜的信息采集模块上进行成像包括：通过所述信息采集模块将二维光信号转化为电信号后，根据转换后的所述电信号进行成像。
18.本发明实施例的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法，通过在物镜和样本之间加入梯度变折射率透镜并调节其轴向位置，同时利用高折射率介质调整梯度变折射率透镜的观测区域内外的像面高度，使得梯度变折射率透镜内外区域的像面在同一高度，可在显微镜视野中获得不同深度区域同时形成的图像，实现了有效、快速的多平面任意深度的显微成像，具有对样本内大范围不同深度同时成像的能力。
19.为达上述目的，本发明第三方面实施例提出了一种非临时性计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本技术第二方面实施例所述的一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法。
20.本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
21.本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1为根据本发明一个实施例提供的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统的结构示意图；图2为根据本发明一个实施例提供的一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面宽场显微成像光线原理图；图3为根据本发明一个实施例提供的一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面成像示意图；图4为根据本发明一个实施例提供的另一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面宽场显微成像光线原理图；图5为根据本发明一个实施例提供的另一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面成像示意图；图6为根据本发明一个实施例提供的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法的流程图。
具体实施方式
22.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
23.下面参照附图描述根据本发明实施例提出的外调激光器阵列单片光子集成芯片。
24.图1为根据本发明一个实施例的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统的结构示意图。
25.如图1所示，该基于梯度变折射率透镜的宽场任意深度多平面显微成像系统包括：梯度变折射率透镜10、物镜视窗20、像面校正模块30、显微光学放大模块40和信息采集模块50。上述各模块的连接关系如图1所示。
26.其中，梯度变折射率透镜10，用于在显微镜焦面上生成梯度变折射率透镜10的观测区域内的待成像样本的虚像。
27.其中，梯度变折射率透镜10的观测区域即梯度变折射率透镜10下方的观测窗口可观测到的待成像样本的区域，待成像样本可以是实际应用中需要通过显微镜进行成像观测的具有多层次结构的任意样本，比如，在脑科学的研究中，待成像样本可以是包括大脑皮层和位于皮层下的海马区的脑组织。
28.具体的，在本发明一个实施例中，梯度变折射率透镜10可植入待成像样本内部，将观测到的下方待成像样本的深层组织的光学信号输入至显微镜，移动到显微镜焦面，举例而言，深部脑组织结构（例如海马区）首先通过梯度变折射率透镜10在显微镜的焦面形成一个海马区的虚像，便于后续将海马区的虚像再通过显微镜的光学放大模块在信息采集模块上进行成像。
29.物镜视窗20，用于固定梯度变折射率透镜10，并维持本发明的成像系统的观测视野的平整。
30.具体的，物镜视窗20是保持显微成像系统观测视野的平整，使待成像样本，比如，大脑皮层的荧光透过到显微成像光路，同时起到固定梯度变折射率透镜10的作用像面校正模块30，用于生成梯度变折射率透镜10的观测区域之外的待成像样本的虚像，并调整梯度变折射率透镜观测区域之外的像面位置，以使梯度变折射率透镜10的观测区域内外的像面在同一高度。
31.其中，在发明一个实施例中，像面校正模块30为高折射率物质，比如，像面校正模块30可以是bk7玻璃，像面校正模块30可以将梯度变折射率透镜10的观测区域之外，比如，与梯度变折射率透镜10的观测区域不同平面的表层组织形成虚像，并调整该像面位置与梯度变折射率透镜10的观测区域内的像面统一，即，使梯度变折射率透镜10的观测区域内外的像面在同一高度，作为一种可能的实现方式，可以是将使梯度变折射率透镜10的观测区域内外的待成像样本映射到同一虚像面，该同一虚像面可以是显微镜焦面。
32.显微光学放大模块40，用于收集显微镜焦面上发出的光学信号并进行光学放大。在发明一个实施例中，显微光学放大模块40具体用于通过光信号在介质中的折射实现焦面信息的尺寸放大，并将放大后的光信号耦合到信息采集模块50上信息采集模块50，用于接收显微光学放大模块输出的光学信号并进行成像。
33.具体的，在发明一个实施例中，信息采集模块是面阵光强探测器，比如，它可以是
cmos或ccd等探测器，信息采集模块具体用于将放大后的二维光信号转化为电信号，根据转换后的电信号进行成像。
34.该系统旨在提升传统显微成像光路的性能，使得保持传统显微成像光路的前提下实现不同视场位置不同深度信号的同时观测。其中，梯度变折射率透镜10的观测面、像面校正模块30的像面和显微镜焦面组成显微镜的成像光路，以保证待成像样本深层和浅层组织的观测面都能够成像到显微镜的焦面上，从而不同平面的样本都能清晰成像。
35.需要说明的是，在本发明一个实施例中，像面校正模块30可以不限于固体物质，也可以放置液体和气体物质。并且，像面校正模块20的形状可以不限于立方体，还可以为任意形状，例如，它可以是凸透镜和凹透镜，以实现多平面的同时观测。
36.在本发明一个实施例中，具体实施时，梯度变折射率透镜10的观测窗口的光学信号通过梯度变折射率透镜10和物镜视窗20在显微镜物镜的焦面上形成一个虚像，同时像面校正模块30将梯度变折射率透镜10的观测窗口以外的浅层脑区的信号映射到显微镜物镜的焦面上形成一个虚像，另外，显微镜的宽视场观测区域位于显微镜焦面的光学信号通过宽视场观测窗口，和梯度变折射率透镜观测窗口的虚像一起透过显微光学放大模块40，在信息采集模块50上成像。
37.可以理解的是，在实际应用中，梯度变折射率透镜的长度可能大于或小于待成像样本的组织深度，在本发明一个实施例中，在梯度变折射率透镜的长度大于等于待成像样本的组织深度时，梯度变折射率透镜和像面校正模块将梯度变折射率透镜观测区域内外的待成像样本映射到同一虚像面，在梯度变折射率透镜的长度小于待成像样本的组织深度时，梯度变折射率透镜将观测区域内的待成像样本映射到第一虚像面，像面校正模块将第一虚像面上的虚像和观测区域之外的待成像样本映射到第二虚像面。
38.综上所述，本技术的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统，通过在传统光学显微镜的物镜和样本面之间加入梯度变折射率透镜，实现视野中不同深度区域的同时成像，并且，还在梯度变折射率透镜以外区域加入高折射率物质作为像面校正模块，以调整像面的位置，使得梯度变折射率透镜的观测区域内外的像面在同一高度，实现了对于任意深度的成像，提高了成像速度，扩大了视场范围。
39.为了更加清楚的说明本发明基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统在实际应用时成像原理和各部件的连接关系，下面以两个具体的实施例进行说明。
40.具体实施例1：图2为根据本发明一个实施例提供的一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面宽场显微成像光线原理图，适用于实现海马区和皮层表面同时观测的多平面成像，且梯度变折射率透镜长度大于观测区域组织深度的场景。
41.具体的，如图2所示，深层海马区组织通过梯度变折射率透镜映射到虚像面，同时浅层的组织通过bk7玻璃柱也映射到同一虚像面。如图3所示，脑组织的表层至深层海马区的观测深度为1.5 mm。梯度变折射率透镜直径为0.5mm，长度2mm。盖玻片直径8mm，厚度0.17mm，距离圆心1mm位置处有一个直径0.5mm的孔。像面校正装置采用bk7玻璃柱，厚度为1.5mm，直径6mm，打孔位置记录中心1mm，直径0.8 mm。盖玻片上表面和bk玻璃柱的下表面重合。梯度变折射率透镜的空间位置可以通过机械结构精密调节。显微放大成像采用宽视场高分辨物镜成像系统，放大倍数10x，数值孔径为0.3，视场大小1 cm，分辨率0.8 μm。探测器
采用美国仙童（fairychild）公司的scmos芯片，像素尺寸6.5 μm。
42.具体实施例2：图4为根据本发明一个实施例提供的另一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面宽场显微成像光线原理图，适用于实现海马区和皮层表面同时观测的多平面成像，且梯度变折射率透镜长度小于观测区域组织深度的场景。
43.具体的，如图4所示，深层海马区组织通过梯度变折射率透镜映射到虚像面1继续通过bk7玻璃柱映射到虚像面2。此时虚像面2的位置与皮层位置一致。如图5所示，脑组织的表层至深层海马区观测深度为1.5 mm。梯度变折射率透镜直径为0.5 mm，长度1 mm。套筒内径为0.5 mm，壁厚0.1 mm。梯度变折射率透镜外壁与套筒内壁重合部分粘接后以保证总长度为1.5 mm，之后再与盖玻片下表面粘结。盖玻片直径8 mm，厚度0.17 mm。像面校正装置采用bk7玻璃柱，厚度为1.5 mm，直径0.8 mm，盖玻片上表面和bk玻璃柱的下表面重合。梯度变折射率透镜的空间位置可以通过机械结构精密调节。显微放大成像采用宽视场高分辨物镜成像系统，放大倍数10x，数值孔径为0.3，视场大小1 cm，分辨率0.8 μm。探测器采用美国仙童（fairychild）公司的scmos芯片，像素尺寸6.5 μm。
44.基于上述方面实施例的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统的描述，下面参照附图描述根据本发明另一方面实施例提出的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法。
45.图6为根据本发明一个实施例提供的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法的流程图，如图6所示，该方法包括以下步骤：步骤s1，在待成像样本的表面安装大视场视窗。
46.具体的，以待成像样本为小鼠的脑组织，进行成像观测为示例，在安装视窗前先进行开颅手术，利用颅钻等工具小心移除光学无法穿透的颅骨，并将打孔的盖玻片安装在小鼠大脑上表面。
47.步骤s2，将梯度变折射率透镜模块植入待成像样本内的预设深度处。
48.在本发明一些实施例中，将梯度变折射率透镜模块安装到脑组织内。在具体实施时，首先利用真空吸液器盖玻片上的孔洞出吸出覆盖从在深部脑组织表层的皮层组织，到达指定深度后，停止吸出脑组织。然后将梯度变折射率透镜插入小鼠脑组织中后，通过立体定位仪精确调节梯度变折射率透镜插入的深度。
49.步骤s3，将像面校正模块放置到大视场视窗上面。
50.具体的，将厚度合适的打孔玻璃柱放置在盖玻片上，并保证孔正对梯度变折射率透镜。
51.步骤s4，调节梯度变折射率透镜的轴向位置并进行像面校正，以对待成像样本进行成像和观测，包括：通过梯度变折射率透镜在显微镜焦面上生成梯度变折射率透镜的观测区域内的待成像样本的虚像；通过像面校正模块生成梯度变折射率透镜的观测区域之外的待成像样本的虚像，并调整梯度变折射率透镜观测区域之外的像面位置；将显微镜焦面上发出的光学信号耦合到显微镜的信息采集模块上进行成像。
52.具体实施时，可以通过调节梯度变折射率透镜的轴向位置实现不同平面的对焦，利用基于梯度变折射率透镜的多平面显微成像系统对脑部区域进行观测。
53.在发明一个实施例中，像面校正模块为高折射率物质，像面校正模块包括：bk7玻
璃。
54.在发明一个实施例中，信息采集模块是面阵光强探测器，将显微镜焦面上发出的光学信号耦合到显微镜的信息采集模块上进行成像包括：通过信息采集模块将二维光信号转化为电信号后，根据转换后的所述电信号进行成像。
55.在发明一个实施例中，步骤s4还包括通过微光学放大模块使光信号在介质中的折射实现焦面信息的尺寸放大，并将放大后的光信号耦合到信息采集模块上。
56.需要说明的是，上述对基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像系统的实施例的说明，也适用于此处的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法，实现原理相似，此处不再赘述。
57.本发明实施例的基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法，通过在物镜和样本之间加入梯度变折射率透镜和像面校正模块，创建了一种有效、快速的多平面显微成像方式，能够经济高效地扩展现有显微镜的功能，具有实现对样本内大范围不同深度同时成像的能力。
58.为了实现上述实施例，本发明还提出一种非临时性计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明第二方面实施例所述的一种基于梯度变折射率透镜的任意深度多平面显微成像方法。
59.尽管参考附图详地公开了本技术，但应理解的是，这些描述仅仅是示例性的，并非用来限制本技术的应用。本技术的保护范围由附加权利要求限定，并可包括在不脱离本技术保护范围和精神的情况下针对发明所作的各种变型、改型及等效方案。
60.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
61.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
62.在流程图中表示或在此以其他方式描述的逻辑和/或步骤，例如，可以被认为是用于实现逻辑功能的可执行指令的定序列表，可以具体实现在任何计算机可读介质中，以供指令执行系统、装置或设备（如基于计算机的系统、包括处理器的系统或其他可以从指令执行系统、装置或设备取指令并执行指令的系统）使用，或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用。就本说明书而言，"计算机可读介质"可以是任何可以包含、存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用的装置。计算机可读介质的更具体的示例（非穷尽性列表）包括以下：具有一个或多个布线的电连接部（电子装置），便携式计算机盘盒（磁装置），随机存取存储器（ram），只读存储器（rom），可擦除可编辑只读存储器（eprom或闪速存储器），光纤装置，以及便携式光盘只读存
储器（cdrom）。另外，计算机可读介质甚至可以是可在其上打印所述程序的纸或其他合适的介质，因为可以例如通过对纸或其他介质进行光学扫描，接着进行编辑、解译或必要时以其他合适方式进行处理来以电子方式获得所述程序，然后将其存储在计算机存储器中。
63.应当理解，本发明的各部分可以用硬件、软件、固件或它们的组合来实现。在上述实施方式中，多个步骤或方法可以用存储在存储器中且由合适的指令执行系统执行的软件或固件来实现。如，如果用硬件来实现和在另一实施方式中一样，可用本领域公知的下列技术中的任一项或他们的组合来实现：具有用于对数据信号实现逻辑功能的逻辑门电路的离散逻辑电路，具有合适的组合逻辑门电路的专用集成电路，可编程门阵列（pga），现场可编程门阵列（fpga）等。
64.本技术领域的普通技术人员可以理解实现上述实施例方法携带的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，该程序在执行时，包括方法实施例的步骤之一或其组合。
65.此外，在本发明各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理模块中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个模块中。上述集成的模块既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能模块的形式实现。所述集成的模块如果以软件功能模块的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，也可以存储在一个计算机可读取存储介质中。
66.上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。